水皰性口炎病毒的改性基質(zhì)蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明總體上設(shè)及生物技術(shù)和免疫學(xué)。具體地，本發(fā)明設(shè)及水瘤性口炎病毒(VSV) 的改性基質(zhì)(^0蛋白、表達(dá)該改性M蛋白的減毒的重組體vsv和vsv基初免-加強(qiáng)免疫苗，該初 免-加強(qiáng)免疫苗誘導(dǎo)持久的體液、細(xì)胞介導(dǎo)和粘膜免疫應(yīng)答，對抗攜帶外源基因的重組體 VSV所表達(dá)的外源抗原。
【背景技術(shù)】
[000引水瘤性口炎病毒(VSV)是負(fù)鏈RNA病毒，其感染大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞，且在受感染 的細(xì)胞中表達(dá)高達(dá)全部蛋白質(zhì)的60%的病毒蛋白[Kim, G. N.，and C. Y. Kang. Virology 357:41，2007]。實質(zhì)上，VSV感染豬、牛和馬，并且在口和足周圍引發(fā)水瘤性疾 病。雖然已經(jīng)報導(dǎo)了由VSV引起的人感染，但是VSV在人體內(nèi)沒有引起任何嚴(yán)重的癥狀 [Fields, B. N., and K. Hawkins. N E；ngl J Med 277:989, 1967; Johnson, K. M. et al. Am J Trop Med Hy邑 15:244， 1966]。
[0003] VSV編碼五種蛋白，核衣殼(nucleocapsid)蛋白（N)、憐蛋白（P)、基質(zhì)蛋白（M)、表 面糖蛋白（G)和RNA依賴性RNA聚合酶化）dVSV的N、P和L蛋白是合成正義和負(fù)義基因組RNA和 mRNA所需要的，其對合成VSV蛋白是必要的。
[0004] 通過VSV基質(zhì)(M)蛋白阻斷宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。將水瘤性口炎病 毒印第安納血清型(VSVind)中Μ蛋白在位點51的蛋氨酸殘基變成精氨酸(M51R)，并且將水瘤 性口炎病毒新澤西血清型(VSVnj)M基因中在位點48(Met48)和51(Met51)的蛋氨酸變成精氨 酸(A;rg)，能夠使VSV Μ蛋白的運種功能無效化im, G. and Kang, C, Virology, 357:41- 53, 2007)。盡管在Μ蛋白質(zhì)中有運些Met向Arg突變的VSV已經(jīng)顯著地減少了細(xì)胞病變效應(yīng)， 但是他們依然在細(xì)胞和受感染的動物中復(fù)制并產(chǎn)生子代病毒。VSVind奧爾賽(Orsay)菌株的 一種溫度敏感的（ts)M基因突變體，ts023已經(jīng)在小鼠膠質(zhì)細(xì)胞系在37°C和39°C顯示了有限 的復(fù)制（Rabinowitz, S. et al. Infection and Immunity 33:120-125, 1981)。已經(jīng)證 實，ts023的溫度敏感性是在39°C具有特征性子彈狀結(jié)構(gòu)的病毒裝配啟動不當(dāng)或缺乏的結(jié) 果（Flood, E. et al. Virology 278:520-533, 2000; Lyles, D. et al. Virology, 217:76-87，1996)。此外，即便在直接接種到大腦中后，ts023在小鼠內(nèi)也失去它的神經(jīng)毒 性(Rabinowitz, S, et al. Infection and Immunity, 33:120-125, 1981)。
[000引在VSV奧爾賽菌株的野生型M和ts023的M之間有Ξ個氨基酸差異，運些差異是在第 21個氨基酸的甘氨酸(G)對谷氨酸(EKG2化），在第111個氨基酸的亮氨酸(L)對苯丙氨酸 (巧化111F)，W及在第227個氨基酸的組氨酸(H)對酪氨酸(Y)(H227Y)(Morita，K. et al. J. Virol. 61:256-263，1987)?；貜?fù)突變體(revertant)中在Fill的單一氨基酸回復(fù)突變 成L表明Fill看來像是在ts023的溫度敏感性方面起到了主要作用。然而，其它兩種突變可 能也有一些作用，因為在第111位點由F向L的單一突變沒有完全地使病毒恢復(fù)到其野生型 顯型（Morita, K. et al. J. Virol. 61:256-263，1987; Li, Y. et al. J. Virol. 62:3729-3737, 1988)0
[0006] 考慮到回復(fù)突變體中在Fill的單一氨基酸回復(fù)突變成L，其可能有利于引起既對 回復(fù)突變較不敏感又在ts023的溫度敏感性方面起作用的突變。
[0007] 目前，研究組已經(jīng)開發(fā)出能復(fù)制的、裝配缺陷的VSV作為更安全的疫苗載體，該VSV 缺失了G糖蛋白化)基因（Δ口或缺失了G和Μ基因兩者（AMGXK址η, J. et al. J. Virol. 75:11079-11087，2001; Schwartz, J. et al.，Virology 366:166-73，2007)。然而，已 缺失了G基因，或缺失了Μ和G基因，VSV載體需要G或Μ和G兩者反式蛋白（proteins in 化ans)的供應(yīng)W生產(chǎn)裝配缺陷的VSV。為了降低生產(chǎn)疫苗的成本，有必要生成運樣的系統(tǒng)， 其能夠生產(chǎn)能W高滴度(titer)復(fù)制的病毒疫苗載體。因此，所需要的是運樣的VSV載體系 統(tǒng)，其可W是已經(jīng)失去了它的毒性(無毒性的），并且在31°C仍然能夠在體外復(fù)制到高滴度 的全長VSV載體，在非容許性溫度下不能適當(dāng)?shù)匮b配，誘導(dǎo)良好的對抗其表達(dá)的關(guān)注的基因 的免疫應(yīng)答，并且具有較少機(jī)會回復(fù)到到野生型顯型。
[0008] 本發(fā)明的進(jìn)一步的和其它的目的將由W下的
【發(fā)明內(nèi)容】
、發(fā)明的討論及其實施方案 和實施例實現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明人已經(jīng)生成了新的水瘤性口炎病毒(VSV)的基質(zhì)(M)蛋白突變體，其包括VSV 印第安納血清型(VSVind)和VSV新澤西血清型(VSVnj)。運些具有突變體Μ蛋白的新的VSV基本 上是非胞溶性的的、顯著地減毒的和無毒性的的，包括神經(jīng)毒性(更安全的）。此外，運些新 的具有突變體Μ蛋白的VSV能夠誘導(dǎo)對抗關(guān)注的抗原或抗原決定部位（邱itope)的免疫應(yīng) 答。該免疫應(yīng)答可W是體液、細(xì)胞和粘膜免疫應(yīng)答。此外，具有Μ突變體的VSVind在31°C能夠 裝配且通常地能夠從受感染的細(xì)胞釋放出來，但他們不能在37°C或更高溫度下適當(dāng)?shù)匮b 配，且相對于野生型VSVind，病毒從受感染的細(xì)胞的釋放顯著地減少了。此外，相對于現(xiàn)有技 術(shù)已知的Μ蛋白突變體，本發(fā)明的Μ蛋白突變體對回復(fù)突變可能較不敏感。
[0010] 照此，在一個實施方案中，本申請設(shè)及一種水瘤性口炎病毒(VSV)的改性基質(zhì)(Μ) 蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明的改性Μ蛋白包括選自（i )和（i i )的氨基酸序列：（i )包括 至少W下置換:G21E/L111A/M51R的SEQ ID NO: 3;及（ii)包括至少W下置換:G2沈/M48R/ M51R的沈QID NO: 8。在本發(fā)明的一方面，SEQ ID NO: 8包括至少W下置換:G22E/L110A/ M48R/M51R。
[0011] 在本發(fā)明的一個實施方案中，（i)的改性Μ蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO: 4,且
[11] 的改性Μ蛋白包括氨基酸序列沈Q ID NO: 9或沈Q ID NO: 10。
[0012] 在本發(fā)明的一個實施方案中，（i)中在位點21的E和（ii)中在位點22的E由gaa密碼 子編碼，且其中（i )和（i i )中在位點51的R及（i i )中在位點48的R由cga密碼子編碼。
[0013] 在本發(fā)明的一個實施方案中，SEQ ID NO: 4的在位點111的A和SEQ ID NO: 10的 在位點110的A由gca密碼子編碼。
[0014] 在本發(fā)明的一個實施方案中，（i)的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 2的基因編碼， 且（ii)的氨基酸序列由包含沈Q ID NO: 6或沈Q ID NO: 7的基因編碼。
[0015] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種編碼水瘤性口炎病毒(VSV)的改性的基 質(zhì)00蛋白的核巧酸序列或基因，其中該核巧酸序列或基因包括選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和沈Q ID NO: 7的核巧酸序列。
[0016] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組體VSV(rVSV)。本發(fā)明的rVSV，在一 個實施方案中，包括核巧酸序列或基因，該核巧酸序列或基因包含選自SEQ ID NO: 2、6和7 的核巧酸序列。
[0017] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組體水瘤性口炎病毒(rVSV)。根據(jù)前 面實施方案中的任一個，本發(fā)明的rVSV包括改性基質(zhì)(M)蛋白。
[0018] 在本發(fā)明的一個實施方案中，rVSV是重組體水瘤性口炎病毒印第安納血清型 (rVSVind)，且改性Μ蛋白包括SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包含至少W下置 換:G21E/L111A/M51R。
[0019] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，rVSVind的改性Μ蛋白包括SEQ ID NO: 4的氨基酸 序列。
[0020] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，rVSVind的改性Μ蛋白由包含SEQ ID NO: 2的核巧 酸序列的基因編碼。
[0021] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，rVSVind在容許性溫度下能夠產(chǎn)生VSVind顆粒，且在 非容許性溫度下不能產(chǎn)生該顆粒。
[0022] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，rVSV是重組體水瘤性口炎病毒新澤西血清型 (rVSVNj)，且改性Μ蛋白包括SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少W下置換： G22E/M48R/M51R。在本實施方案的一個方面，SEQ ID NO: 8包括至少W下置換：G22E/ L110A/M48R/M51R。
[002引在一個實施方案中，rVSVNj的改性Μ蛋白由包括SEQ ID NO: 6或沈Q ID NO: 7的核 巧酸序列的基因編碼。在一個實施方案中，rVSVNj的改性Μ蛋白包括氨基酸序列SEQ ID NO: 9或沈Q ID NO: 10。
[0024] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，rVSV是嵌合體rVSV，其表達(dá)外源病原體的蛋白。
[0025] 在本發(fā)明的一個實施方案中，該病原體是病毒性、真菌性、細(xì)菌性或寄生性病原 體。
[0026] 在另一個實施方案中，本發(fā)明的rVSV基本上是非胞溶性的和無毒性的。
[0027] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗。該疫苗，在一個實施方案中，包括有 效量的改性的基質(zhì)誠)蛋白，該改性Μ蛋白由核巧酸序列編碼，該核巧酸序列包含選自下面 的序列：SEQ ID NO: 2、沈Q ID NO: 6和沈Q ID NO: 7。
[0028] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗。該疫苗，在一個實施方案中，包括 有效量的一種或多種減毒的重組體水瘤性口炎病毒(rVSV)，該一種或多種減毒的rVSV包括 改性基質(zhì)誠)蛋白，該改性Μ蛋白包含選自（i)和(ii)的氨基酸序列：（0包括至少W下置換： G21E/L111A/M51R的沈Q ID NO: 3,及（ii)包括至少W下置換：G22E/M48R/M51R的SEQ ID NO: 8。在一方面，SEQ ID NO: 8進(jìn)一步包括置換L110A。
[0029] 在本發(fā)明的疫苗的一個實施方案中，rVSV是重組體水瘤性口炎病毒印第安納血清 型(rVSVind)，且改性Μ蛋白包括沈Q ID NO: 3的氨基酸序列，SEQ ID NO: 3包括至少W下置 換:G21E/L111A/M51R。
[0030] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，rVSV是重組體水瘤性口炎病毒印第安納血 清型(rVSVind)，且改性Μ蛋白包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。
[0031] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，改性Μ蛋白由包含SEQ ID NO: 2的核巧酸 序列的基因編碼。
[0032] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，rVSVind在容許性溫度下能夠產(chǎn)生rVSVind顆 粒，且在非容許性溫度下不能產(chǎn)生該顆粒。
[0033] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，rVSVind是全長rVSVind。
[0034] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，rVSV是重組體水瘤性口炎病毒新澤西血清 型(rVSVNj)，且改性Μ蛋白包含沈Q ID NO: 8的氨基酸序列，SEQ ID NO: 8包括至少W下置 換:G22E/M48R/M51R。在本實施方案的一個方面，SEQ ID NO: 8進(jìn)一步包括置換L110A。
[0035] 在本發(fā)明的疫苗的一個實施方案中，rVSV是重組體水瘤性口炎病毒新澤西血清型 (rVSVNj)，且其中該改性Μ蛋白包含氨基酸序列沈Q ID NO: 9或沈Q ID NO: 10。
[0036] 在本發(fā)明的疫苗的一個實施方案中，改性Μ蛋白由具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7的核巧酸序列的基因編碼。
[0037] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，rVSVNj是全長rVSVNj。
[0038] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，rVSV是嵌合體rVSV，其表達(dá)外源病原體的 蛋白，且其中所述嵌合體rVSV能夠誘導(dǎo)對所述蛋白的免疫應(yīng)答。
[0039] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，疫苗包含減毒的嵌合體rVSV的混合物，其 中該混合物中至少兩種嵌合體rVSV表達(dá)外源病原體的不同蛋白。
[0040] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，病原體是病毒性、真菌性、細(xì)菌性或寄生性 病原體。
[0041] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，病原體是慢病毒。
[0042] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，慢病毒是HIV，且該外源病原體的蛋白是 HIV蛋白。
[0043] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，該病原體是HCV，且該外源病原體的蛋白是 HCV蛋白。
[0044] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，（i)中在位點21的E和在位點22的E由gaa密 碼子編碼，且在位點51的R和在位點48的R由cga密碼子編碼。
[0045] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，在位點111的A和在位點110的A由gca密碼 子編碼。
[0046] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，疫苗能夠誘導(dǎo)體液、細(xì)胞和粘膜免疫應(yīng)答。
[0047] 在本發(fā)明的疫苗的另一個實施方案中，疫苗進(jìn)一步包含佐劑。
[0048] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種初免-加強(qiáng)免組合疫苗（prime boost combination vaccine)。該初免-加強(qiáng)免組合疫苗，根據(jù)一個實施方案，包括：（a)有效量的 包含一種血清型的減毒的重組體水瘤性口炎病毒(rVSV)的疫苗，該種血清型的減毒的rVSV 具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的第一種改性Μ蛋白；及(b)有效量的包含另一種血清 型的rVSV的疫苗，該種血清型的rVSV具有包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的第二種改性Μ蛋白。
[0049] 在初免-加強(qiáng)免組合疫苗的一個實施方案中，SEQ ID NO: 4由包含SEQ ID NO: 2 的基因編碼。
[0050] 在初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，SEQ ID NO: 9由包含SEQ ID NO: 6的基因編碼，且沈Q ID NO: 10由包含沈Q ID NO: 7的基因編碼。
[0051] 在初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，（a)是初免疫苗（priming vaccine)，且（b)是加強(qiáng)免疫苗（booster vaccine)。
[0052] 在初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，（b)是初免疫苗，且(a)是加強(qiáng)免疫 苗。
[0053] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，兩種減毒的rVSV是嵌合 體rVSV，其表達(dá)外源病原體的蛋白，且其中兩種嵌合體rVSV能夠誘導(dǎo)對該蛋白的免疫應(yīng)答。
[0054] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，病原體是病毒性、真菌 性、細(xì)菌性或寄生性病原體。
[0055] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，病原體是慢病毒。
[0056] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，慢病毒是HIV，且蛋白是 HIV蛋白。
[0057] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，一種血清型的rVSV和另 一種血清型的rVSV包括表面糖蛋白化)基因和RNA依賴性RNA聚合酶化)基因，且其中用于表 達(dá)HIV蛋白的基因插入在G基因和L基因之間。
[0058] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，其中HIV基因選自由env、 gag和pol組成的HIV基因組。
[0059] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，病原體是HCV，且抗原決 定部位是HCV蛋白。
[0060] 在本發(fā)明的初-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，一種血清型的rVSV和另一 種血清型的rVSV包括表面糖蛋白（G)基因和RNA依賴性RNA聚合酶化)基因，且用于表達(dá)HCV 蛋白的基因插入在G基因和L基因之間。
[0061] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，HCV蛋白是結(jié)構(gòu)性或非結(jié) 構(gòu)性HCV蛋白。
[0062] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，運兩種疫苗中的每一種 包括減毒的嵌合體rVSV的混合物，且在混合物中至少兩種減毒的嵌合體rVSV具有病原體的 不同蛋白。
[0063] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，兩種疫苗的每一種能夠 誘導(dǎo)體液、細(xì)胞和粘膜免疫應(yīng)答。
[0064] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，疫苗(a)的rVSV的血清型 是印第安納，且疫苗(b)的rVSV的血清型是新澤西。
[0065] 在本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗的另一個實施方案中，疫苗(a)和疫苗(b)的每 一種進(jìn)一步包含佐劑。
[0066] 根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了一種試劑盒。該試劑盒，在一個實施方案中， 包括：（a)至少一劑有效量的疫苗，其包含重組體水瘤性口炎病毒印第安納血清型 (rVSVind)，rVSVind具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的改性Μ蛋白，及(b)至少一劑有效 量的疫苗，其包含重組體水瘤性口炎病毒新澤西血清型（rVSVNj)，rVSVNj具有包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的改性Μ蛋白。
[0067] 在本發(fā)明的試劑盒的一個實施方案中，（a)和(b)是在藥物可接受的載體中配制。 [006引在本發(fā)明的試劑盒的在另一個實施方案中，SEQ ID NO: 4由包含SEQ ID NO: 2的 基因編碼。
[0069] 在本發(fā)明的試劑盒的在另一個實施方案中，SEQ ID NO: 9由包含SEQ ID NO: 6的 基因編碼，且沈Q ID NO: 10由包含沈Q ID NO: 7的基因編碼。
[0070] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的膚，其包含選自列為SEQ ID NO: 4、9和10的氨基酸序列組的氨基酸序列。在一個實施方案中，分離的膚是W純化的形式提 供。
[0071] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的核巧酸序列，其包含選自組SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7的核巧酸序列。在一個實施方案中，分離的核巧酸 序列是W純化的形式提供。
[0072] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的疫苗用于在受試主體(subject)內(nèi)誘 導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0073] 在一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及本發(fā)明的初免-加強(qiáng)免組合疫苗用于在受試主體 內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0074] 在另一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種在受試主體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。該方 法，根據(jù)一個實施方案，包括對受