專利名稱：：從細(xì)胞培養(yǎng)物分離純化的水泡性口炎病毒的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明描述從細(xì)胞培養(yǎng)物分離純化的水泡性口炎病毒的純化方法。
背景技術(shù)：
：水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)，彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的成員，具有非節(jié)段性、負(fù)股、單鏈RNA基因組。其11kb基岡組具有編碼所述病毒的五種結(jié)構(gòu)蛋白的五個(gè)基因核殼體蛋白(N)，其化學(xué)計(jì)量量為殼體化所復(fù)制的RNA所需的；磷蛋ft(P),其為RNA依賴性RNA聚合酶(L)的輔因子；基質(zhì)蛋白(M)和附著糖蛋白(G)(例如參見伽里昂(Gallione)等人，1981病毒學(xué)雜志(J.Virol.),39:529-535;羅斯(Rose)和伽里昂(Gallione)，1981,病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，39:519-528:美國專利第6,033,886號(hào)；美國專利第6，168，943號(hào))。一般來說，不認(rèn)為VSV是人類病原體，且因而，對(duì)VSV的預(yù)存在的免疫性在人類群體中是罕見的。因此，源自VSV的載體的發(fā)展已成為諸如免疫原性組合物(例如疫苗)和傳遞編碼治療性蛋白質(zhì)的基因的領(lǐng)域的關(guān)注焦點(diǎn)。舉例來說，研究已確定VSV可用作用于表達(dá)流感病毒血細(xì)胞凝集素蛋白(羅伯茨(Roberts)等人，1999病毒學(xué)雜志(J.Virol.),73:3723-3732)、麻疹病毒H蛋白(施勒雷特(Schlereth)等人，2000病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，74:4652-4657)和HIV-1env和gag蛋0(羅斯(Rose)等人，2001細(xì)胞(Cell),106(5):539-49)的有效載體。VSV的使其成為有吸引力的載體的其它特征包括(a)能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中有力地復(fù)制；(b)不能整合到宿主細(xì)胞DNA中或經(jīng)受遺傳重組；(c)存在多種血清型，允許用于初始-加強(qiáng)(prime-boost)免疫策略的可能性；(d)可將所關(guān)注的外來基因插入VSV基因組中且通過病毒轉(zhuǎn)錄酶大量地表達(dá)；和(e)發(fā)展從病毒基因組的cDNA拷貝拯救感染性病毒的專門系統(tǒng)(例如參見美國專利第6,033,886號(hào)；美國專利第6,168,943號(hào))。vsv作為載體的免疫原性組合物的產(chǎn)生通常包括用重組體vsv感染合適的細(xì)胞培養(yǎng)物(宿主)，使vsv在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長，在適當(dāng)時(shí)刻收獲細(xì)胞培養(yǎng)液且從所述細(xì)胞培養(yǎng)液純化vsv。vsv載體和其免疫原性組合物在臨床應(yīng)用中的用途將需要適當(dāng)純度的vsv樣品(或劑量)以便遵守全世界各種藥物安全管理機(jī)構(gòu)(例如，食品與藥物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)、歐洲l藥品局(EuropeanMedicinesAgency,5EMEA)、加拿大保健品與食品局(HealthProductsandFoodBranch,HPFB)等)的安全條例。然而，使用目前可用的vsv純化方法(例如通過蔗糖梯度離心來純化)通常難以從細(xì)胞培養(yǎng)物污染物(例如細(xì)胞培養(yǎng)物雜質(zhì)蛋白質(zhì)和DNA)中分離VSV和獲得適當(dāng)純度和產(chǎn)率的VSV。舉例來說，使用目前可用的純化方法，VSV樣品的純度與回收率(產(chǎn)率百分比)之間通常存在反比關(guān)系，從而使得難以制造足夠量的純化的VSV。另外，在當(dāng)今基于生物反應(yīng)器的方法中，細(xì)胞濃度增加和培養(yǎng)時(shí)間較長導(dǎo)致VSV效價(jià)較高，伴以生物反應(yīng)器流體屮的細(xì)胞碎片和有機(jī)組分濃度增加，進(jìn)'步使VSV純化方法復(fù)雜化。從1964年起，蔗糖梯度超速離心已成為病毒純化(包括VSV純化)的標(biāo)準(zhǔn)方法(山田(Yamada)等人，2003生物技術(shù)(BioTechniques),34(5):1074-1078，1080;布朗(Brown)等人，1967免疫學(xué)雜志(J.Immun.)，99(1):171-7;魯賓遜(Robinson)等人，1965國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.),USA,54(1):137-44;西村(Nishimura)等人，1964口本醫(yī)學(xué)科學(xué)與生物學(xué)雜志(Japan.J.Med.Sci.Biol.)，17(6):295-305)。然而，隨著病毒濃度增加，同時(shí)還出現(xiàn)細(xì)胞碎片、宿主DNA和蛋白質(zhì)雜質(zhì)的增加，很難在較高濃度下通過蔗糖梯度超速離心將其移除。另外，蔗糖梯度超速離心按比例擴(kuò)大的成本極高。通過聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)沉淀(麥克沙力(McSharry)等人，1970病毒學(xué)(Virol.),40(3):745-6)濃縮和純化VSV具有高雜質(zhì)含量的類似問題。已通過尺寸排阻色譜法獲得相對(duì)高質(zhì)量的病毒(川斯菲格瑞茲恩(Transfiguracion)等人，2003人類基因療法(HumanGeneTher.)，14(12):1139-1153;威爾卡姆普(Vellekamp)等人，2001人類基因療法(HumanGeneTher.)，12(15):1923-36;拉伯迪(Rabotti)等人，1971ComptesRendusdesSeancesdeI'AcademiedesSciences,D系歹lj:自然科學(xué)(SerieD:SciencesNaturelles),272(2):343-6;嘉克力(Jacoli)等人，1968生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)普通主題(Biochim.Biophys.Acta,GenlSubj,),165(2):99-302)。然而，由于方法成本和操作困難，通常不可用于大規(guī)模病毒生產(chǎn)。親和色譜法，諸如肝素(維爾熱賓茨基(Zolotukhin)等人，1999基因療法(GeneTher.)，6(6):973-985)、外源凝集素(卡爾森艾斯(Kaarsnaes)等人，1983色譜法雜志(J,Chromatog.)，266:643-9;克里斯蒂安森(Kristiansen)等人，1976生液學(xué)報(bào)(Prot.Biol.Fluids),23:663-5)和麥卓斯賽李方(MatrexCellufine)硫酸鹽(唐寧(Downing)等人，1992病毒學(xué)方法雜志(J.Virol.Meth.)，38(2):215-228)已在病毒純化方面有些應(yīng)用。由于可能出現(xiàn)浸析問題，肝素和外源凝集素通常并不是cGMP病毒生產(chǎn)優(yōu)選的(或用于cGMP病毒生產(chǎn))，在產(chǎn)品發(fā)布之前將需要附加測試。由于病毒純化的效率、病毒質(zhì)量和柱再生，使用麥卓斯賽李方硫酸鹽親和力純化病毒是一個(gè)未解決的問題。對(duì)于VSV純化來說，需要極大的親和管柱(例如，每升細(xì)胞培養(yǎng)物0.2L麥卓斯賽李方硫酸鹽樹脂；韋思疫苗公司(WyethVaccine)未公開的結(jié)果)。當(dāng)通過單獨(dú)離子交換色譜法或結(jié)合用于病毒純化的其它類型的傳統(tǒng)色譜技術(shù)純化時(shí)，觀察到低病毒產(chǎn)率(國際專利公開案第WO2006/011580號(hào)；斯倍馳(Specht)等人，2004生物技術(shù)與生物工程學(xué)(Biotech.Bioeng.)，88(4):465-173;山田(Yamada)等人，2003，卜.文所引用；威爾卡姆普(Vellekamp)等人，2001上文所引用；維爾熱賓茨基(Zolotukhin)等人，1999，上文所引用；(國際專利公開案第W01997/06243號(hào)卡爾森艾斯(Kaarsnaes)等人，1983,上文所引用)。__因此，此項(xiàng)技術(shù)中目前正需要可產(chǎn)生適當(dāng)純度和回收率(產(chǎn)率)的VSV的純化方法。
發(fā)明內(nèi)容本文所述的方法和組合物通常涉及病毒學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)和方法發(fā)展領(lǐng)域。更特定來說，描述用于獲得具有改良純度和產(chǎn)率的水泡性口炎病毒(vsv)的新穎純化方法。一方面，從感染vsv的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液純化vsv的方法包含以下步驟(a)初次澄清、(b)二次澄清、(c)陰離子交換膜吸附、(d)切向流動(dòng)過濾和(e)過濾。在一實(shí)施例中，步驟(a)包含通過低速離心使細(xì)胞培養(yǎng)液澄清和回收上清液中的VSV。在一實(shí)施例中，步驟(b)包含通過0.2Hm到0.45pm過濾器過濾所述上清液和回收過濾溶液屮的VSV。在另-'實(shí)施例中，步驟(c)包含將所述VSV過濾的溶液裝載到用第一pH值緩沖鹽溶液平衡的陰離子交換膜吸附劑上，用第二pH值緩沖鹽溶液從所述陰離子交換膜吸附劑洗脫VSV，和回收洗脫VSV的洗脫份。在一實(shí)施例中，步驟(d)包含通過切向流動(dòng)過濾(tangentialflowfiltration,TFF)使用具有介于300kDa與1,000kDa之間的截留分子量的中空纖維膜純化回收的VSV和回收保留物(retentate)中的VSV。在一實(shí)施例中，步驟(e)包含通過0.2pm到0.22pm過濾器過濾VSV保留物和回收過濾溶液中的VSV。在某些實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞是選自人類胚腎(humanembryonickidney,HEK)細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、中同倉鼠卵巢(Chinesehamsterovary，CHO)細(xì)胞、幼倉鼠腎(babyhamsterkidney,BHK)細(xì)胞和非洲綠猴腎(Africangreenmonkeykidney,AGMK)細(xì)胞(又稱為維拉細(xì)胞(verocell))。在某些實(shí)施例中，所述純化方法的低速離心步驟是介于4,400Xg到8,000Xg之間。在一特定實(shí)施例中，低速離心是6，238Xg。在另一實(shí)施例屮，所述0.2至l」0.45pm過濾器是密理博密勒-GV(MilliporeMillex-GV)過濾裝置、密理博密勒-GP(MilliporeMillex-GP)過濾裝置、頗爾梭伯(PallSupor)過濾裝置、賽多利斯賽多朗(SartoriusSartobranTM)過濾裝置或賽多利斯賽多博2(SartoriusSartopore2)過濾裝置。在一特定實(shí)施例中，所述過濾器是0.2pm賽多利斯賽多朗過濾裝置。在其它實(shí)施例中，所述陰離子交換膜吸附劑是賽多利斯賽多結(jié)Q(SartoriusSartobindQ)膜吸附劑或頗爾妙丁Q(PallMustangQ)膜吸附劑。在一特定實(shí)施例中，陰離子交換膜吸附劑是頗爾妙丁Q膜吸附劑。在某些其它實(shí)施例中，步驟(c)的所述第一pH值緩沖鹽溶液中的鹽是NaCl或KC1。在另一實(shí)施例中，所述NaCl或KCl的離子強(qiáng)度是O.lM到0.4M。在一特定實(shí)施例中，所述鹽是NaCl且NaCl的離子強(qiáng)度是0.3M。在另一實(shí)施例中，步驟(c)的所述第二pH值緩沖鹽溶液中的鹽是NaCl或KC1。在一特定實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液中的鹽是NaCl。在一特定實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液中的NaCl的離-了強(qiáng)度是介于0.5M到0.75M之間。在另一特定實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液中的NaCl的離子強(qiáng)度是0.6M。在其它實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液中的NaCl的離子強(qiáng)度是0.75M。在某些其它實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液具有10容器體積/分鐘(capsulevolume/minute;CV/分鐘)到30CV/分鐘的洗脫流動(dòng)速率。在其它實(shí)施例中，洗脫流動(dòng)速率是20CV/分鐘。在某些其它實(shí)施例中，在10CV/分鐘到30CV/分鐘的洗脫流動(dòng)速率下第二pH值緩沖鹽溶液中的NaCl的離子強(qiáng)度從0.001M線性增加到0.75M。在一特定實(shí)施例中，線性洗脫梯度流動(dòng)速率是20CV/分鐘。在其它實(shí)施例中，步驟(c)的第一和第二緩沖液具有介于6.0到8.5之間的pKa。在其它實(shí)施例中，步驟(c)的第一pH值緩沖鹽溶液具有6.5到8.0的pH值。在一特定實(shí)施例中，第一pH值緩沖鹽溶液具有7.5的pH值。在其它實(shí)施例中，步驟(c)的第二pH值緩沖鹽溶液具有6.5到8.0的pH值。在一特定實(shí)施例中，第一.pH值緩沖鹽溶液具有7.5的pH值。在某些其它實(shí)施例中，步驟(c)的第一和第二緩沖液是磷酸鹽緩沖液、N-2-羥基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicacid，HEPES)緩沖液或三(羥基甲基)氨基甲垸(TRIS)。在另一實(shí)施例中，步驟(c)的第一和第二pH值緩沖鹽溶液還包含濃度為1.5%到5%的蔗糖。在一特定實(shí)施例中，蔗糖濃度為2%。在某些其它實(shí)施例中，所述TFF膜具有300kDa截留分子量。在其它實(shí)施例中，TFF膜具有750kDa截留分子量。在其它實(shí)施例中，TFF膜具有至少350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、800kDa、850kDa、900kDa、950kDa或l，OOOkDa截留分子量。在一特定實(shí)施例中，TFF膜是中空纖維膜模塊。在另一實(shí)施例中，TFF包含將從步驟(c)回收的VSV濃縮至少5倍，隨后緩沖液交換至少一次。在乂一實(shí)施例中，TFF包含將從步驟(c)回收的VSV濃縮至少5倍，隨后緩沖液交換至少五次。在一特定實(shí)施例中，用于緩沖液交換的緩沖液是磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液或TRIS緩沖液，其中所述緩沖液具有5mM到15mM的濃度和7.2到7.5的pH值。在另一實(shí)施例中，緩沖液交換緩沖液還包含0.10M到0.20MNaCl和3.5%到4.5%蔗糖。在其它實(shí)施例中，純化方法步驟(a)到(e)是在室溫下執(zhí)行，其中室溫定義為15'C和25'C或介于約15'C到約25'C之間的溫度。在一特定實(shí)施例中，純化方法步驟(a)到(e)是在20'C下執(zhí)行。在又一實(shí)施例中，步驟(a)中細(xì)胞培養(yǎng)液的澄清是通過1.0pm到4.5nm深度過濾模塊進(jìn)行，其中步驟(a)中省略低速離心。在特定實(shí)施例中，所述深度過濾模塊為沃特曼聚蓋HD模塊(WhatmanPolycapHDmodule)、賽多利斯賽多清P模塊或密理博密理組HC模塊(MilliporeMillistak+HCmodule)。另一方面，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物獲得具有改良純度的vsv。在某些實(shí)施例中，純化的VSV至少90.0%不含細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白質(zhì)和核酸污染物。在其它實(shí)施例中，純化的VSV99.07。不含細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白質(zhì)和核酸污染物。在一特定實(shí)施例中，純化的VSV99.8%不含細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白質(zhì)和核酸污染物。在某些其它實(shí)施例中，提供具有改良純度的VSV，根據(jù)本文所述的新穎純化方法將其純化和分離。在某些實(shí)施例中，純化的VSV的特征是下列特征中的一種或多種所選的VSV血清型或血清型的組合；包含至少一個(gè)突變或至少兩個(gè)突變的基因組序列，所述突變減弱VSV的致病性；包含外來多核苷酸序列開放閱讀框架(openreadingframe,ORF)的基因組序列；編碼本說明書的詳細(xì)描述部分中詳細(xì)敘述的各種蛋白質(zhì)(治療性或免疫原性)中的一種或多種的序列。本文所述的組合物和方法的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下詳細(xì)描述、從其優(yōu)選實(shí)施例和從權(quán)利要求書中顯而易見。圖1是展示從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液獲得具有改良純度的VSV的純化方法的流程圖(以黑框概述)。圖2A是展示在妙丁Q膜吸附劑上在洗脫緩沖液(10mM磷酸鈉、l.OMNaCl)中添加2呢蔗糖的情況下純化后通過銀染色分離VSV蛋白質(zhì)的電泳凝膠。條帶1-10是(1)離心前(細(xì)胞培養(yǎng)物)、(2)進(jìn)料、(3)流過和洗滌、(4)5呢緩沖液B(洗脫份1-5)、(5)60呢緩沖液B(洗脫份6-7)、(6)60呢緩沖液B(洗脫份8-10)、(7)60%緩沖液B(洗脫份11-25)、(8)100免緩沖液B(洗脫份26-35)、(9)柱再生和(10)伯樂標(biāo)準(zhǔn)蛋白(Bio-RadPrecisionPlusProtein)標(biāo)準(zhǔn)物。妙丁Q的流動(dòng)速率在線性洗脫梯度下是3.5毫升/分鐘。SDS-PAGE分析使用4-20%Tris-甘氨酸凝膠且蛋白質(zhì)檢測是通過銀染色進(jìn)行。圖2B是展示根據(jù)圖2A的描述、通過西方印跡法分離VSV蛋白質(zhì)的電泳凝膠。西方印跡法檢測使用抗-VSV多株抗體。圖3A是展示在妙丁Q膜吸附劑上在洗脫緩沖液(lOmM磷酸鈉、1.0MNaCl)中不添加蔗糖的情況下純化后通過銀染色和西方印跡法分離VSV蛋白質(zhì)的電泳凝膠。條帶l-9是(l)進(jìn)料、(2)流過和洗滌、(3)5%緩沖液B(洗脫份1-5)、(4)60呢B(洗脫份6-11)、(5)60呢緩沖液B(洗脫份12-25)、(6)100%緩沖液B(洗脫份26-35)、(7)伯樂標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)物、(8)VSV標(biāo)準(zhǔn)物(即，蔗糖梯度純化的VSV)和(9)柱再生混合物。妙丁Q的流動(dòng)速率在步進(jìn)洗脫梯度下是3.5毫升/分鐘(10CV/分鐘)。SDS-PAGE分析使用4-207。Tris-甘氨酸凝膠且蛋白質(zhì)檢測是通過銀染色進(jìn)行。圖3B是展示在如圖3A中所述的純化后通過西方印跡法分離VSV蛋白質(zhì)的電泳凝膠。西方印跡法檢測使用抗-VSV多株抗體。緩沖液B(又稱為"洗脫緩沖液")是10mM磷酸鈉(pH7.0)禾PlMNaCl。圖4A是在圖1中所述的純化方法的各步驟時(shí)通過銀+膠體染色對(duì)VSV的SDS-PAGE分析(4-20y。Tris-甘氨酸凝膠)。條帶1-12是(1)離心前、(2)離心后(1°澄清)、(3)0.2pm過濾前、(4)0.2pm過濾后(2°澄清)、(5)來自妙丁Q膜吸附劑的流過和洗滌混合物、(6)來自妙丁Q膜吸附劑的VSV洗脫份混合物、(7)來自TFFUF/DF的VSV保留物、(8)濃縮和透濾混合物、(9)0.2pm(最終)過濾前、(10)0.2^un(最終)過濾后(VSV純化的整體濃縮物)、(11)伯樂標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)物和(12)VSV對(duì)照組(3號(hào)組，純化的整體濃縮物)。圖4B是根據(jù)圖4A中所述的方法通過西方印跡法對(duì)VSV的SDS-PAGE分析(4-20%Tris-甘氨酸凝膠)。圖5A是通過銀+膠體染色對(duì)根據(jù)圖1中所示的方法所純化的VSV對(duì)比通過蔗糖梯度離心(條帶11)所純化的VSV的SDS-PAGE(4-20%Tris-甘氨酸凝膠)比較。條帶1-12是(1)細(xì)胞培養(yǎng)液、(2)離心后(1°澄清)、(3)0.2pm過濾前、(4)0.2pm過濾后(2。澄清)、(5)來自妙丁Q膜吸附劑的流過和洗滌混合物、(6)來自妙丁Q膜吸附劑的VSV洗脫份、(7)來自TFFUF/DF的VSV保留物、(8)0.2|iim(最終)過濾前、(9)0.2nm(最終)過濾后(VSV純化的整體濃縮物)、(10)伯樂標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)物、(U)通過蔗糖梯度純化的VSV(僅添加條帶9的一半容量)和(12)VSV對(duì)照組(1弓組，純化的整體濃縮物)。圖5B是通過西方印跡法對(duì)根據(jù)圖1中所示的方法所純化的VSV對(duì)比通過如圖5A中所述的蔗糖梯度離心(條帶11)所純化的VSV的SDS-PAGE(4-20%Tris-甘氨酸凝膠)比較。圖6是展示來自四個(gè)按比例擴(kuò)大組(細(xì)胞培養(yǎng)物容量為4.5L)的VSV效價(jià)回收率百分比的條形圖。CR弁1是實(shí)驗(yàn)組1，CR弁2是實(shí)驗(yàn)組2，CR#3是實(shí)驗(yàn)組3且TT01是實(shí)驗(yàn)組4。圖7是展示VSVwN4CT,-gagl構(gòu)筑體的妙丁Q純化步驟中的雜質(zhì)蛋白移除的條形圖。圖8A是展示在pH6.5下在TMAE條件篩選中VSVwN4CT,-gagl回收率的條形圖。圖8B是展示在pH7.0下在TMAE條件篩選屮VSVn;N4CT,-gagl回收率的條形圖。圖8C是展示在pH7.5下在TMAE條件篩選中VSVNjN4CT,-gagl回收率的條形圖。具體實(shí)施例方式因?yàn)樗菪钥谘撞《?vsv)具有許多使其成為用于免疫原性組合物中和/或傳遞編碼如上文所述的治療性蛋白的基因的有吸引力的載體的特征，所以此項(xiàng)技術(shù)中正需要從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生具有改良純度的重組vsv的純化方法。下文所述的組合物和方法解決此需要。如下文實(shí)例3-8中所陳述，描述從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物純化VSV的改良方法(例如參見圖1)和由此純化的VSV。I.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生vsv在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生vsv為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，且通常包括用重組vsv感染所述細(xì)胞培養(yǎng)物(宿主細(xì)胞)，使vsv在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長并且在適當(dāng)時(shí)刻收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。因?yàn)関sv從宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中，所以從細(xì)胞培養(yǎng)液中收集vsv產(chǎn)物。11從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生VSV和由此如本文所述從其中純化VSV的新穎方法利用用于使VSV(非節(jié)段性、負(fù)股、單鏈RNA病毒)增殖(或生長)的合適哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，其為此項(xiàng)技術(shù)所己知。所述細(xì)胞培養(yǎng)物包括(但不限于)人類胚腎(HEK)細(xì)胞(諸如HEK293細(xì)胞)、非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞(諸如維拉細(xì)胞)、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞。另外，細(xì)胞培養(yǎng)材料、方法和技術(shù)為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。舉例來說，在生物反應(yīng)器中以給定病毒感染劑量(multiplicityofinfection)使用重組VSV種子儲(chǔ)備(例如獲救的VSV，參見下文II部分)感染融合的宿主細(xì)胞群體或一定密度的宿主細(xì)胞群體(例如維拉細(xì)胞培養(yǎng)物)，在給定時(shí)間和溫度下使VSV在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長；且在細(xì)胞培養(yǎng)液中收獲新生的VSV子代。如下文所定義，術(shù)語"培養(yǎng)液"、"細(xì)胞培養(yǎng)液"、"細(xì)胞培養(yǎng)基"、"培養(yǎng)基"和/或"生物反應(yīng)器流體"(bioreactorfluid)可互換使用，且指的是細(xì)胞培養(yǎng)物生長于其中的培養(yǎng)基或溶液。II.從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物純化vsv從感染本文所述的vsv的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液純化vsv的新穎方法包含某些純化步驟。圖1中的流程圖概述整個(gè)純化流程，其包括(a)初次澄清、(b)二次澄清、(c)陰離了交換膜吸附、(d)切向流動(dòng)過濾和(e)過濾的步驟。更特定來說，所述步驟包含(a)通過低速離心使細(xì)胞培養(yǎng)液澄清、(b)通過由0.2^m到0.45過濾器過濾進(jìn)一步使上清液澄清、(c)在陰離子交換膜吸附劑上純化VSV過濾的溶液、(d)通過切向流動(dòng)過濾(TFF)進(jìn)行緩沖液交換和濃縮VSV和(e)通過0.2nm到0.22^m過濾器對(duì)VSV保留物進(jìn)行最終過濾。在某些其它實(shí)施例中，以上純化方法步驟(a)到(e)是在室溫下執(zhí)行。如下文所定義，"室溫"是約15'C和25'C或介于約15'C與25'C之間的溫度。因此，舉例來說，用于執(zhí)行步驟(a)到(e)的合適溫度包括至少15。C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、21°C、22°C、23°C、24。C和包括25°C的溫度或介于其之間的部分溫度。在一特定實(shí)施例中，純化方法步驟(a)到(e)是在20'C下執(zhí)行。效汰澄獰在某些實(shí)施例中，通過低速離心(或者，通過深度過濾)使感染VSV的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液澄淸且在上淸液中回收VSV，本文中乂稱為細(xì)胞培養(yǎng)液的"初次(或1°)澄清"。在某些實(shí)施例屮，細(xì)胞培養(yǎng)液的初次澄清是在室溫下進(jìn)行。用于細(xì)胞培養(yǎng)液的初次澄清的離心方法和設(shè)備為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。如下文所定義，"低速"離心是離心速度低于10，000rpm。在某些實(shí)施例中，用于使細(xì)胞培養(yǎng)液澄清的低速離心速度是在4,000Xg(士100Xg)至lj8，000Xg(士100Xg)范圍內(nèi)的離心速度。在某些其它實(shí)施例中，用于使細(xì)胞培養(yǎng)液澄清的低速離心速度是至少4.000xg、4，500xg、5，000xg、5，500xg、6，000xg、6,500xg、7,000xg、7，500xg或8，000xg或介于其之間的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)的離心速度。在'特定實(shí)施例屮，通過低速離心對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液的初次澄清是在6，238xg下在室溫下進(jìn)行三十分鐘(實(shí)例3，表2)。如上文所述，在某些實(shí)施例中，通過深度過濾(即，代替低速離心)使感染VSV的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液澄清(1°)。當(dāng)步驟(a)的初次澄清中省略低速離心時(shí)可使用深度過濾。深度過濾(與表面過濾相反)通常指的是將污染物截獲在其結(jié)構(gòu)內(nèi)的"厚"過濾器。深度過濾材料和方法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。舉例來說，過濾材料通常由厚的且纖維纖維素結(jié)構(gòu)和嵌入纖維開口中的無機(jī)助濾劑(諸如硅藻土粒子)組成。這種過濾材料具有大內(nèi)表面積，這是粒子截獲和過濾能力的關(guān)鍵。所述深度過濾模塊含有直徑尺寸為1.0um和4.5pm或介于1.0pm與4.5之間的小孔，包括至少1.0pm、1.5pm、2.0pm、2.5|im、3.0^m、3.5|tim、4.0|_un禾B4.5|tim的過濾器尺寸，和介于其之間的部分過濾器尺寸。示范性深度過濾模塊包括(但不限于)沃特曼聚蓋模塊(沃特曼公司(WhatmanInc.);新澤西州弗倫翰公園(FlorhamPark,NJ))、賽多利斯賽多清P模塊(賽多利斯公司(SartoriusCorp.);紐約埃奇伍德(Edgewood,NY))和密理博密理組HC模塊(密理博公司(Millipore);馬薩諸塞州比爾里卡(Billerica,MA))。在一特定實(shí)施例中，通過深度過濾(在室溫下執(zhí)行)使細(xì)胞培養(yǎng)液澄清且在濾液中回收VSV(實(shí)例3,表1)。"J二汰澄獰通過離心(或深度過濾)初次澄清后，通過過濾或微濾，通過0.2到0.25過濾器進(jìn)一步使VSV上清液(或?yàn)V液)澄清(2°)且在過濾溶液中回收VSV。在一特定實(shí)施例中，如上文所定義，微濾是在室溫下執(zhí)行。過濾/微濾介質(zhì)可用于各種制造材料和方法中，其為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知。示范性微濾過濾裝置包括(但不限于)密理博密勒GV過濾裝置(密理博公司(Millipore);馬薩諸塞州比爾里卡(Billerica,MA))、密理博密勒-GP過濾裝置、頗爾梭伯過濾裝置(頗爾公司(PallCorp.);紐約東山(EastHills,NY))、賽多利斯賽多朗過濾裝置(賽多利斯公司(SartoriusCorp.);紐約埃奇伍德(Edgewood,NY))和賽多利斯賽多博2過濾裝置。在某些實(shí)施例中，這些過濾裝置具有尺寸介于0.2到0.45|iim之間的過濾器。這些過濾器包括具有至少0.2pm、0.25pm、0.3pm、0.35pm、0.4和0.45和介于其之間的部分孔徑的小孔的過濾器。在一特定實(shí)施例中，所述過濾器是0.2賽多利斯賽多朗，過濾裝置。在過濾溶液中回收過濾的VSV。0麟伎雄級(jí),已通過澄清(即，上文所述的1。和2。)回收VSV產(chǎn)物后，在陰離子交換膜吸附劑上進(jìn)一步純化VSV。膜吸附劑材料為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知且可得自諸如賽多利斯公司(紐約埃奇伍德(Edgewood，NY))、頗爾公司(紐約東山(EastHills，NY))和希格瑪-阿爾德里希公司(Sigma-AldrichCorp.)(密蘇里州圣路易斯(St.Louis,MO))的供應(yīng)商。示范性陰離子交換膜吸附劑包括(但不限于)賽多結(jié)Q膜吸附劑(賽多利斯公司)和妙丁Q膜吸附劑(頗爾公司)。在一特定實(shí)施例中，陰離子交換膜吸附劑是頗爾妙丁Q膜吸附劑。一般來說，自常規(guī)離子交換色譜法已知的方法和緩沖液可直接應(yīng)用于膜吸附劑色譜法，其為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所己知。在某些實(shí)施例中，如上文所定義，陰離子交換膜吸附劑色譜法是在室溫下執(zhí)行。因此，在某些實(shí)施例中，通過陰離了交換膜吸附劑純化VSV，其中將來Q二次澄清的VSV過濾的溶液裝載到用第一pH值緩沖鹽溶液(又稱為"平衡緩沖液"或VSV"結(jié)合緩沖液")平衡的陰離子交換膜吸附劑上。用第二pH值緩沖鹽溶液("洗脫緩沖液")從陰離子交換膜吸附劑洗脫VSV且回收洗脫的VSV洗脫份(例如參見下文實(shí)例6)。在某些實(shí)施例中，所述第一pH值緩沖鹽溶液或平衡緩沖液是NaCl或KC1鹽溶液。所述NaCl或KC1是以介于約至少0.1M到約0.4M之間的離子強(qiáng)度存在于溶液中。因此，所述鹽的離子強(qiáng)度包括至少0.1M、0.2M、0.3M和0.4M,包括介于其之間的部分離子強(qiáng)度。在一特定實(shí)施例中，所述鹽是NaCl且NaCl溶液的離子強(qiáng)度是0.3M。緩沖溶液可為磷酸鹽緩沖液、N-2-羥基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)緩沖液或三(羥基甲基)氨基甲烷(TRIS)緩沖液。在某些實(shí)施例中，這些緩沖液具有介于約6.0到約8.0之間的pH值，即至少6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7,2、7.4、7.6、7,8和8.0的pH值或介于其之間的pH值數(shù)。在一特定實(shí)施例中，第一pH值緩沖鹽溶液具有7.5的pH值。在其它實(shí)施例中，陰離子交換膜吸附步驟的第'緩沖液具有介于6.0到8.5之間的pKa，即至少6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4禾口8.5的pKa或介于其之間的pKa數(shù)。在特定實(shí)施例中，平衡緩沖液還包含約1%蔗糖到約5%蔗糖。在某些實(shí)施例中，平衡緩沖液包含約1%蔗糖。在一特定實(shí)施例中，蔗糖濃度是2%。在另一實(shí)施例中，緩沖液包含約3%蔗糖。在另一實(shí)施例中，緩沖液包含約4%蔗糖。在另一實(shí)施例中，緩沖液包含約5%蔗糖。可用介于以上指定整數(shù)之間的蔗糖濃度的其它百分比。第二pH值緩沖鹽溶液("洗脫緩沖液")也可以包含與第一(平衡)緩沖液相同的緩沖組分。在某些實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液或平衡緩沖液是NaCl或KC1鹽溶液。在一特定實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液中的鹽是NaCl。所述NaCl或KCl是以介于約至少O.lM到約0.4M之間的離子強(qiáng)度存在于溶液中。因此，所述鹽的離子強(qiáng)度包括至少0.1M、0.2M、0.3M和0.4M,包括介于其之間的部分離子強(qiáng)度。在.特定實(shí)施例中，所述鹽是NaCl且NaCl溶液的離子強(qiáng)度是0.3M。緩沖溶液可為磷酸鹽緩沖液、N-2-羥基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)緩沖液或三(羥基甲基)氨基甲垸(TRIS)緩沖液。在某些實(shí)施例中，這些緩沖液具有介于約6.0到約8.0之間的pH值，即至少6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0的pH值或介于其之間的pH值數(shù)。在-"特定實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液具有7.5的pH值。在其它實(shí)施例屮，陰離子交換膜吸附步驟的第二緩沖液具有介于6.0到8.5之間的pKa，即至少6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4和8.5的pKa或介于其之間的pKa數(shù)。在特定實(shí)施例中，洗脫緩沖液還包含約1%蔗糖到約5%蔗糖。在某些實(shí)施例中，洗脫緩沖液包含約1%蔗糖。在一特定實(shí)施例中，蔗糖濃度是2%。在另一實(shí)施例中，緩沖液包含約3%蔗糖。在另.實(shí)施例'l'，緩沖液包含約4%蔗糖。在另實(shí)施例'l'，緩沖液包含約5%蔗糖?？捎媒橛谝陨现付ㄕ麛?shù)之問的蔗糖濃度的其它百分比。為從膜上洗脫VSV，通過線性梯度或單步驟洗脫過程來增加洗脫緩沖液的鹽(NaCl或KC1)濃度(離子強(qiáng)度)(實(shí)例6)。兩個(gè)步驟同樣有效從陰離-了-交換膜吸附劑洗脫VSV。在一特定實(shí)施例中，第一.pH值緩沖鹽溶液中的NaCl的離子強(qiáng)度是介于0.5M到0.75M之間。在另一特定實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液中的NaCl的離子強(qiáng)度是0.6M。在其它實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液中的NaCl的離子強(qiáng)度是0.75M。在某些其它實(shí)施例中，第二pH值緩沖鹽溶液具有10容器體積/分鐘(CV/分鐘)到30CV/分鐘的洗脫流動(dòng)速率。因此，在某些實(shí)施例中，洗脫流動(dòng)速率至少是10、12、14、16、18、20、22、24、26、28到30CV/分鐘，或介于其之間的速率。在一特定實(shí)施例中，洗脫流動(dòng)速率是20CV/分鐘。在某些其它實(shí)施例中，在如上所述10CV/分鐘到30CV/分鐘的洗脫流動(dòng)速率下第二pH值緩沖鹽溶液中的NaCl的離子強(qiáng)度從0.001M線性增加到0.75M。在一特定實(shí)施例中，線性洗脫梯度流動(dòng)速率是20CV/分鐘。"J雄磁動(dòng)雄rrFfV通過陰離子交換膜吸附劑色譜法進(jìn)行VSV純化后，通過切向流動(dòng)過濾(TFF)進(jìn)_-步純化VSV。一般來說，TFF是使用膜來分離液體溶液(或懸浮液)中的組分的壓力驅(qū)動(dòng)過程，其中沿所述膜的表面將流體(進(jìn)料流體)切向抽汲且使用外加壓力迫使流體的一"部分"通過膜到(膜的)濾液側(cè)。在某些實(shí)施例中，TFF是在室溫下執(zhí)行。在這個(gè)過程中，交換緩沖液且濃縮VSV。在一實(shí)施例中，TFF包含將從陰離子交換膜吸附步驟回收的VSV濃縮至少5倍，隨后緩沖液交換至少一次。在另一實(shí)施例中，TFF包含將從陰離子交換膜吸附步驟回收的VSV濃縮至少五倍到十倍，隨后緩沖液交換至少五次或至少六次。其它實(shí)施例在濃縮從陰離子交換膜吸附步驟回收的VSV后包含至少兩次、至少三次、至少四次、至少五次或至少六次緩沖液交換。TFF材料(例如中空纖維、螺巻式、平板)和方法(例如超濾(UF)、透濾(DF)、微濾)為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。在某些實(shí)施例中，TFF膜具有300kDa截留分子量。在某些實(shí)施例'i1，TFF膜具有350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa或700kDa截留分子量。在又一實(shí)施例中，TFF膜具有750kDa截留分子量。在一實(shí)施例中，TFF膜是中空纖維膜模塊。在一特定實(shí)施例中，用于TFF的緩沖液交換的緩沖液是如上文所述的磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液或TRIS緩沖液。然而，在某些實(shí)施例中，緩沖液具有5mM到15mM的濃度，包括至少5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM和15mM的濃度且還包括介于其之間的毫摩爾濃度。在某些實(shí)施例中，緩沖液具有介于約7.2到7.5之間的pH值。因此，在一實(shí)施例中，緩沖液具有7.2、7.3、7.4或7.5的pH值或介于其之間的部分pH值。在另一實(shí)施例中，緩沖液交換緩沖液還包含0.10M到0.20MNaCl和3.5%到4.5%蔗糖。在'特定實(shí)施例屮(參見實(shí)例7)，混合來自陰離子交換膜吸附劑純化的VSV洗脫份，且濃縮混合溶液并通過TFF使用具有750kDa的截留分子量的中空纖維TFF膜濾筒(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)公司(GEHealthcareBio-SciencesCorp.);新澤西州皮斯卡塔市(Piscataway，NJ))交換緩沖液。"J過濾純化中的最后加工步驟是來自TFF的VSV保留物的最終微濾，其中如上文對(duì)于通過微濾進(jìn)行二次澄清所述和下文實(shí)例7中進(jìn)一步所述，通過0.2pm到0.25過濾器過濾所述保留物。舉例來說，所述過濾設(shè)置可利用尺寸0.20pm、0.21pm、0.22pm、0.23pm、0.24pm或0.25pm或介于其之間的部分尺寸的過濾器。根據(jù)本文所述的新穎方法純化VSV在下文實(shí)例中詳細(xì)描述，所述描述包括培養(yǎng)液的初次(實(shí)例3)和二次(實(shí)例4)澄清，分別包含低速離心(或深度過濾)和0.2-0.45liini過濾。澄清步驟后，依序通過陰離子交換膜吸附劑(實(shí)例6)、切向流動(dòng)過濾、超濾和透濾(實(shí)例7)和0.2-0.22iiim過濾(實(shí)例7)來進(jìn)一步純化VSV。還根據(jù)本文所述的新穎方16法純化四個(gè)大量(4.5L)VSV細(xì)胞培養(yǎng)物組(按比例擴(kuò)大組)(實(shí)例8),其中在純化期間移除分別大于99.9%和99.8%的蛋白質(zhì)雜質(zhì)(表11)和DNA(表13)。III.重組水泡性口炎病毒如本文所述，通過利用上文所述的新穎純化方法從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物獲得具有改良純度的VSV。改良純度的意思是純化的VSV至少90.0%不含細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白質(zhì)和核酸污染物。在其它實(shí)施例中，具有改良純度的VSV99.0呢不含細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白質(zhì)和核酸污染物。在一特定實(shí)施例中，具有改良純度的VSV99.8呢不含細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白質(zhì)和核酸污染物。在特定實(shí)施例中，通過上文所述的方法從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液純化的水泡性口炎病毒(VSV)是重組或基因改造VSV。制造重組RNA病毒(諸如VSV)的方法眾所周知且在此項(xiàng)技術(shù)中稱為"拯救"或"反向遺傳學(xué)"方法。用于VSV的示范性拯救方法包括(但不限于)美國專利6,033,886和美國專利6，168，943中所述的方法，每一專利皆以引用的方式并入本文中。用于進(jìn)行病毒(諸如VSV)拯救的其它技術(shù)在美國專利6,673,572禾BWO2004/113517中有描述，所述專利以引用的方式并入本文中。根據(jù)本文所述的新穎純化方法純化和分離的具有改fe純度的VSV可為具有指定血清型的VSV。在某些實(shí)施例中，純化的VSV是印第安納(Indiana)血清型、新澤西(NewJersey)血清型、圣胡安(SanJuan)血清型、伊斯法罕(Isfahan)血清型、格拉斯哥(Glasgow)血清型或金迪普拉(Chandipura)血清型。在某些實(shí)施例中，VSV可含有來自-'種以上所述血清型的序列。根據(jù)本文所述的方法純化的VSV載體(和免疫原性組合物)常常在VSV基因組內(nèi)包含一種或多種減毒突變。在某些實(shí)施例中，純化的VSV具有包含至少一個(gè)減弱VSV的致病性的突變的基因組序列。在其它實(shí)施例中，純化的VSV具有包含至少兩個(gè)減弱VSV的致病性的突變的基因組序列。舉例來說，減毒VSV包含兩個(gè)或兩個(gè)以上已知減毒突變，諸如國際專利申請(qǐng)案第PCT/US2005/011499號(hào)(國際專利公開案第號(hào)WO2005/098009)中所陳述的減毒突變，所述專利以引用的方式并入本文中。舉例來說，已知VSV減毒突變包括(但不限于)基因改組突變(包括形成VSV基因組的VSV基因的基因改組且稱為N、P、M、G和L)、G蛋白插入性突變、G蛋白截?cái)嗤蛔?、熱敏?ts)突變(和其它點(diǎn)突變)、非細(xì)胞病變M基丙突變、G-莖(G-stem)突變、雙義RNA突變和基因缺失突變，其中每一者在國際公開案第WO2005/098009號(hào)中有詳細(xì)陳述。因此，在某些實(shí)施例中，純化的VSV包含一種或多種減毒突變，其包括(但不限于)熱敏性(ts)突變、點(diǎn)突變、基因改組突變、G-莖突變、非細(xì)胞病變M基因突變、雙義RNA突變、截?cái)郍基因突變、G基因插入突變和基因缺失突變。在某些實(shí)施例中，通過本文所述的純化方法純化的VSV具有包含一種或多種外來或異源(或外來)多核苷酸序列(諸如外來RNA開放閱讀框架(ORF))的基閑組序列。所述異源多核苷酸序列可按需要改變，且包括(但不限于)編碼細(xì)胞因子(諸如介白素)的基因、編碼T輔助表位的基因、編碼CTL表位的基因、編碼佐劑的基因和編碼輔因子的基因、編碼限制性標(biāo)記的基因、編碼治療性蛋白質(zhì)或不同微生物病原體(例如病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌)的蛋白質(zhì)(特別是能夠激發(fā)所需免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì))的基因。舉例來說，編碼不同微生物病原體的蛋白質(zhì)的異源多核苷酸序列可為下列基岡屮的種或多種HIV基因、HTLV基因、SIV基因、RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)基因、水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-Zostervirus)基因、腮腺炎病毒基因、麻疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰質(zhì)炎病毒基因、鼻病毒基因、A型肝炎病毒基因、B型肝炎病毒基因、C型肝炎病毒基因、諾沃克病毒(Norwalkvirus)基岡、外衣病毒基閑、a病毒基岡、風(fēng)疹病毒基岡、狂犬病病毒基岡、馬爾堡病毒(Marburgvirus)基因、埃博拉病毒(Ebolavirus)基因、乳頭瘤病毒基因、多形瘤病毒基因、偏肺病毒基因、冠狀病毒基因、霍亂弧菌(W^/oc/u/erae)基因、肺炎鏈球菌(5Yre辯coccws戸e匪謹(jǐn)'ae)基因、化膿性鏈球菌(Sfr，ococc"51pyogenes)基因、幽門螺桿菌(//e/!'co&fl"erp;y/or!')基因、無乳鏈球菌(版一coc面agfl/ac""e)基因、腦月莫炎？K球菌(yVe/^e〃'amem'rtg"!W")基因、許木病奈瑟菌(yVe!'Me〃'ago"OAr/ieae)基丙、白喉?xiàng)U菌(Cory"eZ7ac"〃'aA'p/U/ien'w)基因、破傷風(fēng)梭菌(C/c^m^Kmfeam')基因、百日咳桿菌(SoWe"〃apemiM")基因、嗜血桿菌(//aemop/j!7w)基因、衣原體(C/i/amyWa)基因和大腸桿菌(^c/ienWn'aco"')基因。在某些實(shí)施例中，純化的VSV包含HIV基因序列，其中所述HIV序列是選自由gag、e"v、poZ、vz/、"e/、tof、v/r、wv或vp"組成的群組。在一特定實(shí)施例中，HIV基因?yàn)間ag或e肌。在某些其它實(shí)施例中，純化的VSV含有至少一個(gè)減毒突變和至少一個(gè)如上文所述的異源ORF。舉例來說，根據(jù)新穎方法純化和下文V部分(實(shí)例2-8)中所示范的VSV免疫原性組合物(即，VSVINN4CT9-gagl)是包含兩個(gè)減毒突變和一個(gè)編碼HIV-1gag蛋白質(zhì)的ORF的重組VSV。在其它實(shí)施例中，根據(jù)本文所述的新穎方法純化的VSV編碼HIVgag基丙，其屮所述gag基因插入VSV基因組中的位置一(3'-gagl-NPMGL-5')、位置二(3言匿N-gag2-PMGL-5')、位置三(3'-NP-gag3-MGL-5')、位置四O'-NPM-gag4-GL-5')、位置五(3'-NPMG-gag5-L-5')或位置六(3'-NPMGL-gag6-5')處。在其它實(shí)施例中，根據(jù)本文所述的新穎方法純化的VSV編碼HIVe"v基因，其中所述e肌基因插入VSV基因組中的位置一(3'-env廣NPMGL-5')、位置二(3'-N-env2-PMGL-5')、位置三(3'-NP-env3-MGL-5')、位置四(3'-NPM-env4-GL-5')、位置五(3'-NPMG-env5-L-5')或位置六(3'-NPMGL-env6-5')處。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將從以上描述了解到各種重組VSV可根據(jù)上文所述的方法和方法來設(shè)計(jì)和純化。IV.免疫原性和醫(yī)藥組合物在某些實(shí)施例屮，所述免疫原性組合物包含免疫原性劑量的根據(jù)本文所述的純化方法純化的基因改造vsv。舉例來說，在某些實(shí)施例中，免疫原性組合物包含根據(jù)本文所述的純化方法純化的重組VSV，其中所述VSV包含一種或多種外來RNA序列插入復(fù)制不需要之VSV基因組區(qū)域中或置換所述區(qū)域。卜.文III部分中所述的重組VSV的實(shí)施例中的任一個(gè)可用于這些免疫原性組合物中。因此，在某些實(shí)施例中，調(diào)配純化的VSV免疫原性組合物以向哺乳動(dòng)物個(gè)體(例如人類)投藥。所述組合物通常包含純化的VSV載體和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。如下文所使用，措辭"醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑"意欲包括任何和所有與醫(yī)藥學(xué)投藥相容的溶劑、分散介質(zhì)、涂/S、抗齒劑和抗真齒劑、等張劑和吸收延遲劑等等。所述介質(zhì)和藥劑用于醫(yī)藥活性物質(zhì)的用途為此項(xiàng)技術(shù)所熟知。除非任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與vsv載體不相容，否則將所述介質(zhì)用于本文所述的免疫原性組合物中。補(bǔ)充活性化合物也可以并入組合物中。因此，將本文所述的vsv免疫原性組合物調(diào)配成與其所欲投藥途徑相容。投藥途徑的實(shí)例包括非經(jīng)腸(例如，靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi))和粘膜(例如，口服、直腸、鼻內(nèi)、頰、陰道、呼吸)。用于非經(jīng)腸、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液包括下列組分無菌稀釋劑，諸如注射用水、生理食鹽水溶液、不揮發(fā)性油類、聚乙一醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，諸如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩沖液，諸如乙酸鹽、擰檬酸鹽或磷酸鹽；和用于調(diào)節(jié)張力的藥劑，諸如氯化鈉或右旋糖。用諸如鹽酸或氫氧化鈉的酸或堿調(diào)節(jié)pH值。非經(jīng)腸制劑可封裝于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。適合于可注射用途的醫(yī)藥組合物包括無菌水性溶液(當(dāng)水可溶時(shí))或分散液和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)投藥來說，合適的載劑包括生理食鹽水、抑菌水、克莫弗EL(CremophorEL巴斯夫公司(BASF),新澤西州帕瑟伯尼(Parsippany，NJ))。在所有情況下，所述組合物必須是無菌的且應(yīng)為達(dá)到存在容19易注射性的程度的流體。其在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的且必須防止微生物(諸如細(xì)菌和真菌)的污染作用。所述載劑為含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，丙二醇、丙二醇和液體聚乙二醇等等)的溶劑或分散介質(zhì)和其合適的混合物。例如通過使用諸如卵磷脂之涂層，通過在分散液的情況下維持所需粒徑和通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)流動(dòng)性。通過例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸等等的各種抗菌劑和抗真菌劑來達(dá)成防止微生物的作用。在多數(shù)情況下，組合物中優(yōu)選包括等張劑，例如糖類、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化鈉。通過組合物中包括延遲吸收的藥劑(例如甲-硬脂酸鋁和明膠)促使可注射組合物的延長吸收。通過將所需量(或劑量)的VSV載體并入按要求具有一種上文所列舉的成分或成分組合的適當(dāng)溶劑中、隨后過濾滅菌來制備無菌可注射溶液。通常，通過將活件化合物并入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上文所列舉的那些中的所需其它成分的無菌媒劑中來制備分散液。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選制備方法為真空干燥和冷凍干燥，產(chǎn)生活性成分的粉末加上任何其它來自其預(yù)先無菌過濾的溶液屮的所需成分。對(duì)于通過吸入投藥來說，以氣溶膠噴霧的形式從含有合適推進(jìn)劑(例如，諸如二氧化碳的氣體，或霧化器)的壓力容器或分配器傳遞化合物。全身性投藥也可通過粘膜或透皮方式進(jìn)行。對(duì)于粘膜或透皮投藥來說，將適合于待滲透的障壁的滲透劑用于調(diào)配物中。所述滲透劑通常為此項(xiàng)技術(shù)中所已知，且對(duì)于粘膜投藥來說，包括(例如)清潔劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍牛物。通過使用鼻用噴霧器或栓劑來完成粘膜投藥。對(duì)于直腸傳遞來說，也以栓劑(例如，具有常規(guī)栓劑基質(zhì)，諸如可可脂和其它甘油酯)或保留灌腸劑的形式制備化合物。在某些實(shí)施例中，有利的是以劑量單位形式調(diào)配口服或非經(jīng)腸組合物以便于劑量的投藥和均-"性。如下文所使用，劑量單位形式指的是適合作為用于待治療個(gè)體的單劑量的物理離散單位；各單位含有預(yù)定量的活性化合物，其計(jì)劃聯(lián)合所需醫(yī)藥載劑產(chǎn)生所需治療性效應(yīng)。本文所述的劑量單位形式的規(guī)格是由活性化合物的獨(dú)特特征和待達(dá)成的特定治療性效應(yīng)以及化合所述活性化合物以用于個(gè)體治療的技術(shù)中固有的局限性決定且直接取決于所述條件。V.實(shí)例下列實(shí)例是使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知且為常規(guī)的，除了另外詳細(xì)描述之處。下列實(shí)例是提供用于說明性目的，且不應(yīng)以任何方式解釋為限制本文所述的組合物和方法的范圍。實(shí)例1和2涉及所示范的所有三種VSV構(gòu)筑體。實(shí)例3-9具體涉及構(gòu)筑體VSVINN4CT9-gagl。實(shí)例10-11具體涉及構(gòu)筑體VSV1NN4CT,-gagl。實(shí)例12具體涉及構(gòu)筑體VSVNjN4CT,-gagl。下列實(shí)例中純化的重組VSV(印第安納血清型；rVSV1N)包含VSV基肉組的第位置處的HIVgag基因(gagl)，和改組到VSV基因組的第四位置處的N基因(N4)。在一種構(gòu)筑體中，VSV具有有截?cái)喟|(zhì)尾("CT9")的G基因，其中這種構(gòu)筑體稱為"VSV^N4CT9-gagl"。在另一種構(gòu)筑體中，VSV具有有截?cái)喟|(zhì)尾("CT,")的G基因，其中這種構(gòu)筑體稱為"VSVwN4CTVgagl"。在其它實(shí)例中，下列實(shí)例中純化的重組VSV(新澤西血清型；rVSVNj)包含VSV基岡組的第-位置處的HlVg。g基丙(gagl)，改組到VSV基因組的第四位置處的N基因(N4)，和具有截?cái)喟|(zhì)尾("CT,")的G基因，其中這種構(gòu)筑體稱為"VSVNjN4CTVgagl"。這些構(gòu)筑體和突變?cè)谝砸玫姆绞讲⑷氡疚闹械膰H專利公開案第WO2005/098009號(hào)中有詳細(xì)定義。然而，本文所述的新穎純化方法決不限于特定rVSV構(gòu)筑體或血清型(例如，印第安納、新澤西等)，且因而，這些純化方法包括純化包含野生型基因組序列、減毒基因組序列、"外來"核酸序列或其任何組合的VSV構(gòu)筑體(例如參見用于綜述所述VSV構(gòu)筑體的上文ni部分)。此外，制造"重組"RNA病毒的方法眾所周知且在此項(xiàng)技術(shù)中稱為"拯救"或"反向遺傳學(xué)"方法。用于重組VSV的示范性拯救方法在卜.文III部分中有描述。下列實(shí)例描述從維拉細(xì)胞純化rVSV(如用VSV1NN4CTVgagl、VSVINN4CT,-gagl或VSVwN4CT,-gagl構(gòu)筑體作示范)。然而，本文所陳述的VSV純化方法同樣適從伃何合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物純化VSV,所述細(xì)胞培養(yǎng)物包括(但不限于)人類胚腎(HEK)細(xì)胞(例如HEK293細(xì)胞)、中同倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞。實(shí)例l:蛋白質(zhì)、DNA和VSV效能測定利用下列測定評(píng)估下文實(shí)例2-12中所述的純化方法。總蛋白質(zhì)濃度。使用二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)測定(伯樂公司(Bio-RadLaboratoriesInc.);加利福尼亞州赫庫里斯(Hercules,CA))以牛血清A蛋閂(bovineserumalbumin,BSA)作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物來測定總蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE和西方印跡法分析。對(duì)于蛋白質(zhì)分離和檢測來說，將VSV樣品與Tri-甘氨酸樣品緩沖液以1:1(對(duì)于VSVINN4CTVgagl構(gòu)筑體來說)或3:1(對(duì)于VSVINN4CTVgagl構(gòu)筑體來說)比率混合，在IO(TC下沸騰十分鐘，并且通過4-20%Tris-甘氨酸十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)解析，隨后用銀染(美國和光公口j(WakoChemicalsUSA，Inc.):弗吉尼亞州里士滿(Richmond,VA))和膠態(tài)克瑪西(Coomassie)藍(lán)染(英杰公司(InvitrogenCorp.);加利福尼亞州卡爾斯巴德(Carlsbad,CA))進(jìn)行雙重染色。雙重染色的敏感性使得可能容易檢測VSV樣品中的高分子量雜質(zhì)。凝膠電泳后，將蛋白質(zhì)用電泳方法轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜(安瑪西亞生物科學(xué)公司(AmershamBiosciencesCorp.);新澤西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))上。在含有3%BSA的Tri-緩沖生理食鹽水(Tri-bufferedsaline,TBS)中阻斷一小時(shí)后，將所述膜培養(yǎng)于抗體溶液(于具有0.05%吐溫-20(Tween-20)的TBS(TTBS)中的1%BSA，其含有從BHK細(xì)胞產(chǎn)生的兔子抗-VSV多株抗體，1:1000v/v)屮，且用與辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP，1:1000(v/v))結(jié)合的山羊抗-兔子抗體(伯樂公司(Bio-RadLaboratoriesInc.);加利福尼亞州赫庫里斯(Hercules,CA))作為探針。用TTBS禾UTBS洗滌后，添加HRP顯色劑(伯樂公司(Bio-RadLaboratoriesInc.);加利福尼亞州赫庫里斯(Hercules,CA))以用于檢測，且用蒸餾水中止反應(yīng)。通過安萊影像(Alphalmager)成像系統(tǒng)(安萊公司(AlphaInnotechCorp.);加利福尼亞州舊金山(SanLeandro，CA))用AlphaEaseFC⑧軟件捕捉染色的凝膠和顯影的膜。尺寸排阻髙效液相色譜法(Size-ExclusionHighPerformanceLiquidChromatography,SE-HPLC)。發(fā)展尺寸排阻-HPLC方案以用于使VSV與雜質(zhì)蛋白質(zhì)快速分離，從而允許VSV純化方法的定性分析。因此，將"加工中"VSV樣品(100pL)和純化的整體濃縮物VSV(100pL)裝載到分析型尺寸排阻管柱(TSK-GelPW管柱G6000PWXL，粒徑17p，孔徑1000人)(藤昌生物科學(xué)公司(ToshoBiosciencesLLC.);賓夕法尼亞州蒙格馬利(Montgomeryville，PA))上，用PBS緩沖液(無Ca2+或Mg2+)平衡且在每分鐘1mL的流動(dòng)速率下進(jìn)行。用受化學(xué)站(ChemStation)軟件控制的安捷倫1100(Agilent1100)溶劑傳遞系統(tǒng)(安捷倫科技公司(AgilentTechnologiesInc.);加利福尼亞州帕洛阿爾托(PaloAlto，CA))給所述系統(tǒng)提供動(dòng)力。通過光電二極管測定檢測器收集紫外(UV)光譜且通過監(jiān)測215nm下的UV吸收來獲得色譜圖。VSV效能測定。通過兩種不同方法，傳統(tǒng)空斑測定和免疫熒光'卒:斑測定來量化VSV效能。對(duì)于傳統(tǒng)空斑測定來說，將DMEM+10%FBS中的維拉細(xì)胞以1乂106個(gè)細(xì)胞/孔的濃度(2mL細(xì)胞培養(yǎng)物/L)接種于6孔培養(yǎng)盤上且在37'C下培養(yǎng)隔夜。第二天檢査細(xì)胞以確保形成融合牟.層細(xì)胞。將未知效價(jià)的病毒樣品以及陽性和陰性對(duì)照組在DMEM+10ml/L丙酮酸鈉+0.5ml/L慶大霉素(Gentamicin)中以1:10連續(xù)稀釋到預(yù)期效價(jià)范圍。陽性對(duì)照組足已知效價(jià)的VSV標(biāo)準(zhǔn)物。陰性對(duì)照組(或'+:A)僅含有培養(yǎng)基。從6孔培養(yǎng)盤中吸出細(xì)胞培養(yǎng)基，接著將稀釋的病毒(0.5ml病毒溶液/孔)添加到所述孔中，重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次。使病毒在室溫下吸附十五分鐘，接著在32'C下培養(yǎng)三十分鐘。每五到十分鐘用手搖動(dòng)所述培養(yǎng)盤以保持細(xì)胞單層濕潤。將瓊脂糖(5CTC)和DMEM(37°C，10ml/L丙酮酸鈉和0.5ml/L慶大霉素)以1:4比率組合以形成瓊脂覆層培養(yǎng)基。從培芥盤中吸出病毒，且使用中繼器吸管每孔添加3ml覆層。將經(jīng)覆蓋的培養(yǎng)盤在室溫下在通風(fēng)櫥下冷卻，接著轉(zhuǎn)移到32'C培養(yǎng)72小時(shí)或直到+:斑明顯可見(直徑約1mm或更人)。通過將培養(yǎng)盤舉高到光源處來對(duì)空斑計(jì)數(shù)。使用所得空斑計(jì)數(shù)測定各樣品的效價(jià)且用每毫升空斑形成單位(plaqueformingunits,PFU)表示。通過用VSV感染維拉細(xì)胞爭層(在48孔培養(yǎng)盤中)來執(zhí)行第二種測定(免疫熒光空斑測定)。24到36小時(shí)后，將維拉細(xì)胞同定且先用抵抗VSVw或VSVNj(取決于所用的構(gòu)筑體)的單株抗體作為探針，且接著用結(jié)合于熒光染料的二次抗體作為探針。使用熒光顯微術(shù)量化感染性粒子以檢測維拉細(xì)胞單層中的熒光焦點(diǎn)。計(jì)算熒光焦點(diǎn)且將樣品的效價(jià)表示為每毫升感染單位(infectiousunit,IU)或空斑形成單位(PFU)。殘余DNA測定。測試宿主細(xì)胞DNA且使用皮可林定量-IT(PicoGreenQuant-iT)DNA微測定試劑盒(英杰公司(InvitrogenCorp.):加利福尼業(yè)州卡爾斯巴德(Carlsbad,CA))量化。所述微測定足根據(jù)制造商的說明書使用XDNA作為標(biāo)準(zhǔn)物來執(zhí)行。實(shí)例2:在維拉細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生VSV在IO升生物反應(yīng)器中使用維拉細(xì)胞(非洲猴腎細(xì)胞)微載體培養(yǎng)物產(chǎn)生VSV實(shí)驗(yàn)組。所用的維拉細(xì)胞是從cGMP主細(xì)胞庫(MasterCellBank)獲得。使維拉細(xì)胞以7.5公克干珠粒/升的密度在(賽托蹲TM)CytodeXI微載體(安瑪西亞生物科學(xué)公司(AmershamBiosciencesCorp.);新澤西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))上生長。生物反應(yīng)器培養(yǎng)物的工作體積為5.5到6.5升。對(duì)于接種來說，將維拉細(xì)胞與(賽托蹲'fM)CytodexTMi微載體以約2升的總體積組合。培養(yǎng)物的目標(biāo)接種密度為5><105細(xì)胞/毫升。在這縮小的體積下執(zhí)行2小時(shí)間歇攪拌循環(huán)以促進(jìn)細(xì)胞附著于微載體上。將培養(yǎng)物在40rpm下攪拌5分鐘，接著使其在0rpm下靜置20分鐘，歷時(shí)四個(gè)完整循環(huán)。在間歇攪拌后對(duì)培養(yǎng)物取樣，且如果附著是令人滿意的，那么將病毒產(chǎn)生無血清培養(yǎng)基(VirusProductionSerum-FreeMedium,VP-SFM)添加到培養(yǎng)物中，直到5.5升或6.5升工作體積。使細(xì)胞在37。C和40rpm下生長到2-4乂106個(gè)細(xì)胞/毫升。以50立方厘米/分鐘不斷地給覆層供應(yīng)空氣。按需要以50立方厘米/分鐘給覆層供應(yīng)二氧化碳和氧氣。2培養(yǎng)物的需氧量超過覆層所提供的需氧量時(shí)，通過燒結(jié)噴霧器以6立力—厘米/分鐘的初始速率將氧氣添加到培養(yǎng)物中。當(dāng)需氧量增加時(shí)手動(dòng)增加所述速率。使用二氧化碳(酸性)和7.5%重量/體積碳酸氫鈉溶液(堿性)來控制pH值，使用pH7.30的培養(yǎng)物設(shè)定值。從經(jīng)過約48小時(shí)培養(yǎng)時(shí)間開始，培養(yǎng)物每天經(jīng)受用一半培養(yǎng)物體積的新鮮培養(yǎng)基灌注。在32'C禾B0.01的病毒感染劑量(MOI)下進(jìn)行用rVSV感染維拉細(xì)胞。為促進(jìn)病毒吸附于細(xì)胞上，在將病毒添加到生物反應(yīng)器培養(yǎng)物屮后立即執(zhí)行-小吋間歇攪拌循環(huán)。將培養(yǎng)物在40rpm下攪拌六分鐘，接著使其在Orpm下靜置二十四分鐘，歷時(shí)兩個(gè)完整循環(huán)。一小時(shí)間歇投拌后，在40rpm下以分批模式進(jìn)行感染的剩余部分。毎6-16小時(shí)對(duì)受感染的培養(yǎng)物取樣以觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，且收集病毒上清液樣品以用于生長動(dòng)力學(xué)測定。對(duì)于VSVINN4CT9-gagl來說在感染后約44小時(shí)時(shí)，對(duì)于VSVINN4CT,-gagl來說在感染后約48小時(shí)時(shí)，且對(duì)于VSVwN4CT,-gagl來說在感染后約60小時(shí)時(shí)，通過使微載體靜置且收集培養(yǎng)液上清液來收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。對(duì)于后一構(gòu)筑體來說，將來自兩個(gè)生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)液組合。實(shí)例3:VSV純化方法VSVINN4CT9-gagl的VSV細(xì)胞培養(yǎng)液的初次澄清從生物反應(yīng)器收獲細(xì)胞培養(yǎng)物后，在稱為"產(chǎn)物回收"的過程中移除細(xì)胞/細(xì)胞碎片和其它微粒雜質(zhì)。因?yàn)閂SV是從維拉細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，所以在澄清的培養(yǎng)液中回收VSV。因此，通過深度過濾或低速離心使VSV細(xì)胞培養(yǎng)液上清液(例如，來自10L生物反應(yīng)器組的約4.0-4,5L)澄清。通過深度過濾澄清是在室溫下執(zhí)行且在濾液中回收VSV。測試下列深度過濾模塊沃特曼聚蓋HD模塊(沃特曼公司)；新澤西州弗倫翰公園(FlorhamPark，NJ))、賽多利斯賽多清P模塊(賽多利斯公司(SartoriusCorp.);紐約埃奇伍德(Edgewood，NY))、密理博密理組HC模塊(密理博公司(Millipore);馬薩諸塞州比爾里卡(Billerica，MA))和CUNO05/60HP(坤諾公司(CUNOInc)，3M公司，康涅狄格州梅里登(Meriden,CT))。給深度過濾器裝載濾液直到過濾器飽和(約100-500ml濾液)。通過濁度計(jì)測定深度過濾模塊的澄清效率，而通過病毒空斑測定來評(píng)估病毒回收率。下表1總結(jié)不同深度過濾器的性能?？墒褂梦痔芈凵wHD75達(dá)成高病毒回收率。然而，在大規(guī)模生產(chǎn)中，觀察到低濁度去除效率和低過濾能力。來自不同供應(yīng)商的其它過濾器可基于其病毒產(chǎn)物回收率的評(píng)估來選擇用于澄清過稈。表l.不同深度過濾器的細(xì)胞培養(yǎng)物澄清性能<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>77.0%濁度1=濾液或上清液濁度NTU實(shí)例4:VSV純化方法VSV細(xì)胞培養(yǎng)液的二次澄清上文實(shí)例3中所述的初次澄清后，將上清液(或?yàn)V液)進(jìn)一步加工(二次澄清)以降低濁度水平。評(píng)估若干種無菌微濾過濾器(0.2prn到0.25pm)(表3)，其包括密理博密勒-GV過濾裝置(密理博公司馬薩諸塞州比爾里卡)、密理博密勒-GP過濾裝置、頗爾梭伯過濾裝置(頗爾公司紐約東山)、賽多利斯賽多朗過濾裝置(賽多利斯公司；紐約埃奇伍德)和賽多利斯賽多博2過濾裝置。最優(yōu)過濾器應(yīng)具有有限(或無)VSV結(jié)合能力，仍移除盡可能多的微粒污染。使用來自預(yù)接種產(chǎn)生的VSV作為所選微濾過濾器的進(jìn)料(起始物質(zhì))，所述進(jìn)料攙有1X磷酸谷氨酸蔗糖(sucrosephosphateglutamate，SPG)。按照供應(yīng)商提供的方案過濾相同進(jìn)料。因?yàn)槌吻宓募?xì)胞培養(yǎng)物質(zhì)的量是有限的，所以使用注射器或盤式過濾器代替大型過濾器。如表3中所示，用頗爾梭伯和賽多利斯賽多朗M無菌過濾器達(dá)成最高VSV效價(jià)回收率。表3.二次澄清-過濾器篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>回收率*:將1XSPG溶液添加到進(jìn)料溶液中。SPG是磷酸谷氨酸蔗糖。使用賽多利斯賽多朗過濾裝置進(jìn)一步評(píng)估VSV的二次澄清，其結(jié)果總結(jié)于下表4中。表4.使用賽多利斯賽多朗過濾器的二次澄清<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>上清液濁度1=NTU0.62*:低濾液濁度由低進(jìn)料濁度引起NA=不適用；SPG是磷酸谷氨酸蔗糖表4中的數(shù)據(jù)顯示在可接受的回收率程度下進(jìn)一步降低實(shí)驗(yàn)2和實(shí)驗(yàn)3的溶液濁度。在這些實(shí)驗(yàn)中還確定，將1XSPG添加到進(jìn)料溶液中(即，實(shí)驗(yàn)2:85.9%效價(jià)回收率和實(shí)驗(yàn)3:110%效價(jià)回收率)相對(duì)于未添加SPG的實(shí)驗(yàn)1(65.8%效價(jià)回收率)顯著改善VSV產(chǎn)物回收的產(chǎn)率。實(shí)例5:VSV純化方法柱色譜法實(shí)例4中所述的二次澄清步驟后，使用若干種色譜樹脂測試/篩選VSV濾液的純化。因?yàn)閂SV粒子的尺寸相對(duì)于污染物蛋白質(zhì)較大，所以僅評(píng)估具有大孔徑的樹脂，其包括優(yōu)諾史飛(UNOsphereTM)Q陰離子交換樹脂(伯樂公司(Bio-RadLaboratoriesInc.))、優(yōu)諾史飛S陽離子交換樹脂(伯樂公司)、CHT陶瓷羥磷灰石I型樹脂(伯樂公司)、CFT陶瓷氟磷灰石I型樹脂(伯樂公司)和CSTI混合型樹脂(通用電氣醫(yī)療公司(GEHealthcare))。為作比較，也評(píng)估兩個(gè)親和樹脂，麥卓斯賽李方硫酸鹽樹脂(密理博(Millipore))和肝素瓊脂糖凝膠樹脂(通用電氣醫(yī)療公司(GEHealthcare))。所述實(shí)驗(yàn)是在室溫下以分批方式執(zhí)行。收集來自不同洗滌和洗脫條件的樣品且通過SDS-PAGE和空斑測定來測定。在用優(yōu)諾史飛Q陰離子交換和優(yōu)諾史飛S陽離子交換樹脂的初始實(shí)驗(yàn)中觀察到，VSV僅在中性pH值下與優(yōu)諾史飛Q陰離子交換樹脂結(jié)合，表示VSV在中性pH值卜帶負(fù)電。在伯樂優(yōu)諾史飛O陰離子交換樹脂上評(píng)估VSV純化。將澄清的VSV裝載到填滿優(yōu)諾史飛Q樹脂的管柱上。在管柱上在VSV產(chǎn)物與雜質(zhì)蛋白質(zhì)之問不存在可區(qū)別的分離，并且大部分病毒仍然與管柱結(jié)合，甚至在用于10mM磷酸鈉緩沖液中的2MNaCl洗脫后也如此(數(shù)據(jù)未展示)。在伯樂陶瓷羥磷灰石I型(CHTI)樹脂上評(píng)估VSV純化VSV有效吸附于羥磷灰石管柱上。通過SDS-PAGE觀察到VSV與污染物蛋白質(zhì)的-'些分離(數(shù)據(jù)未展示)，但大部分VSV仍結(jié)合于管柱上，甚至在用0.8M磷酸鈉(pH6.88)洗脫后也如此，其中結(jié)合的VSV最后在1MNaOH清洗步驟期間從管柱上洗脫下來。在另一實(shí)驗(yàn)中，使用0.9M磷酸鉀緩沖液作為洗脫緩沖液。達(dá)成VSV與雜質(zhì)蛋白質(zhì)之間的少量分離(數(shù)據(jù)未展示)。大部分VSV仍與管柱結(jié)合并且需要1.0MNaOH來從管柱上洗脫下來。用陶瓷氟磷灰石(CFT)I型樹脂和CSTI樹脂觀察到類似結(jié)果(即，弱VSV/污染物蛋白質(zhì)分離和強(qiáng)VSV與樹脂的結(jié)合)。在麥卓斯賽李方硫酸鹽親和樹脂上評(píng)估VSV純化。將澄清的VSV進(jìn)料溶液以3毫升/分鐘的流動(dòng)速率裝載到預(yù)平衡(1.47mM磷酸鉀、8.06niM磷酸鈉、140mMNaCl，pH7.0)的賽李方硫酸鹽管柱(容器體積(CV)=2ml)上。用10CV的平衡緩沖液洗滌所述管柱，所述緩沖液是磷酸鹽緩沖生理食鹽水(1.47mM磷酸鉀、8.06mM磷酸鈉、140mMNaCl，pH7.0)。將流過物和洗滌物混合。接著用30CV線性梯度到10mM磷酸鈉、1.5MNaCl(pH7.0)洗脫吸附的材料。SDS-PAGE分析顯示在洗脫期間雜質(zhì)蛋白質(zhì)與病毒之間的分離并不有效且在所有管柱洗脫份中觀察到VSV(數(shù)據(jù)未展示)。大量VSV還殘留在管柱上?？俈SV產(chǎn)物回收率(即，來自所有收集的洗脫份；F3-F25)僅為45.2%(表5)。ffl肝素瓊脂糖凝膠樹脂觀察到類似結(jié)果(即，低VSV回收率)。表5.在麥卓斯賽李方硫酸鹽管柱上的VSV純化<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>FT&W=流過和洗滌混合物F3-F25是洗脫份3-25。實(shí)例6:VSV純化方法陰離子交換膜吸附劑如上文實(shí)例5中所述，當(dāng)用優(yōu)諾史飛Q樹脂、優(yōu)諾史飛S樹脂、CHTI樹脂、CFTI樹脂、CSTI樹脂、賽李方樹脂或肝素瓊脂糖凝膠樹脂純化來自二次澄清步驟(即，0.2pm賽多朗過濾器)的濾液時(shí)，VSV回收率相對(duì)低。因此，使用兩種陰離子交換膜吸附劑進(jìn)一步評(píng)佔(zhàn)來自實(shí)例4的VSV濾液的純化；賽多結(jié)Q膜吸附劑(賽多利斯公司；紐約埃奇伍德)和妙丁Q膜吸附劑(頗爾公司)；紐約東山)。在賽多結(jié)O膜吸附劑上的VSV純化用于膜吸附劑純化的VSV進(jìn)料(起始物質(zhì))是來自切向流動(dòng)過濾(TFF)分離(使用具有750kDa的截留分子量的TFF膜)的保留物。接著將來自TFF分離的VSV保留物(其包含VSV和雜質(zhì)/污染物蛋白質(zhì)和DNA)儲(chǔ)存在4'C或-70'C下。用儲(chǔ)存在4'C下的VSV保留物執(zhí)行初始賽多結(jié)Q膜吸附劑研究，其中使用20mMHEPES(pH7.1)作為平衡緩沖液且保留物吸附于賽多結(jié)Q膜吸附劑(2.1ml膜體積)上。用20mMHEPES(pH7.1)禾卩1.0MNaCl的洗脫緩沖液有效洗脫雜質(zhì)蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)未展示)。然而，在任一洗脫份中未回收到VSV效價(jià)。將緩沖液從HEPES改為磷酸鈉緩沖液，但觀察到類似結(jié)果(即，所收集的洗脫份中無VSV效價(jià))，甚至在磷酸鹽洗脫緩沖液中的高(1.5M)NaCl濃度下也如此。相反，當(dāng)使用儲(chǔ)存在-70'C下的VSV保留物作為起始物質(zhì)且吸附于賽多結(jié)Q膜吸附劑(用20mMHEPESpH7.1平衡)上時(shí)，在洗脫份中觀察到VSV(洗脫緩沖液為20mMHEPES和l.OMNaCl),其中根據(jù)BCA結(jié)果在流過和洗滌混合物中觀察到74.2%的蛋白質(zhì)雜質(zhì)(數(shù)據(jù)未展示)。對(duì)于總蛋白質(zhì)的質(zhì)量平衡分析在下表6中展示。對(duì)于-70'CVSV起始物質(zhì)使用線性洗脫梯度到30%緩沖液B，在色譜圖中觀察到兩個(gè)主峰(數(shù)據(jù)未展示)。緩沖液A(平衡緩沖液)為10mM磷酸鈉(pH7.0)和0.3MNaCl。緩沖液B(洗脫緩沖液)為10mM磷酸鈉(pH7.0)、2.0MNaCl和10mM蔗糖，其中30%B約為0.81MNaCl。第一峰為具有相對(duì)高純度的VSV(洗脫份4-10)。第.一.峰為宿主DNA污染物(洗脫份11-20)。皮可林測定結(jié)果(數(shù)據(jù)未展示)指出，用賽多結(jié)Q膜吸附劑移除97.3%的殘余宿主DNA。因此，這些數(shù)據(jù)指出賽多結(jié)Q膜吸附劑提供從VSV產(chǎn)物移除宿主DNA污染物的有效方法。然而，來自VSV效價(jià)測定的結(jié)果(數(shù)據(jù)未展示)指出來自賽多結(jié)Q純化方法的VSV回收率以病毒效價(jià)計(jì)小于30%。使用妙丁Q膜吸附劑在相同起始物質(zhì)情況下觀察到較高VSV回收率。表6:對(duì)于賽多結(jié)Q膜吸附劑的總蛋白質(zhì)質(zhì)量平衡<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>FT&W=流過和洗滌混合物F3-F40為洗脫份3-40在妙丁O膜吸附劑上的VSV純化也以VSV純化方式研究妙丁Q膜吸附劑。優(yōu)化用于妙丁Q吸附劑的操作條件且在下文描述。蔗糖改善從妙丁Q膜洗脫的VSV的回收產(chǎn)率。當(dāng)優(yōu)化用于妙丁Q的條件時(shí)的初始觀察結(jié)果是色譜緩沖液中包括蔗糖的重要性。舉例來說，用調(diào)配有蔗糖(圖2A和2B)和無蔗糖(圖3A和3B)的緩沖液執(zhí)行并行純化實(shí)驗(yàn)。使用下列色譜緩沖液緩沖液A(平衡緩沖液)是10mM磷酸鈉(pH7.0)和300mMNaCl。緩沖液B(洗脫緩沖液)是10mM磷酸鈉(pH7.0)、1MNaCl、有和無(即，+/-2%蔗糖)。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)(即，+/-2%蔗糖)中，獲得高純度VSV產(chǎn)物?？瞻邷y定(數(shù)據(jù)未展示)指出當(dāng)緩沖液中包括蔗糖時(shí)，VSV回收率顯著較高(32.8%對(duì)比19.0%)。緩沖液pH值和VSV與妙丁Q膜的結(jié)合。評(píng)估三種不同緩沖液pH值范圍(pH6.5、7.0和7.5)以確定用于VSV與妙丁Q膜結(jié)合的最優(yōu)緩沖液pH值。在這些實(shí)驗(yàn)中，澄清后將改良新鮮細(xì)胞培養(yǎng)物裝載到用lOmM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)、10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)或10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)(各緩沖液還包含300mMNaCl和2%蔗糖)平衡的妙丁Q膜上。通過步驟洗脫(洗脫緩沖液10mM磷酸鈉(pH6.5、7.0或7.5)、720mMNaCl和2%蔗糖)以每分鐘3.5ml(10CV/min)的流動(dòng)速率從膜洗脫VSV。從妙丁Q洗脫的VSV的純度(通過SDS-PAGE和西方印跡法測定；數(shù)據(jù)未展示)對(duì)于所測試的緩沖液pH值的每一者是同等的。然而，在pH6.5下，在色譜過程期問大量VSV分散于流過、洗滌和洗脫步驟中，且因而，在這pH值下在洗脫混合物中觀察到較低VSV效價(jià)回收率(參見表7)。表7.不同結(jié)合pH值條件下的VSV方法回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>離子強(qiáng)度和VSV與妙丁Q膜的結(jié)合。在VSV吸附于妙丁Q膜吋測試10mM磷酸鈉結(jié)合(平衡)緩沖液中的兩種不同NaCl濃度(0.15MNaCl和0.3MNaCl)。在0.3MNaCl下觀察到VSV與雜質(zhì)蛋白質(zhì)之間的較好分離。舉例來說，^磷酸鈉結(jié)合緩沖液中使用0.3MNaCl時(shí)，在流過混合物中移除高分子量污染物，其中VSV仍與膜結(jié)合(數(shù)據(jù)未展示)。離子強(qiáng)度和VSV從妙丁Q膜的洗脫。通過線性梯度洗脫測定洗脫緩沖液(緩沖液B)離子強(qiáng)度(即，洗脫緩沖液中的NaCl濃度)，其中洗脫緩沖液(緩沖液B)的濃度在30CV下以3.5毫升/分鐘的流動(dòng)速率從0%增加到60%。平衡緩沖液(緩沖液A)是10mM磷酸鈉pH7.1、300mMNaCl且洗脫緩沖液(緩沖液B)￡10mM磷酸鈉pH值7.1、2MNaCl、10mM蔗糖。從色譜圖(數(shù)據(jù)未展示)可看出，需要0.6M的NaCl濃度來從妙丁Q膜吸附劑洗脫73.39bVSV。線性梯度洗脫對(duì)比單步驟洗脫。從線性梯度洗脫(上文所述)和"單步驟"洗脫策略(數(shù)據(jù)未展示)獲得高質(zhì)量VSV產(chǎn)物。單步驟洗脫過程包含平衡緩沖液(緩沖液A;例如，lOmM磷酸鈉(pH7.1)、300mMNaCl)和洗脫緩沖液(緩沖液B;例如，10mM磷酸鈉(pH7.1)、2MNaCl、10mM蔗糖)。與線性梯度洗脫相反，單步驟洗脫過程通過即刻添加特定最終鹽濃度的緩沖液B(例如，即刻添加最終NaCl濃度為0.6M的緩沖液B)來從膜吸附劑洗脫VSV。單步驟洗脫過程移除大于99%的雜質(zhì)蛋白質(zhì)(BCA測定；數(shù)據(jù)未展示)，其中在洗脫份中回收70-95%的VSV(+:斑測定；數(shù)據(jù)未展不)。因此，木文將使用單步驟洗脫過程，因?yàn)槭褂眠@種簡單單步驟洗脫策略獲得高VSV效價(jià)。操作流動(dòng)速率。研究兩種不同流動(dòng)速率，即，10容器體積(CV)/分鐘和20CV/分鐘。在任一流動(dòng)速率下在純化方法性能方面未觀察到變化。本卓酶(Benzonase)處理。本卓酶核酸酶是遺傳工程化核酸內(nèi)切酶。其降解所有形式的DNA和RNA(單鏈、雙鏈、線性和圓形)，而不具有蛋白質(zhì)分解活性。其在各種條件下有效，具有高比活性。因此，本卓酶核酸酶對(duì)于從重組產(chǎn)物移除核酸是理想的，能夠符合關(guān)于核酸污染的FDA準(zhǔn)則。本文觀察到，本卓酶核酸酶顯著降低VSV純化方法中的DNA含量和最終VSV純化的整體濃縮物。然而，在于妙丁Q膜吸附劑上純化之前添加本卓酶核酸酶導(dǎo)致病毒效價(jià)降低(數(shù)據(jù)未展示)。相反，膜色譜純化步驟后的本卓酶核酸酶處理不具有相同效應(yīng)(即，未觀察到效價(jià)降低)。然而，肉為本文所述的完整VSV純化方法(例如參見圖1)移除大于99%的細(xì)胞培養(yǎng)物污染物，所以在無本卓酶核酸酶處理的情況下最終VSV純化的整體濃縮物中的DNA含量低于規(guī)格(例如，WHO規(guī)格<10毫微克/劑量)。因此，本卓酶核酸酶處理不必用于VSV純化方法中，所述方法與傳統(tǒng)病毒產(chǎn)物/病毒疫苗純化方法(其所需本卓酶核酸酶處理)相比是顯著改良。妙丁Q結(jié)合能力。通過VSV突破使用小體積(0.35ml體積)妙丁Q膜吸附劑(即，妙丁Q幣狀物)測定妙丁Q膜吸附劑的結(jié)合能力。當(dāng)裝載和純化妙丁Q幣狀物上的改良細(xì)胞培養(yǎng)液時(shí)，最初觀察到由于UV吸收雜質(zhì)的流過而不能通過UV吸收來測量VSV突破。因此，在本實(shí)例中，收集VSV流過洗脫份且通過SDS-PAGE和VSV效價(jià)測定來檢測VSV。妙丁Q平衡緩沖液是10mMHEPESpH7.5、0.3mMNaCl和2%蔗糖。令人驚訝的是，未達(dá)到常規(guī)色譜1%突破(參見下表8)，甚至在將400ml細(xì)胞培養(yǎng)液裝載到妙丁Q幣狀物上后(VSV培養(yǎng)液效價(jià)為6.9X106/ml)后也如此。然而，如表8中所示，當(dāng)給妙丁Q幣狀物裝載400ml培養(yǎng)液樣品時(shí)，觀察到流過物中的較高VSV效價(jià)。另外，當(dāng)裝載體積達(dá)到400ml時(shí)，幣狀物中的分壓增加到1.8巴(Bar)。因此，從這個(gè)實(shí)驗(yàn)可推斷，每0.35ml妙丁Q膜吸附劑350ml改良培養(yǎng)液為過濾器裝載能力，其相當(dāng)于500ml細(xì)胞培養(yǎng)物/ml膜吸附劑?；蛘?，妙丁Q結(jié)合能力也可描述為6.9x109pfu/ml膜。在三個(gè)稠度組中，實(shí)際裝載能力(以病毒效價(jià)計(jì))略微高于這個(gè)結(jié)合能力，其并不影響方法性能。因此，這個(gè)數(shù)據(jù)指出所測定的結(jié)合能力是保守性能力數(shù)，且因而，可容易用于人規(guī)模制造生產(chǎn)。表8.妙丁Q裝載能力研究裝載體積1(ml)流過物中的VSV效價(jià)2(pfu/ml)0-200(FT1)ND*200-300(FT2)6.80X103300-350(FT3)8.80X103350-400(FT4)1.30X104ND*=未測定裝載體積'是以培養(yǎng)物體積計(jì)VSV效價(jià)2:VSV進(jìn)料效價(jià)是6.9E+06/mL妙丁Q過濾膜體積是0.35mlFT1-FT4分別是流過物1-4妙丁Q膜吸附劑結(jié)論。用妙丁Q膜吸附劑達(dá)成具有"冋收率的"質(zhì)量VSV產(chǎn)物。與"傳統(tǒng)"色譜過程相比，妙丁Q純化方法(除了是簡單和冇效方法)具有若干優(yōu)點(diǎn)。舉例來說，所述方法產(chǎn)生具有比通過庶糖梯度超速離心純化高的質(zhì)量的VSV產(chǎn)物(例如參見圖5A和5B)。此外，(a)妙丁Q膜吸附劑的高結(jié)合能力意味著較小方法設(shè)備和較低生產(chǎn)成本、(b)相對(duì)于所測試的其它色譜樹脂較高的流動(dòng)速率導(dǎo)致生產(chǎn)量和生產(chǎn)率增加和(c)一次性妙丁Q膜吸附劑裝置消除清洗驗(yàn)證和使用期限驗(yàn)證的必要性。下文總結(jié)所發(fā)展和上文所述的妙丁Q操作條件(3)裝載能力=每毫升妙丁Q膜吸附劑0.5L細(xì)胞培養(yǎng)物、(b)流動(dòng)速率=每分鐘20容器體積(CV)、(c)VSV結(jié)合pH值二pH7.5土0.1pH值單位、(d)VSV結(jié)合離子強(qiáng)度=0.3土0.2M鹽；(e)VSV洗脫=以15CV的步進(jìn)梯度和(f)VSV洗脫離子強(qiáng)度二0.7M鹽。實(shí)例7:VSV純化方法切向流動(dòng)過濾、拋光、緩沖液交換VSV濃度和緩沖液交換是使用切向流動(dòng)過濾(TFF)超濾/透濾(UF/DF)系統(tǒng)執(zhí)行。來自妙丁Q膜吸附劑的VSV洗脫混合物是在具有高(0.7MNaCl)鹽濃度的10mMHEPES緩沖液中且仍然具有微量雜質(zhì)。因此，UF/DF步驟是移除殘余雜質(zhì)所必需的且在適當(dāng)產(chǎn)物調(diào)配物緩沖液中產(chǎn)生最終VSV產(chǎn)物。將來自五個(gè)妙丁Q實(shí)驗(yàn)組的洗脫混合物組合且用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)。利用截留分子量為750kDa的16cm2屮空TFF膜濾筒(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)公司(GEHealthcareBio-SciencesCorp.);新澤西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))。先將混合溶液濃縮到10ml。在磷酸鹽緩沖生理食鹽水(lOmM磷酸鉀緩沖液(PBS)(pH7.1)和138mMNaCl)中執(zhí)行五次(5次)緩沖液交換。對(duì)加工中樣品的SDS-PAGE分析指出純化的VSV僅存在于保留物和沖洗物中，且通過銀染色或西方印跡法分析未檢測到滲透物中的VSV損失(數(shù)據(jù)未展示)。SDS-PAGE數(shù)據(jù)證明VSV方法回收率是可接受的且在每次緩沖液交換后逐漸移除雜質(zhì)(數(shù)據(jù)未展示)。為完全移除殘余雜質(zhì)，需要總共五到六次緩沖液交換。UF/DF操作條件優(yōu)化。研究緩沖液組合物對(duì)TFFUF/DF性能的影響。使用相同妙—J_Q洗脫混合物作為所有實(shí)驗(yàn)的進(jìn)料(表9)。最初二個(gè)實(shí)驗(yàn)是在16cr^中空纖維TFF膜(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)公司(GEHealthcareBio-SciencesCorp.))上執(zhí)行，而最后-一組是用420cm2TFF膜(通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)公司(GEHealthcareBio-SciencesCorp))完成。對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)來說，產(chǎn)物質(zhì)量類似(根據(jù)SDS-PAGE分析和SE-HPLC)。表9.TFF緩沖液組合物實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>與所用的緩沖液無關(guān)，在透濾滲透物中未觀察到VSV產(chǎn)物(根據(jù)SDS-PAGE/銀染色；數(shù)據(jù)未展示)。然而，總蛋白質(zhì)和DNA測定指出在最初三透濾體積中移除裝載的約34-41%總蛋白質(zhì)和裝載的33-40%DNA。關(guān)于緩沖液交換，五透濾體積(diafiltrationvolume,DV)足以使?jié)B透傳導(dǎo)性降低到令人滿意的程度。因此，下列TFFUF/DF操作條件發(fā)展如下(a)TFF膜濾筒中空纖維TFF濾筒(750kDa)，(b)TFF膜容量95L細(xì)胞培養(yǎng)物/平方米，(c)操作壓力pl=3-4psig;p2=l-2psig;TMP=1.5-2.5psig，(d)操作溫度室溫，(e)交叉流動(dòng)速率700LMH，(f)滲透流量>30LMH，禾口(g)5次濃縮和6次透濾到PBS+4呢蔗糖(lOmM磷酸鉀、138mMNaCl，pH7.2)中；其中pl是入口壓力，p2是出口壓力，TMP是跨膜壓力和LMH是升/平方米小時(shí)。實(shí)例8:VSV純化方法最終過濾VSV純化方法中的最后一步是上文所述的TFF純化物質(zhì)的最終過濾。使用0.2(0.45/0.2pm)賽多利斯賽多朗TM過濾裝置(賽多利斯公司(賽多利斯Corp.);紐約埃奇伍德(Edgewood，NY))以每分鐘100ml的流動(dòng)速率移除可能的生物負(fù)荷而使VSV產(chǎn)物損失最小。緩沖液是lOmM磷酸鉀(pH7.1-7.3)、138mMNaCl和7.5%蔗糖。實(shí)例9:VSVINN4CTVgagl構(gòu)筑體的VSV按比例擴(kuò)大純化執(zhí)行四個(gè)4.5L按比例擴(kuò)大組(即，細(xì)胞培養(yǎng)物體積)。這些按比例擴(kuò)大組的概要在下文表10和表11以及圖6中展示。執(zhí)行包括SDS-PAGE(數(shù)據(jù)未展不)、總蛋白質(zhì)(表11)、病毒效價(jià)(表10和圖6)和SE-HPLC(數(shù)據(jù)未展示)的測定。使用圖1中所示的方法，在按比例擴(kuò)大組的每一者中達(dá)成一致方法性能(即，VSV產(chǎn)物質(zhì)量)和雜質(zhì)移除。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>ND=未測定vsv按比例擴(kuò)大純化方法的分析發(fā)展本文所述的新穎VSV純化方法(例如參見圖1)的目標(biāo)是產(chǎn)生高純度vsv以及高回收率的純化的VSV產(chǎn)物。以下分析根據(jù)四個(gè)4.5L細(xì)胞培養(yǎng)物按比例擴(kuò)大組來描述VSV純化和穩(wěn)定性。SDS-PAGE分析和雜質(zhì)蛋白質(zhì)移除。純化方法的重要方面是從VSV產(chǎn)物消除(或移除)細(xì)胞培養(yǎng)物雜質(zhì)蛋白質(zhì)。如上文實(shí)例1中所陳述，本文所示范的rVSV^構(gòu)筑體是rVSVINN4CT9-gagl構(gòu)筑體。VSV產(chǎn)物是通過檢測其主要病毒蛋白M(27kDa)、N/P(49kDa)、G(55kDa)和L(250kDa)來監(jiān)測。在所述VSV蛋白質(zhì)中，M和N/P蛋白質(zhì)的表達(dá)量比G(CT9)和L蛋白質(zhì)高，其中L蛋白質(zhì)含量最低。因此，觀察到M和N/P蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠分析屮的條帶相對(duì)于G和L蛋白質(zhì)密度更高。在所有實(shí)驗(yàn)中，將相同樣品體積裝入凝膠中(除非另有說明)。此外，利用銀/克瑪兩藍(lán)雙重染色代替諸如銀染或克瑪西染色的單一蛋白質(zhì)檢測方法，從而提供更靈敏的蛋白質(zhì)檢測。對(duì)按比例擴(kuò)大第4組的SDS-PAGE分析(圖4A和4B)揭露在低速離心的初次澄清步驟中通過移除細(xì)胞碎片移除大多數(shù)宿主蛋白質(zhì)(圖4A、4B，條帶1和2)。根據(jù)BCA分析，移除91.5%的總蛋白質(zhì)，表示低速離心是有效雜質(zhì)移除步驟。用lOmMHEPES緩沖液(pH7.5,添加1X磷酸谷氨酸蔗糖(SPG;7.5%蔗糖、10mM磷酸鉀、5mM谷氨酸))、0.465MNaCl和2%蔗糖稀釋來自離心的上清液(圖4A、4B，條帶3)，其中由于稀釋而觀察到較淡染色條帶。接著通過0.2)am過濾器抽汲稀釋的溶液以移除任何殘余微粒污染物(在這個(gè)步驟中未移除雜質(zhì)蛋白質(zhì)；圖4A、4B，條帶4)。收集VSV濾液作為妙丁Q步驟的進(jìn)料并且裝載到膜吸附劑上。在妙丁Q膜吸附劑上移除大于99.5%的殘余雜質(zhì)蛋0質(zhì)(表ll)。通過SDS-PAGE分析觀察到雜質(zhì)蛋白質(zhì)的移除(圖4A、4B,條帶4和5)，其中從妙丁Q膜洗脫高質(zhì)量VSV產(chǎn)物(圖4A、4B,條帶6)。將洗脫的VSV濃縮且透濾到PBS緩沖液(+7.5%蔗糖)中。在UF/DF純化步驟中移除大于48%的殘余蛋白質(zhì)雜質(zhì)(表11)，其中檢測到密度極高的VSV蛋白質(zhì)條帶(圖4A、4B，條帶7)。在UF/DF滲透混合物中僅觀察到微量雜質(zhì)蛋白質(zhì)(圖4A、4B，條帶8)。在最終0.2pm過濾前后，沒有可檢測的關(guān)于VSV蛋白質(zhì)質(zhì)量或雜質(zhì)蛋白質(zhì)概況的變化(圖4A、4B，條帶9和10)。來自最新發(fā)展的方法的VSV純化的整體濃縮物還證明與通過蔗糖梯度離心的純化相比高的純度和低的殘余含量。舉例來說，來自最新發(fā)展的方法的VSV蛋白質(zhì)(M、N、P、G禾UL)的染色條帶(圖5A、5B,條帶9)比通過蔗糖梯度離心純化的VSV的染色條帶(圖5A、5B，條帶11)密度更高(雜質(zhì)蛋白質(zhì)染色條帶密度更小)，表示通過圖1中所示的新穎純化方法達(dá)成較高質(zhì)量VSV產(chǎn)物。在所有四個(gè)按比例擴(kuò)大組中，根據(jù)雜質(zhì)蛋白質(zhì)概況和VSV蛋白質(zhì)條帶的密度達(dá)成類似產(chǎn)物質(zhì)量(數(shù)據(jù)未展示)。尺寸排阻-高效液相色譜法(SE.HPLC)分析。發(fā)展對(duì)VSV的SE-HPLC分析(參見實(shí)例！)，其提供將VSV與雜質(zhì)蛋A質(zhì)分離且定性地分析VSV純化方法的簡便方法。為保護(hù)管柱，僅將澄清的樣品注入管柱中。VSV以洗脫峰、7.5分鐘的滯留時(shí)間從管杵流出(數(shù)據(jù)未展示)。在VSV峰后污染物/雜質(zhì)蛋白質(zhì)峰(其具有較長管柱滯留時(shí)間)從管柱洗脫且因此需要從VSV產(chǎn)物消除/移除。在妙丁Q流過物和洗滌物中移除大多數(shù)雜質(zhì)，這證實(shí)SDS-PAGE分析的結(jié)果。在UF/DF步驟中，移除緩沖液相關(guān)雜質(zhì)且在任一滲透物中未損失VSV(數(shù)據(jù)未展示)。在最終0.2nm過濾后，VSV產(chǎn)物從SE-HPLC管柱以單一主峰、7.5分鐘的滯留時(shí)間洗脫，隨后為對(duì)應(yīng)于緩沖液空白的兩個(gè)較小峰(數(shù)據(jù)未展示)。殘余宿主DNA的移除。細(xì)胞培養(yǎng)物(宿主細(xì)胞)DNA是使用重組技術(shù)的純化方法中的主要污染物之一。VSV純化的整體濃縮物中的殘余DNA含量應(yīng)低于10毫微克/劑量(10、fu)。四個(gè)按比例擴(kuò)大組的DNA移除概況總結(jié)在下表12中，其中在各純化步驟中達(dá)成一致DNA移除。在產(chǎn)物回收步驟(艮卩，通過低速離心的1°澄清，隨后通過0.2pm過濾的2。澄清)和妙丁Q膜吸附劑步驟中觀察到主要DNA清除。在妙丁Q步驟中移除大于80%的殘余DNA且在UF/DF步驟中達(dá)成大于60%的DNA清除。在所有四個(gè)按比例擴(kuò)大組中，總DNA移除百分比是99.89±0.03%。此外，殘余DNA含量遠(yuǎn)低于10毫微克/劑量(表13)。表12.宿主DNA移除(％)的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>產(chǎn)物回收率1是低速離心、隨后0.2pm過濾的培養(yǎng)液澄清步驟。表13.VSV純化的整體濃縮物中的DNA含量的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>Gag蛋白質(zhì)的移除。通過ELISA測定Gag蛋白質(zhì)濃度，ELISA提供數(shù)據(jù)以確定VSV產(chǎn)物中的殘余Gag含量。純化方法中的Gag蛋白質(zhì)的概況總結(jié)于下表14中。在二次澄淸步驟(即，0.2)nm過濾)和妙丁Q膜吸附劑步驟中移除大多數(shù)Gag蛋白質(zhì)。如表15中所示，在最終純化的整體濃縮物中殘余Gag蛋白質(zhì)含量在0.08毫微克/劑量到8.93毫微克/劑量(107pfU)的范圍內(nèi)。表14.殘余GAG移除的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>實(shí)例10:VSVINN4CTl-gagl構(gòu)筑體的VSV按比例擴(kuò)大純化用于VSVinN4CT,-gagl構(gòu)筑體的純化方法發(fā)展的最初難題是細(xì)胞培養(yǎng)液中的低產(chǎn)物效價(jià)(<106pfu/ml)，其導(dǎo)致最終純化的整體濃縮物中的低產(chǎn)物效價(jià)和高DNA污染。然而，如實(shí)例9'l，所述的用于VSVINN4CT9-gagl的純化方法成功地應(yīng)川于這種VSV構(gòu)筑體且按比例擴(kuò)大到IOL規(guī)模(以細(xì)胞培養(yǎng)物體積計(jì))。已通過這種純化方法產(chǎn)牛高質(zhì)量VSV產(chǎn)物。在純化方法中，初次和二次澄清步驟實(shí)質(zhì)上類似于實(shí)例3和4中所述的那些步驟。使用妙丁Q吸附劑的陰離子交換膜吸附步驟優(yōu)化如下。切向流動(dòng)過濾使用(快斯坦tm)QuixstandTM或(弗萊坦tm)FlexstancFM系統(tǒng)以及中空纖維膜濾筒(通用電氣醫(yī)療公司(GEHealthcare);新澤西州皮斯卡塔巿(Piscataway,NJ))進(jìn)行。在這個(gè)研究中還測試截留分子量(MWCO)為750kDa的GE聚醚砜超濾膜。所有膜具有420cm2或1200cm2的標(biāo)稱過濾表面積。膜色譜法實(shí)驗(yàn)使用(阿克托tm)AKTATM探測機(jī)和(阿克托派萊tm)AKTAPilotTM系統(tǒng)(通用電氣醫(yī)療公司(GEHealthcare);新澤西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))以及頗爾妙丁Q膜吸附劑(頗爾公司；紐約東山(EastHills,NY))進(jìn)行。對(duì)于VSVnsN4C!Vgagl的首次妙丁Q純化試驗(yàn)妙丁Q吸附步驟使用與VSV1NN4CT9-gagl純化方法中所述相同的緩沖液和操作條件執(zhí)行?？傊韧ㄟ^離心移除細(xì)胞和碎片。添加1:9比率(v/v)的lOx磷酸谷氨酸蔗糖(SPG)和具有10mMHEPES、0.465MNaCl(pH7.5)、2%蔗糖的2倍稀釋液后，通過0.2過濾器抽汲溶液。將濾液裝入預(yù)平衡的頗爾妙丁Q膜吸附劑中(0.35ml容器體積)，收集流過和洗滌(FT&W)混合物。使用與VSVINN4CT9-gagl方法中所述相同的洗脫條件在洗脫混合物中回收VSV產(chǎn)物。獲得高質(zhì)量病毒產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未展示)。然而，在FT&W混合物中觀察到三分之一的病毒產(chǎn)物(表16)，.目.妙丁Q洗脫混合物中的病毒效價(jià)由于生物反應(yīng)器中的低病毒產(chǎn)生效價(jià)而極低(VSV^N4CT,-gagl為4.6xl05pfu/ml對(duì)比VSVINN4CT9-gagl為〉1.0xl07pfu/ml)。表16.方法分析-首次妙丁Q步驟中的效價(jià)回收率方法體積(ml)病毒效價(jià)(pfu/ml)病毒效價(jià)(pfu)回收率(％)進(jìn)料2509.90X1042.48XI07腦FT&W3003.20X1049.60X10b38.838<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*BD表示DNA含量低于檢測含量由通過空斑測定所測定的病毒效價(jià)計(jì)算方法回收率。當(dāng)裝載緩沖液pH值在6.6到7.5的范圍內(nèi)，且NaCl濃度為0.28M到0.30M時(shí)，如等高線圖中所示，達(dá)成可接受的方法回收率(數(shù)據(jù)未展示)。最優(yōu)裝載緩沖液條件為10mMHEPES、2呢蔗糖中的0.29MNaCl，pH7.0。因?yàn)閮?yōu)選在進(jìn)料調(diào)節(jié)中無pH值調(diào)節(jié)，所以認(rèn)為pH7.5可為妙丁Q平衡緩沖液pH值所接受。同時(shí)，確定0.60-0.70MNaCl和pH6.75-7.25為妙丁洗脫緩沖液條件。最優(yōu)洗脫緩沖液條件為10mMHEPES、0.65MNaCl、2%蔗糖，pH7.0。妙丁Q緩沖液條件總結(jié)于表19中。在這些發(fā)展條件下，洗脫混合物中的DNA污染物降低到可接受的含量(數(shù)據(jù)未展不)。表19.妙丁Q緩沖液條件<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>其它實(shí)驗(yàn)與這些結(jié)果一致且證明在某些實(shí)施例中0.28M到0.30MNaCl和pH7.2-7.5為優(yōu)選結(jié)合緩沖液條件以確保高產(chǎn)物冋收率，和洗脫混合物中DNA污染物可接受的減少。實(shí)例11:用于VSV^N4CTVgagl構(gòu)筑體的VSV按比例擴(kuò)大純化三個(gè)小規(guī)模的驗(yàn)證組是用相同進(jìn)料物質(zhì)、使用上文所發(fā)展的妙丁Q條件來完成。平衡緩沖液是10mMHEPES、0.29MNaCl(pH7.5)、2%蔗糖；而洗脫緩沖液是10mMHEPES、0.65MNaCl(pH7.0)、2%蔗糖。對(duì)于所有組保持相同操作條件相同流動(dòng)速率、相同裝載體積和相同洗脫體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)于表20中。根據(jù)由效價(jià)測定結(jié)果計(jì)算的產(chǎn)物回收率達(dá)成極其一致方法性能。表20.妙丁Q驗(yàn)證組<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>VSV,NN4CTVgagl純化方法按比例擴(kuò)大、一致性組和技術(shù)轉(zhuǎn)移使用移除微載體后含有VSVwN4CTVgagl的細(xì)胞培養(yǎng)液作為整個(gè)純化方法的起始物質(zhì)。所述方法包含通過低速離心使細(xì)胞培養(yǎng)液澄清和回收上清液中的VSV;通過0.45/0.2)am過濾器過濾所述上清液和回收過濾溶液中的VSV;將VSV過濾溶液裝載到陰離子交換膜吸附劑上，回收洗脫混合物中的VSV產(chǎn)物；通過切向流動(dòng)過濾(TFF)使用750kDa截留分子量膜純化回收的VSV和回收保留物中的VSV，并且最后通過0.2pm過濾器過濾VSV保留物和回收過濾溶液中的VSV。成功地完成三個(gè)6L按比例擴(kuò)大/一致性組(CR)和一個(gè)10L組(TTR)。實(shí)驗(yàn)條件總結(jié)于表21屮。表21.VSVinN4CTl-gagl按比例擴(kuò)大/一致性組的方法條件<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>1,2:CR#l-3的平均值和STDEV;N/D:未測定。用于VSVwN4CT,-gagl的純化方法成功產(chǎn)生高質(zhì)量產(chǎn)物。在一致方法性能下將純化條件按比例擴(kuò)大到IOL規(guī)模(以細(xì)胞培養(yǎng)物體積計(jì))。根據(jù)來自空斑測定的VSV效價(jià)的總方法產(chǎn)率低于從VSV1NN4CT9-gagl和VSVNjN4CTrgagl所達(dá)成的總方法產(chǎn)率。在最終0.2pm過濾中觀察到主要效價(jià)損失且也可能在妙丁Q步驟中觀察到。非特異性結(jié)合可解釋所述損失，特別是當(dāng)研究的難題是低效價(jià)起始物質(zhì)時(shí)。效價(jià)越低，越多部分的病毒將在過濾器中損失。增加細(xì)胞培養(yǎng)物的VSV效價(jià)是良好的解決方法。用于降低純化方法中的病毒效價(jià)損失的不同緩沖液組分、賦形劑和操作條件和病毒-產(chǎn)物友好緩沖系統(tǒng)的選擇是對(duì)這種純化系統(tǒng)的改良，相信這在此項(xiàng)技術(shù)的技能范圍內(nèi)而無需過多實(shí)驗(yàn)。實(shí)例12:用于VSVwN4CTVgagl構(gòu)筑體的VSV按比例擴(kuò)大純化如實(shí)例9中所述的用于VSVINN4CT9-gagl的純化方法成功地應(yīng)用于這種VSV構(gòu)筑體且按比例擴(kuò)大到IOL規(guī)模(以細(xì)胞培養(yǎng)物體積計(jì))。已通過這種純化方法產(chǎn)生高質(zhì)量VSV產(chǎn)物。在純化方法中，初次和二次澄清步驟實(shí)質(zhì)上類似于實(shí)例3和4中所述的那些步驟。使用妙丁Q吸附劑的陰離子交換膜吸附步驟優(yōu)化如下。切向流動(dòng)過濾使用(快斯坦TM)QuixstancFM或(弗萊坦TM)FlexstandTM系統(tǒng)以及中空纖維膜濾筒(通用電氣醫(yī)療公司(GEHealthcare);新澤西州皮斯卡塔巿(Piscataway，NJ))進(jìn)行。在這個(gè)研究中測試截留分子量(MWCO)為750kDa的GE聚醚砜超濾膜。所有膜具有420cm2或1200cm2的標(biāo)稱過濾表面積。膜色譜法實(shí)驗(yàn)使用(阿克托TM)AKTATM探測器和(阿克托派萊TM)AKTAPilotTM系統(tǒng)(通用電氣醫(yī)療公司(GEHealthcare);新澤西州皮斯卡塔市(Piscataway,NJ))以及頗爾妙丁Q膜吸附劑(頗爾公司；紐約東山(EastHills,NY))進(jìn)行。根據(jù)SDS-PAGE分析，利用與VSV,NN4CT9-gagl純化方法屮所述相同的操作條件，對(duì)于VSVwN4CT,-gagl的首次妙丁Q純化試驗(yàn)產(chǎn)生高質(zhì)量產(chǎn)物。然而，在產(chǎn)物洗脫混合物中檢測到高殘余DNA含量。使用膜色譜法，發(fā)展妙丁Q結(jié)合和洗脫條件以達(dá)成高純化倍數(shù)和高質(zhì)量VSV產(chǎn)物。在包括小規(guī)模組和按比例擴(kuò)大/一致性組的隨后實(shí)驗(yàn)中使用下列操作條件證明高方法性能一致性。純化方法還成功地轉(zhuǎn)移到用于臨床試驗(yàn)材料生產(chǎn)的合同生產(chǎn)機(jī)構(gòu)(contractmanufacturingorganization,CMO)。用于VSV^NACTVgagl的首次妙丁Q純化妙丁Q步驟使用細(xì)胞培養(yǎng)液和與VSVINN4CT9-gagl純化方法中所述相同的緩沖液和操作條件執(zhí)行?？傊ㄟ^離心移除細(xì)胞和碎片。通過添加lx磷酸谷氨酸蔗糖(SPG)和具有10mMHEPES、0.465MNaCl(pH7.5)、2%蔗糖的2倍稀釋液調(diào)節(jié)后，通過0.2pm過濾器抽汲上清液。將濾液裝載到預(yù)平衡的妙丁Q膜吸附劑上，收集流過和洗滌混合物。通過使用如VSV|NN4CT9-gagl純化方法中所述的洗脫緩沖液和操作條件獲得VSV產(chǎn)物。還收集來自使用10mMHEPES、1.0MNaCl(pH7.5)、2%蔗糖再生的混合物。最后，用1.0MNaOH溶液清洗妙丁Q。在實(shí)驗(yàn)中觀察到高VSV結(jié)合能力。然而，在洗脫混合物中回收極少產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未展示)。主要在再生混合物中檢測到病毒產(chǎn)物，且根本無法回收一半以上的病毒產(chǎn)物(參見表24)。在洗脫和再生混合物中檢測到高DNA污染物含量。用于妙丁Q的結(jié)合和洗脫條件進(jìn)一步優(yōu)化用于這種新構(gòu)筑體以增加產(chǎn)物回收率且同時(shí)降低殘余DNA含量。表24.妙丁Q方法分析-效價(jià)回收率和DNA移除<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*1劑量二1.0Xl()7pfu;BD:低于檢測限度如先前所述，VSV1NN4CT9-gagl純化的難題是從最終產(chǎn)物清除殘余DNA。使用(默克凱吉艾TM)MerckKGaATMTMAE和頗爾妙丁Q進(jìn)行進(jìn)一步條件優(yōu)化。使用(替默艾依TM)TMAETM樹脂的VSV純化發(fā)展使用如表25中所示的全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)執(zhí)行在TMAE樹脂上的VSV結(jié)合緩沖液條件篩選。進(jìn)料是調(diào)節(jié)為不同裝載緩沖液條件的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。使用西方印跡法分析監(jiān)測流過物中的VSV。表25.用于(替默艾依TM)TMAETM結(jié)合條件的全因子設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>如西方印跡法分析所示(未圖示)，當(dāng)平衡緩沖液中的NaCl濃度達(dá)到200mM時(shí)，在流過混合物中觀察到大量VSV。為獲得在TMAE上的合理的VSV結(jié)合能力，平衡緩沖液中的NaCl濃度應(yīng)低于200mM。VSV的結(jié)合情況在所測試的pH值條件中未受顯著影響。然而，對(duì)洗脫混合物中的VSV回收率的分析(通過TMAE洗脫混合物的SE-HPLC峰積分面積佔(zhàn)算(圖8A、8B和8C))指出在相同結(jié)合NaCl濃度下，在較高pH值條件下(pH7.5對(duì)比pH7.0和6.5)達(dá)成較高能力。使用TMAE管柱的VSV純化試驗(yàn)通過在20-24i:下在5000rpm下離心30分鐘從含有VSV1NN4CT9-gagl的細(xì)胞培養(yǎng)液移除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。在以9比1的比率與10xSPG原料溶液混合后，通過0.45/0.2)tim過濾器抽汲上清液。使用濾液作為TMAE管柱的進(jìn)料(2ml)，流動(dòng)速率為4ml/min。用10mMHEPES、0.145MNaCl、2%蔗糖(pH7.4)使所述管柱預(yù)平衡。用IO管柱體積(CV)的平衡緩沖液追加管柱后，通過線性梯度到10mMHEPES、1.5MNaCl、2%蔗糖(pH7.5)以30CV將結(jié)合的物質(zhì)從管柱洗脫。收集不同洗脫混合物。表26:從TMAE管柱的VSV洗脫<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>SDS-PAGE凝膠電泳(未圖示)允許在洗脫圖屮觀察到兩個(gè)主峰。第峰Fl具有低UV254/280比率，表示較"蛋0質(zhì)/病毒含量。第二峰F2具有"UV254/280比率，表明較高核酸含量。皮可林測定證實(shí)洗脫份混合物F1中的DNA含量極低(數(shù)據(jù)未展示)。因此，這種管柱用于DNA移除。這個(gè)峰的效價(jià)回收率根據(jù)空斑測定是81.4%。然而，注意到高蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量。使用妙丁Q膜吸附劑的VSV純化使用如表27中所示的全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)執(zhí)行在妙丁Q膜吸附劑上的VSV結(jié)合條件篩選。進(jìn)料是調(diào)節(jié)為不同裝載緩沖液條件的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。使用SDS-PAGE分析分析不同妙丁Q洗脫混合物(未圖示)。表27.用于妙丁Q結(jié)合條件篩選的全因子設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>對(duì)在妙丁Q吸附劑上的VSV結(jié)合條件篩選的SDS-PAGE分析展示分別在不同結(jié)合NaCl濃度下的洗脫混合物0.15M、0.20M、0.22M、0.24M、0.26M、0.28M。當(dāng)平衡緩沖液中的NaCl濃度達(dá)到0.26M時(shí)，在所有測試的pH值條件下從洗脫混合物移除高分子量蛋白質(zhì)雜質(zhì)。洗脫條件篩選用HEPES原料溶液(10mMHEPES、0.415MNaCl、2%蔗糖，pH7.25)將含有VSVINN4CT9-gagl的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液稀釋兩倍以達(dá)到0.28M的最終NaCl濃度。使用所制備的溶液作為實(shí)驗(yàn)的進(jìn)料。用于這個(gè)研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)總結(jié)于表28中。與妙丁QMA結(jié)合后，用不同NaCl濃度的洗脫緩沖液洗脫VSV。表28.用于妙丁Q洗脫條件篩選研究的全因子設(shè)計(jì)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>方法回收率的等高線圖分析(未圖示)指出為了得到合理的方法回收率(>55%)，洗脫緩沖液條件應(yīng)維持在pH=6.5-6.9和NaCl濃度0.55-0.70M。在這些條件下，如對(duì)妙丁Q洗脫混合物的SDS-PAGE分析(未圖示)'l'所示已產(chǎn)生高質(zhì)量VSV產(chǎn)物。使用DOE方法的妙丁Q條件優(yōu)化妙丁Q步驟中的進(jìn)一步優(yōu)化導(dǎo)致較好VSV結(jié)合和洗脫條件以達(dá)成高DNA清除程度和高方法產(chǎn)率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在表29中展示。根據(jù)初始篩選研究和VSVINN4CT9-gagl中的先前經(jīng)驗(yàn)選擇6.5到7.0的裝載和洗脫pH值。還從初始篩選研究的結(jié)果中選擇裝載和洗脫緩沖液屮的不同NaCI濃度。所有實(shí)驗(yàn)屮的流動(dòng)速率維持在7.0ml/min，其為20容器體積(CV)/分鐘。表29.在妙丁Q吸附劑上的VSV純化實(shí)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)通過空斑測定所測定的vsv產(chǎn)物效價(jià)計(jì)算方法產(chǎn)率。結(jié)果總結(jié)于預(yù)測概況(未圖示)中。為使方法產(chǎn)率最大，鑒別妙丁Q吸附中的下列緩沖液條件裝載緩沖液中的NaCl濃度0.26-0.30M裝載緩沖液pH值7.0-7.5洗脫緩沖液中的NaCl濃度0.55-0.65洗脫緩沖液pH值6.5-7.0在不同結(jié)合條件下妙丁Q洗脫混合物中的殘余DNA含量在等高線圖中報(bào)道(未圖示)。根據(jù)DNA清除結(jié)果進(jìn)一步改進(jìn)妙丁Q緩沖液條件裝載緩沖液中的NaCl濃度0.27-0.29M裝載緩沖液pH值7.0-7.5洗脫緩沖液中的NaCl濃度0.55-0.65洗脫緩沖液pH值6.5-7.0通過SDS-PAGE(未圖示)的密度測定法估算妙丁Q洗脫混合物中的VSV產(chǎn)物純度。分析不同結(jié)合緩沖液條件下和不同洗脫緩沖液條件下的產(chǎn)物純度?？紤]密度測定法分析的變化，對(duì)于所有情況來說不存在VSV產(chǎn)物純度的顯著差異。在所有實(shí)驗(yàn)'l'產(chǎn)生高質(zhì)量VSV產(chǎn)物。妙丁Q操作范圍通過在如表30中所示的發(fā)展條件內(nèi)和發(fā)展條件外用更多操作點(diǎn)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)來定義妙丁Q膜色譜法的結(jié)合和洗脫緩沖液條件。平衡/洗脫緩沖液是10mMHEPES、2%蔗糖以及各種量的NaCl和不同pH值條件。對(duì)于所有組保持相同操作條件相同流動(dòng)速率、相同裝載體積和相同洗脫體積。如表30中所示，觀察到一致方法性能根據(jù)SDS-PAGE分析產(chǎn)生高質(zhì)量VSV產(chǎn)物；在所有妙丁Q洗脫混合物中達(dá)成可接受的殘余DNA清除程度；同時(shí)獲得類似方法產(chǎn)率。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>N/D:未測定VSVINN4CT9-gagl—致性組使用含有VSVINN4CT9-gagl的細(xì)胞培養(yǎng)液執(zhí)行整個(gè)純化方法。所述方法包含通過低速離心使細(xì)胞培養(yǎng)液澄清和回收上清液中的VSV;通過0.45/0.2pm過濾器過濾所述上清液和回收過濾溶液中的VSV;將VSV濾液裝載到陰離子交換膜吸附劑上，從所述陰離子交換膜吸附劑洗脫VSV和回收VSV產(chǎn)物；通過切向流動(dòng)過濾(TFF)使用750kDa截留分子量中空纖維膜純化回收的VSV和回收保留物中的VSV，并且通過0.2pm過濾器過濾VSV保留物和回收過濾溶液'i'的VSV。在韋思公司(Wyeth)完成作為"致性組"的一個(gè)IOL和兩個(gè)6L組且在赫諾根公司(Henogen)完成作為技術(shù)轉(zhuǎn)移組的兩個(gè)IOL組。實(shí)驗(yàn)條件總結(jié)于表31中。表31.用于VSVINN4CT9-gagl組的方法條件方法方法條件通過離心回收產(chǎn)物分批式離心機(jī)6236Xg，30min，20-24°C通過過濾回收產(chǎn)物賽多利斯賽多朗300用于6L規(guī)模，500用于10L規(guī)模；流動(dòng)速率200ml/min用于6L規(guī)模和300ml/min用于10L規(guī)模妙丁Q色譜法頗爾妙丁Q10ml容器，流動(dòng)速率200ml/min;頗爾妙丁Q60ml容器，流動(dòng)速率600ml/minTFF超濾/透濾通用電氣醫(yī)療公Kl(GEHealthcare)，MWCO:750kDa,五次緩沖液交換；CR:420cm2，CFR:500-550ml/min，TMP=1.0-2.0psi;TTR:1200cm2,CFR:1800ml/min,TMP=2.0psi最終過濾賽多利斯賽多朗150;流動(dòng)速率100ml/min10ml(默斯坦tm)MustanQ容器用于三個(gè)一致性組(CR)和一個(gè)技術(shù)轉(zhuǎn)移組(TTR)。60ml妙丁Q容器僅用于一個(gè)TTR。流動(dòng)速率對(duì)于10ml容器為200ml/min且對(duì)于60ml容器為600ml/min。420cm2TFF膜用于一致性組，而1200cn^用于TTR。根據(jù)膜面積線性地調(diào)節(jié)交叉流動(dòng)速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)于表32和33中。總方法產(chǎn)率對(duì)于所有執(zhí)行的組來說是一致的。在不同組之間步驟回收率的變化是由效能測定(表33)的變化引起的。在所有組中觀察到蛋白質(zhì)和DNA雜質(zhì)的一致移除(表32)。對(duì)于所述方法的典型SDS-PAGE分析附有這個(gè)評(píng)估(未圖示)。已通過這種純化方法產(chǎn)生高質(zhì)量病毒產(chǎn)物。表32.VSVNjN4CTVgagl—致性組的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>1，2:CR#l-3的平均值和STDEV;N/D:未測定。因此，已成功地發(fā)展用于VSVNjN4CT,-gagl的純化方法且發(fā)展的純化條件按比例擴(kuò)大到IOL規(guī)模(以細(xì)胞培養(yǎng)物體積計(jì))，仍然維持相同方法性能。通過在6到IOL規(guī)模下(以細(xì)胞培養(yǎng)物體積計(jì))三個(gè)一致性組和兩個(gè)技術(shù)轉(zhuǎn)移組驗(yàn)證所述方法。通過這種發(fā)展的方法在可接受的方法產(chǎn)率和雜質(zhì)清除率下產(chǎn)生高質(zhì)量病毒產(chǎn)物。本說明書通篇所引用的所有專利和公開案以引用的方式并入本文中。權(quán)利要求1.一種從感染水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液純化VSV的方法，所述方法包含(a)通過低速離心使所述細(xì)胞培養(yǎng)液澄清和回收上清液中的VSV；(b)通過0.2μm到0.45μm過濾器過濾步驟(a)的所述上清液和回收過濾溶液中的VSV；(b)將步驟(b)的所述VSV過濾溶液裝載到用第一pH值緩沖鹽溶液平衡的陰離子交換膜吸附劑上，用第二pH值緩沖鹽溶液從所述陰離子交換膜吸附劑洗脫VSV，和回收洗脫VSV的洗脫份；(d)通過切向流動(dòng)過濾(tangentialflowfiltration，TFF)使用具有介于300kDa與1,000kDa之間的截留分子量的膜來純化步驟(c)中所回收的VSV和回收保留物(retentate)中的所述VSV，和(e)通過0.2μm到0.22μm過濾器過濾來自步驟(d)的VSV保留物和回收過濾溶液中的VSV。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(e)中所回收的所述VSV至少90.0%到約99.0%不含細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白質(zhì)和核酸污染物。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是選自人類胚腎(HEK)細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞和AGMK維拉維拉細(xì)胞(維拉cell)。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述低速離心是介于4,400Xg至lj8,000Xg之間。5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(c)中的所述第一pH值緩沖鹽溶液或所述第二pH值緩沖鹽溶液的特征獨(dú)立地是選自由下列組成的群組的特征中的一種或多種(a)含有獨(dú)立地選自NaCl或KC1的鹽；(b)含有具有100mM到400mM的離子強(qiáng)度的鹽；(c)含有具有介于6.0到8.5之間的pKa的緩沖液；(d)具有6.5到8.0的pH值；(e)包含選自由磷酸鹽緩沖液、N-2-羥基乙基哌嗪-N'-2-乙垸磺酸(HEPES)緩沖液或三(羥基甲基)氨基甲烷(TRIS)組成的群組的緩沖液；和(f)包含濃度為1.5%到5%的蔗糖。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第二pH值緩沖鹽溶液中的所述鹽是NaCl且其中所述VSV是通過以單步驟添加所述第二pH值緩沖鹽溶液來從所述膜吸附劑洗脫，其中所述NaCl的單步驟洗脫濃度是介于500mM到750mM之問。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第二pH值緩沖鹽溶液具有洗脫流動(dòng)速率10容器體積/分鐘(capsulevolume/minute;CV/分鐘)至U30CV/分鐘。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第二pH值緩沖鹽溶液中的所述鹽是NaCl，且其屮在10CV/分鐘到30CV/分鐘的洗脫流動(dòng)速率下所述第二pH值緩沖鹽溶液屮的NaCl的離子強(qiáng)度從1mM線性增加到750mM。9.根據(jù)權(quán)利要求到8中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述TFF膜的特征是選自由卜'列組成的群組的特征中的一種或多種(a)300kDa截留分子量;(b)750kDa截留分子量；和(c)中空纖維膜模塊。10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述TFF包含將從步驟(c)回收的VSV濃縮至少5倍，隨后緩沖液交換至少一次或至少五次。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中用于所述緩沖液交換的緩沖液的特征是選自由下列組成的群組的特征「t'的-種或多種(a)磷酸鹽緩沖液，(b)HEPES緩沖液，(c)TRIS緩沖液；(d)具有5mM到15mM的濃度和7.2到7.5的pH值的緩沖液；禾口(e)還包含100mM到200mMNaCl和3.5%到4.5%蔗糖的緩沖液。12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一權(quán)利要求所述的方法，其中方法步驟(a)到(e)是在15'C和25'C或介于15'C到25'C之間的溫度下執(zhí)行。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(a)中使所述細(xì)胞培養(yǎng)液澄清是通過1.0到4.5nm深度過濾模塊進(jìn)行，其中步驟(a)中省略低速離心。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一權(quán)利要求所述的方法，其中將所述純化的VSV調(diào)配到醫(yī)藥組合物中。15.—種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法所純化的VSV。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的VSV，其具有至少一種選自由下列組成的群組的特征(a)選自由下列組成的群組的血清型VSV印地安那州(Indiana)血清型、VSV新澤西州(NewJersey)血清型、VSV圣胡安(SanJuan)血清型、VSV伊斯法罕(Isfahan)血清型、VSV格拉斯哥(Glasgow)血清型和VSV金迪普拉(Chandipura)血清型；(b)包含至少一個(gè)或至少兩個(gè)減弱VSV的致病性的突變的基因組序列；(c)(b)的基因組序列，其中所述減毒突變是選自由熱敏性(temperature-sensitive,ts)突變、點(diǎn)突變、基因改組突變、G-莖(G-stem)突變、非細(xì)胞病變M基岡突變、雙義RNA突變、截?cái)郍基岡突變、G基岡插入突變和基因缺失突變組成的群組；和d)其中所述VSV基因組序列包含選自由下列基因組成的群組的外來RNA開放閱讀框架(openreadingframe,ORF)序歹U:選tl由g(3g、e"v、poZ、v(/"、"e/、ta"vpr、rev或vpM組成的群組的HIV基因、HTLV基因、SIV基因、RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)基因、水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-Zostervirus)基因、腮腺炎病毒基因、麻疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰質(zhì)炎病毒基因、鼻病毒基因、A型肝炎病毒基因、B型肝炎病毒基因、C型肝炎病毒基因、諾沃克病毒(Norwalkvirus)基因、外衣病毒基因、a病毒(alphavirus)基因、風(fēng)疹病毒基因、狂犬病病毒基因、馬爾堡病毒(Marburgvirus)基因、埃博拉病毒(Ebolavirus)基因、乳頭瘤病毒基因、多形瘤病毒基因、偏肺病毒基因、冠狀病毒基因、霍亂弧菌(W6r/o"o/erae)基因、肺炎鏈球菌(5Y，tococcKs戶e薩om.ae)基因、化膿性鏈球菌dep加occmpyoge"")基因、幽門螺桿菌(淑!'cobacferpy/o"')基因、無乳鏈球菌(r，ococcMSagatoc"'ae)基因、腦膜炎雙球菌(脂雄"'afnem'w'"'d!、)基因、淋病奈瑟菌(/Ve/潔"'agonorr/zeae)基因、白喉?xiàng)U菌(Cory"e/a"en:aA'p/^/ze〃'tw)基肉、破傷風(fēng)梭菌(C7o"n'c/mmfefam')基因、百日咳桿菌(Sord"e〃a基因、嗜血桿菌(f/aemop/u7w)基因、衣原體(CWamyAa)基因、大腸桿菌(&c/^n'c/n'acoh')基因、編碼細(xì)胞因子的基因、編碼T輔助表位的基因、編碼CTL表位的基因、編碼佐劑的基因和編碼輔因子的基因。17.—種醫(yī)藥組合物，其包含于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中的根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的VSV。18.—種免疫原性組合物，其包含于醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑中的根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的VSV。全文摘要本發(fā)明描述從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物獲得具有改良純度的水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)的新穎純化方法。更特定來說，在某些實(shí)施例中，描述一種從感染VSV的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液純化VSV的方法，所述方法包含通過低速離心使所述細(xì)胞培養(yǎng)液澄清和回收上清液中的所述VSV；通過0.2μm到0.45μm過濾器過濾所述上清液和回收過濾溶液中的VSV；將VSV過濾的溶液裝載到用第一pH值緩沖鹽溶液平衡的陰離子交換膜吸附劑上，用第二pH值緩沖鹽溶液從所述陰離子交換膜吸附劑洗脫VSV和回收洗脫VSV的洗脫份；通過切向流動(dòng)過濾(tangentialflowfiltration，TFF)使用具有介于300kDa與1,000kDa之間的截留分子量的TFF膜純化回收的VSV和回收保留物中的VSV，并且通過0.2μm到0.22μm過濾器過濾VSV保留物和回收過濾溶液中的VSV。文檔編號(hào)C12N7/02GK101426905SQ200780014090公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2007年4月19日優(yōu)先權(quán)日2006年4月20日發(fā)明者克里斯滕·埃利薩·塞弗森,云康,阿馬杜·阿弗雷伊·瓦塔拉,馬克·威廉·卡特勒申請(qǐng)人:惠氏公司