專利名稱：通過EB病毒p18與p23融合衣殼抗原檢測EBV特異性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種EBV特異性檢測方法。特別涉及一種通過EB病毒P18與p23融合衣殼抗原檢測EBV特異性的方法。
背景技術(shù)：
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)為嗜B淋巴細胞的人皰疹病毒，是傳染性單核細胞增多癥(IM)的病原體，還與多種淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤及胃癌、乳腺癌等的發(fā)生密切相關(guān)。EBV具有潛伏感染的特點，一定條件下潛伏病毒可被激活，引起增殖性感染，感染后引起多系統(tǒng)病變，且臨床表現(xiàn)也呈多樣性，容易造成誤診，對人類健康危害極大。因此，對EBV感染進行檢測，在診斷疾病并對療效進行有效監(jiān)測及流行病學調(diào)查中起著重要的作用。目前診斷EBV感染的方法包括3個方面①用疑有EBV感染的標本通過B細胞轉(zhuǎn)化試驗分離病毒；②應(yīng)用分子生物學方法如核酸雜交、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和蛋白印跡法直接檢測臨床標本中病毒基因組或其表達產(chǎn)物(RNA、蛋白)；③血清學檢測。病毒分離和分子生物學方法都需要一定的儀器設(shè)備和專業(yè)人員操作，步驟繁瑣，不適于臨床應(yīng)用，且某些方法不能區(qū)別EBV潛伏感染和增殖性感染，臨床上應(yīng)用較多的仍然是血清學檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種通過EB病毒pl8與p23融合衣殼抗原檢測EBV特異性的方法，將VCA p23和pl8基因進行融合后再表達，以融合基因的表達產(chǎn)物作為ELISA檢測的抗原，建立一套以p23-pl8融合蛋白為抗原的VCA特異性IgM和IgG間接 ELISA檢測方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下一種通過EB病毒pl8與p23融合衣殼抗原檢測EBV特異性的方法，其特征在于采用重疊延伸PCR技術(shù)，借一中間接頭(Gly4Ser)3的編碼序列，將編碼p23和pl8 編碼基因在體外進行融合；測序無誤后將融合基因克隆至表達載體，利用大腸桿菌表達融合蛋白；將表達產(chǎn)物純化后應(yīng)用免疫印跡法鑒定其特異性，然后以純化融合蛋白包被 ELISA反應(yīng)板，優(yōu)化各種成分含量及反應(yīng)條件，配套商品化的辣根過氧化酶標記的羊抗人 IgM.IgG及其它一系列試劑，組裝成EBV VCA特異性IgM和IgG間接法ELISA診斷試劑盒；選擇相關(guān)病人進行檢測，并與EB病毒血清學檢測IFA法進行比較，計算所述試劑盒的敏感性、特異性、約登指數(shù)、符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標，同時檢測診斷試劑的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。本發(fā)明的積極效果在于人類對EBV普遍易感。EBV是一種重要的DNA病毒，是傳染性單核細胞增多癥(IM) 的病原體，且與多種淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤如Burkitt淋巴瘤(BL)和某些上皮細胞腫瘤如未分化的鼻咽癌(NPC)等的發(fā)病高度相關(guān)，EBV感染越來越受到人們的關(guān)注。VCA抗體的消長與疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，EBV VCA抗體的檢測對疾病的早期診斷、療效觀察及流行病學
調(diào)查有重要意義。本發(fā)明成功建立了 EBV VCA融合抗原表達株，并用融合抗原做為ELISA包被抗原， 建立了 EBV VCA特異性IgG和IgM抗體間接ELISA診斷試劑盒，檢測結(jié)果可靠，操作簡單， 易自動化，能有效檢測EBV感染患者VCA抗體水平，對疾病的早期診斷、療效觀察及流行病
學調(diào)查有重要意義。本發(fā)明利用基因融合技術(shù)將EBV VCA p23和pl8基因融合，并導(dǎo)入原核表達載體獲得高效表達的融合蛋白，既利用P23和pl8蛋白的高度特異性，又具備p23易于表達和 P18免疫原性強的特點，Western blot顯示融合抗原具有較高的特異性和敏感性。只需要作一次克隆，降低了抗原制作成本，又可同時利用多種種抗原的免疫原性，提高了檢測的敏感性和特異性，還可以在基因水平控制不同抗原的比例。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明。p23和pl8融合基因的制備(1)模板DNA的制備以B95-8株病毒DNA為模板通過PCR獲取目的基因。常規(guī)培養(yǎng)收獲B95-8細胞，酚、氯仿、異戊醇法提取細胞DNA，步驟如下用適量STE重懸細胞，加蛋白酶K至終濃度200 μ g/mL，42°C消化3 5h，期間振搖數(shù)次。加等體積飽和酚，顛倒混勻20min，4°C，12000r/min離心15min。轉(zhuǎn)移上層水相至新離心管中，加等體積氯仿異戊醇(24 1)抽提，12000r/min離心5min。轉(zhuǎn)移上層水相至新離心管中，加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，1/10體積3M NaAc (pH 5. 2)，_20°C過夜。4 12000r/min離心15min，沉淀DNA。棄上清，用預(yù)冷70%乙醇洗DNA沉淀。4°C瞬時離心，棄上清，DNA沉淀干燥后加適量TE緩沖液(pH 8.0)溶解，4°C保存?zhèn)溆谩?2)目的基因的選擇及引物設(shè)計選擇p23編碼基因BLRF2(氨基酸1 162)和 P18編碼基因BFRF3的C端(氨基酸105 176)基因序列，DNAStar軟件設(shè)計擴增兩段基因的特異性引物，并在P23上游引物的5’端引入限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I的酶切位點 (GGTACC)和保護堿基GTC，下游引物3’端刪除終止密碼TAA，引入linker ；pl8下游引物5’ 端引入限制性核酸內(nèi)切酶Sal I酶切位點(GTCGAC)和保護堿基CAC，上游引物5’端引入 linker。linker (Gly4Ser) 3 為編碼 15 個氨基酸的 DNA 序列，序列為 5' -GGTGGCGGTGGAAG CGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC-3 ‘。p23 上游引物 P1 序列為5，-GTCGGTACCATGTCAGC TCCACGCAAAGTCAG-3，(B95_8coordinate 88925-88947)，下游重疊引物 P2 序列為:5，-GCTG CCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCATCAGAAATTTGCACTTTCTT-3，(B95-8coordin ate 89410-89391)。pl8 上游重疊引物 P3 序列為5，-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGC GGCGGTGGCGGCAGCGC CGCATCCGCTGGGACCGG-3，(B95-8coordinate 61819-61839)，下游引物 P4 序列為5’ -CACGTCGACCTACTGTTTCTTACGTGCCCC-3' (B95-8coordinate 62037-62017)。 擴增產(chǎn)物P23為540bp (目的基因486bp+保護堿基和酶切位點9bp+linker 45bp)，pl8為 273bp(目的基因219bp+保護堿基和酶切位點9bp+linker45bp)，融合基因為768bp (p23和 pl8均攜帶互補的45bp的linker，因此融合基因的大小為540bp+273bp_45bp)。
(3)目的基因的PCR擴增采用重疊延伸PCR獲得融合基因首先分別以Pl和P2 配對、P3和P4配對進行PCR獲得p23和pl8目的基因片段，然后將兩種基因片段混合，二者通過引物P2和P3的互補形成異源雙鏈，最后以Pl和P4配對通過PCR延伸形成融合基因。融合蛋白的表達(1)原核表達載體pThioHis A的轉(zhuǎn)化與純化應(yīng)用TSS兩步法，將載體pThioHis A轉(zhuǎn)化新鮮制備的E. coli BL21感受態(tài)細菌， 以獲得大量的載體。具體步驟如下自LB平板挑取單個新鮮BL21菌落接種于3mL LB液體培養(yǎng)基，37 °C 200r/min振蕩培養(yǎng)16 20h。1 100稀釋活化菌液，370C，200r/min振蕩培養(yǎng)4h。取ImL菌液至1. 5mL 離心管中，5000r/min離心2min。棄上清，菌細胞沉淀用IOOyL TSS液重懸。力Π 1 μ L質(zhì)粒 pThioHisA，輕輕混勻，冰浴40min。42°C水浴90sec，再冰浴30sec。加IOOyL預(yù)溫至37°C 的LB液體培養(yǎng)基，370C，200r/min振搖30min。取100 μ L轉(zhuǎn)化菌，用無菌L棒均勻涂于瓊脂平板(含氨芐青霉素100 μ g/mL)，待液體吸收后，倒置平板于37°C溫箱中培養(yǎng)18 24h。 觀察到單個菌落生長后用parafilm膜將平板封口，置4°C冰箱中保存，同步設(shè)立陰性對照 (未用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化)。ELISA間接法試劑盒組裝(I)ELISA法原理本實驗采用間接ELISA法，以p23和pl8融合蛋白作為抗原檢測未知的VCA IgG和IgM抗體；指示系統(tǒng)是利用辣根過氧化物酶(HRP)作用于特異性底物 H2O2，催化時需供氫體，供氫體(DH2)為無色還原型化合物，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型化合物，本試驗選用TMB為供氫體。(2)抗原滴定及及ELISA試劑盒的組裝分別用pH9. 6的碳酸鈉緩沖液稀釋上述純化的重組融合蛋白，以不同濃度包被ELISA反應(yīng)板，與標準陽性血清及陰性血清反應(yīng)，采用方陣法滴定抗原濃度，選擇最適抗原濃度包板，組裝ELISA試劑盒。操作步驟如下將倍比稀釋的細胞抗原或純化的重組蛋白包被ELISA反應(yīng)板，每孔加100 μ L，輕搖ELISA反應(yīng)板使抗原溶液均勻分布于孔底，37°C孵育2h，然后4°C過夜。0. 02M PBS (pH 7.4)洗板，以去掉結(jié)合不牢固的抗原。力Π 200 μ L封閉液(含0.2%牛血清白蛋白的PBS)， 37°C作用2h以封閉板上未結(jié)合位點。0. 02M PBS (pH 7. 4)洗板3次，每次5min，最后一次在吸水紙上甩干，使殘留液體全部流出。ELISA板空氣干燥，密封，置于干燥容器中，-700C 凍存2周后應(yīng)用。1 20稀釋VCA IgG或IgM標準陽性血清和陰性血清，血清稀釋液為 PBS-T (0.02M PBS, 1% BSA, 0. 05% Tween 20)，每反應(yīng)孔加 100 μ L 稀釋血清，37 °C 孵育 30min。用PBS-T洗板3次，每次5min，甩干。加100 μ L辣根過氧化物酶標羊抗人IgM或 IgG抗體，37°C孵育30min。用PBS-T洗板3次，每次5min，甩干。加TMB底物A液和B液各 IOOyL 37°C作用10 15min，反應(yīng)至最佳顏色，加2M H2SO4終止反應(yīng)。以空白調(diào)零孔校正零點，450nm波長測定各反應(yīng)孔的OD值。選擇陽性血清和陰性血清出現(xiàn)最大OD差值的抗原濃度作為最適抗原濃度包板， 配套商品化的辣根過氧化酶標羊抗人IgM、IgG及其它一系列試劑，經(jīng)反復(fù)優(yōu)化各種成分含量及反應(yīng)條件，組裝成試劑盒，對450份血清進行VCA IgG和IgM檢測。經(jīng)上述滴定，抗原的最適濃度為2 μ g/mL。
ELISA檢測試劑方法驗證與評估試驗(1)重復(fù)性檢測用同一批試劑盒，對3份陽性和1份陰性血清分別在不同時間由不同人員操作，進行10次重復(fù)性檢測，計算10次重復(fù)檢測值的變異度。(2)穩(wěn)定性檢測取3批試劑盒，于4°C保存1周、1個月、3個月、6個月、1年，取陽性血清和陰性血清進行ELISA試驗。(3)與“金標準”IFA法及國外同類產(chǎn)品比較用p23和pl8融合抗原ELISA試劑檢測450份血清中VCA IgG和IgM。將血清1 20稀釋，按照5 (2)步驟進行測定，判斷結(jié)果前首先計算臨界值(cut-off value, CV)，測定3份VCA IgG或IgM陰性血清在自制ELISA 試劑盒檢測中的平均OD值(mean 0D)和標準差(SD)，CV = mean 0D+3SD。血清標本OD值大于CV判斷為陽性血清，小于CVX 0. 09判斷為陰性血清，在CV與CVX 0. 09之間視為可疑， 重新進行測定后判斷結(jié)果，如測定結(jié)果仍介于CV與CVX 0. 09之間或> CV，判為陽性。檢測 IgM時，首先用血清吸附劑吸附血清中的IgG和類風濕因子再進行IgM的檢測。同時以IFA檢測450份血清，N0VATEC公司生產(chǎn)的IgG和IgM ELISA試劑盒檢測其中的175份血清，比較融合抗原ELISA、IFA及NOVATEC ELISA的檢測結(jié)果，計算評價自制試劑盒的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率、一致性、診斷陽性率、診斷陰性率和約登指數(shù)等指標。
權(quán)利要求
1. 一種通過EB病毒P18與P23融合衣殼抗原檢測EBV特異性的方法，其特征在于 采用重疊延伸PCR技術(shù)，借一中間接頭(Gly4Ser) 3的編碼序列，將編碼p23和pl8編碼基因在體外進行融合；測序無誤后將融合基因克隆至表達載體，利用大腸桿菌表達融合蛋白； 將表達產(chǎn)物純化后應(yīng)用免疫印跡法鑒定其特異性，然后以純化融合蛋白包被ELISA反應(yīng)板，優(yōu)化各種成分含量及反應(yīng)條件，配套商品化的辣根過氧化酶標記的羊抗人IgM、IgG 及其它一系列試劑，組裝成EBV VCA特異性IgM和IgG間接法ELISA診斷試劑盒；選擇相關(guān)病人進行檢測，并與EB病毒血清學檢測IFA法進行比較，計算所述試劑盒的敏感性、特異性、約登指數(shù)、符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標，同時檢測診斷試劑的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。
全文摘要
本發(fā)明是一種通過EB病毒p18與p23融合衣殼抗原檢測EBV特異性的方法，采用重疊延伸PCR技術(shù)，借一中間接頭(Gly4Ser)3的編碼序列，將編碼p23和p18編碼基因在體外進行融合；表達融合蛋白并將表達產(chǎn)物純化后應(yīng)用免疫印跡法鑒定其特異性，然后以純化融合蛋白包被ELISA反應(yīng)板，優(yōu)化各種成分含量及反應(yīng)條件，配套商品化的辣根過氧化酶標記的羊抗人IgM、IgG及其它一系列試劑，組裝成EBV VCA特異性IgM和IgG間接法ELISA診斷試劑盒。
文檔編號G01N33/569GK102384976SQ20111028109
公開日2012年3月21日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者邱清芳 申請人:邱清芳