專利名稱：：病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P_D及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：病毒樣顆粒(Virus-likeParticles,VLPs)是一種在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與病毒類似的球形顆粒狀物質(zhì)，但不含病毒基因組。依據(jù)來源可分為源于病毒VLPs和人工VLPs。前者主要通過基因工程制備，后者由人工化學(xué)合成而來。VLPs的表面組分可進(jìn)行靈活多樣的修飾改造以滿足不同需求；在適宜條件下，VLPs可以包裹核酸、藥物或其它小分子物質(zhì)，作為分子靶向運(yùn)載工具；VLPs還具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，不僅能通過影響抗原遞呈細(xì)胞發(fā)揮佐劑效應(yīng)，還可以作為其它佐劑、肽疫苗和核酸疫苗的整合平臺設(shè)計多種形式的疫苗，因此在分子載體和疫苗設(shè)計中具有良好的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，人類乳頭狀病毒16型(HumanPapillomavirustype-16，HPV16)的主要衣殼蛋白(Ll)具有自身裝配成VLPs的特性，而且HPV16L1VLPs還能將外源核酸分子包裝成具有天然病毒樣結(jié)構(gòu)的偽病毒(PseudoVirus)，可作為基因或藥物的運(yùn)載工具。系統(tǒng)性紅斑狼疾(systemicl叩userythematosus,SLE)是一種以產(chǎn)生多種自身抗體為特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)多樣，可侵犯多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病。其病因不明，可能與遺傳、性激素、環(huán)境、感染、藥物、機(jī)體免疫異常等多種因素相關(guān)。目前主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑進(jìn)行聯(lián)合治療，但毒副作用產(chǎn)生抑制，增加了患者發(fā)生感染的危險性，且部分患者治療無效或效果差，屬于難治性狼瘉。近年來，隨著對SLE發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步的深入研究，針對發(fā)病機(jī)制中某一環(huán)節(jié)或影響發(fā)病及疾病進(jìn)展的關(guān)鍵分子的選擇性靶向治療已成為治療的新方向，以生物技術(shù)為基礎(chǔ)的多種生物制劑的研發(fā)及應(yīng)用已經(jīng)成為自身免疫性疾病治療研究的熱點(diǎn)。B淋巴細(xì)胞在多種自身免疫疾病發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用，它不僅可作為產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞的前體，還可作為潛在的抗原遞呈細(xì)胞，輔助T細(xì)胞的活化；另外，B淋巴細(xì)胞還可通過分泌細(xì)胞因子，包括IL-4、IL-6、IL-10和IFN-Y，發(fā)揮免疫調(diào)控作用，從而成為近年來SLE靶向治療方法研究的重點(diǎn)。當(dāng)前針對B細(xì)胞的SLE靶向治療策略有干擾DNA特異性B細(xì)胞的活化、重組免疫毒素殺傷病理性B細(xì)胞等，但是這些方案存在著體內(nèi)易降解，血清半衰期短，治療效果不能穩(wěn)定和持久，其它細(xì)胞吞噬后可能造成非特異性損傷，以及可能誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答等不足。因此，研制具有良好有效性、安全性和耐受性的生物制劑成為本領(lǐng)域一項緊迫和重要的工作。但迄今為止，尚未見有關(guān)SLE治療性偽病毒疫苗及其制備方法方面的研究報道。在SLE患者體內(nèi)能檢測到許多抗核抗體，其中抗ds-DNA抗體不^f義具有診斷學(xué)價值，而且是觸發(fā)SLE的主要致病性抗體。作為抗ds-DNA抗體來源的DNA特異性B細(xì)胞，在SLE發(fā)病中扮演著關(guān)鍵角色。DNA特異性B細(xì)胞表面的抗原受體(Bcellrecptor，BCR)在獨(dú)特型上與抗ds-DNA抗體是一致的，它們能結(jié)合共同的抗原。GaynorB等人以抗ds-DM抗體為親和配基，從噬菌體隨機(jī)肽庫中篩選得到了多個表位肽，可模擬DNA分子與抗ds-DNA抗體結(jié)合，其中一個序列為DWEYSVWLSN的IO肽(在本發(fā)明中命名為P。肽)，與ds-DNA抗體有高親和力(Peptideinhibitionofglomerulardepositionofananti-DMantibody.Gay匿B，etal.ProcNat1AcadSci，94(5):1955-1960,1997)。因此，P。肽可用來引導(dǎo)融合蛋白或基因載體對DNA特異性B細(xì)胞進(jìn)《亍殺傷或干預(yù)。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。，具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的第二目的在于提供病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。的編碼基因，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第三目的在于提供病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-Pd的制各方法，包括以下步驟a.HPV16Ll-Pn基因的構(gòu)建以野生型HPV16LI基因?yàn)槟０?，采用重疊延伸PCR法在HPV16LI基因的798/799位堿基之間插入編碼P。肽的堿基序列，引物設(shè)計如下外側(cè)正向引物F如SEQIDNo.3所示，外側(cè)反向引物R如SEQIDNo.4所示，誘變引物Fm如SEQIDNo.5所示，誘變引物Rm如SEQIDNo.6所示；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，純化約1600bp的目的片段，將所得目的片段克隆入pCRII-T0P0栽體，再轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用含氨節(jié)青霉素的LB平板篩選陽性克隆菌，提取質(zhì)粒，采用酶切和PCR法鑒定陽性克隆質(zhì)粒并測序，獲得1602bp的HPV16L1-Pd基因，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；b.HPV16Ll-P?；虻目寺∫圆襟Ea所得陽性克隆質(zhì)粒為模板，PCR法擴(kuò)增HPV16L1-P?；颍镌O(shè)計如下上游引物I如SEQIDNo.7所示，下游引物I如SEQIDNo.8所示；PCR產(chǎn)物按照步驟a所述方法再次進(jìn)行鑒定，純化，克隆，轉(zhuǎn)化，篩選，鑒定，測序等一系'列過程，確認(rèn)克隆HPV16LI-P。基因的順序正確性；c.重組載體pFastBacDualHPV16LI-P。的構(gòu)建將步驟b所得陽性克隆質(zhì)粒用Ehel和Xhol進(jìn)4亍雙酶切，得到HPV16L1-PD基因片段，再克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual,獲得重組載體pFastBacDualHPV16L1-PD;d.含有HPV16LI-Pn基因的重組桿狀病毒的制備按照BaculoGold轉(zhuǎn)染試劑盒說明操作，將步驟c構(gòu)建的重組載體pFastBacDualHPV16Ll-P。與桿狀病毒線性DNA即BaculoGoldDNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9,經(jīng)胞內(nèi)同源重組獲得含有HPV16L1-P?；虻闹亟M桿狀病毒；轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞于溫度27。C培養(yǎng)3天，收集培養(yǎng)上清作為病毒原液；e.昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和HPV16Ll-P。的純化將步驟d所得病毒原液感染Sf9細(xì)胞，置溫度27。C培養(yǎng)3天，收集受染細(xì)胞；將受染細(xì)胞沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液即PBS中，超聲破壁，低速離心收集上清，轉(zhuǎn)移至盛有質(zhì)量百分濃度為40。/。的蔗糖溶液的離心管中，超速離心收集沉淀，再以CsCl密度梯度超速離心，收集管中浮密度為l.34g/ml的白色蛋白條帶，即得病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-Pd。本發(fā)明的第四目的在于提供病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。作為基因或藥物靶向載體的應(yīng)用。本發(fā)明的第五目的在于提供病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。作為疫苗遞送工具的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。作為SLE疫苗遞送工具的應(yīng)用。本發(fā)明的第六目的在于提供SLE治療性偽病毒疫苗，該疫苗是以病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。包裹B細(xì)胞特異性啟動子IgK控制下的白喉毒素A鏈即DT-A基因表達(dá)型質(zhì)粒DNA分子，自組裝而成的模擬天然病毒樣結(jié)構(gòu)的偽病毒。本發(fā)明的第七目的在于提供采用病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。制備SLE治療性偽病毒疫苗的方法，包括以下步驟a.病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。的制備與前述病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。的制備方法相同；b.重組載體pcDNA3IgKDT-A的制備pTHA45載體含有IgKDT-A基因片段，以ApaI及BglII雙酶切pTHA45載體，切膠回收純化IgKDT-A基因片段，再與經(jīng)同樣雙酶切消化的pcDNA3載體進(jìn)行連接，制得重組載體pcDNA3IgKDT-A;c.SLE治療性偽病毒疫苗的制備取步驟a所得病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-Pd，加入變性劑使蛋白變性，再加入步驟b所得重組載體pcDNA3IgKDT-A，于PBS中透析過夜，使變性蛋白逐漸復(fù)性，在復(fù)性過程中HPV16Ll-Pn包裹重組載體pcDNA3IgKDT-A,自組裝形成模擬天然病毒樣結(jié)構(gòu)的偽病毒疫苗。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的HPV16Ll-P。是對HPV16Ll進(jìn)4亍改造，將P。肽插入HPV16Ll中獲得的病毒衣殼嵌合蛋白。該蛋白采用基因工程技術(shù)進(jìn)行制備，以重疊延伸PCR法對HPV16Ll基因作定點(diǎn)誘變，獲得HPV16Ll-P?；颍寺∪胼d體pCRII-TOPO,再進(jìn)一步定向插入轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual中，利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞Sf9內(nèi)表達(dá)外源蛋白。RT-PCR、SDS-PAGE與Westernblot鑒定證實(shí)HPV16Ll-P。基因在Sf9細(xì)胞內(nèi)可特異性轉(zhuǎn)錄并表達(dá)HPV16L1-P。；Southernblot鑒定顯示HPV16Ll-P。與DNA具有理想的結(jié)合能力；透射電鏡鑒定顯示HPV16L1-Pd具有自身裝配成VLPs的特性，并能將外源核酸分子包裝成具有天然病毒樣結(jié)構(gòu)的偽病毒。本發(fā)明的病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。利用暴露在VLPs表面的P。肽，在體內(nèi)能夠高效識別DM特異性B細(xì)胞，從而成功靶向轉(zhuǎn)染到DNA特異性B細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)或藥物作用的靶向性，可作為基因或藥物的運(yùn)載工具以及疫苗遞送工具。采用本發(fā)明的病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。可制備SLE治療性偽病毒疫苗即模擬天然病毒樣結(jié)構(gòu)的核酸-VLPs復(fù)合疫苗，該疫苗及其制備方法具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)選擇病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。為基因載體，HPV16Ll基因比較簡單，不舍自我復(fù)制單元或潛致癌序列，較其它病毒載體更安全；HPV16L1VLPs的免疫原性弱，僅觸發(fā)宿主弱的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，特別是產(chǎn)生的中和性抗體滴度很低，可反復(fù)使用；HPV16Ll-PDVLPs可特異性感染DNA特異性B細(xì)胞，靶向性強(qiáng)；(2)選擇B細(xì)胞特異性啟動子IgK控制下的DT-A基因表達(dá)型質(zhì)粒DNA分子為VLPs包裹的核酸分子，通過B細(xì)胞特異性啟動子控制毒素基因表達(dá)，僅殺傷致病性B細(xì)胞克隆，殺傷特異性有保障；(3)制得的偽病毒表面具有多價P。肽，除與DNA特異性B細(xì)胞結(jié)合外，還能與體內(nèi)游離的抗ds-DM抗體結(jié)合，有利于降低病理性自身抗體的滴度；(4)制備過程簡單，不受嚴(yán)格的P3生物安全條件限制，產(chǎn)品具有更好的敏感性和特異性；(5)本發(fā)明疫苗完全源于人工設(shè)計、構(gòu)建，方便進(jìn)一步的修飾改造。以MRL/lpr狼瘡小鼠為動物模型，通過尾靜脈回輸?shù)姆绞皆u價本發(fā)明的SLE治療性偽病毒疫苗的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組小鼠治療后的尿蛋白、血清尿素氮、肌酐及抗ds-DNA抗體均下降，與治療前相比有顯著性差異，而對照組治療前后無顯著性差異，并且治療組小鼠的平均生存期比對照組明顯延長，表明本發(fā)明的SLE治療性偽病毒疫苗可顯著改善MRL/lpr小鼠的免疫狀況和腎臟功能，提高小鼠的平均生存期，具有良好的臨床應(yīng)用前景，可為患者尤其是那些傳統(tǒng)免疫抑制治療效果不佳的患者提供新型的靶向生物制劑，也為SLE等自身免疫性疾病的藥物研發(fā)提供新的設(shè)計思路。本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)，和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進(jìn)行闡述，并且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的，或者可以從本發(fā)明的實(shí)踐中得到教導(dǎo)。本發(fā)明的目標(biāo)和其他優(yōu)點(diǎn)可以通過下面的說明書和權(quán)利要求書來實(shí)現(xiàn)和獲得。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為HPV16L1-P?；虻腜CR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖2為重組克隆載體pCRIIHPV16Ll-P。的酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖3為病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。的SDS-PAGE與Western-blot鑒定圖;圖4為病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。和SLE治療性偽病毒疫苗的透射電鏡圖5為兩組小鼠治療后的生存率比較圖。具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。(一)病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。的制備1.HPV16L1-P?；虻臉?gòu)建根據(jù)重疊延伸PCR法(Overlap-extensionPCR，0E-PCR)定點(diǎn)-誇變的原理，設(shè)計并合成4條引物外側(cè)正向引物F如SEQIDNo.3所示，下劃線部分為BglII限制性酶切位點(diǎn)；外側(cè)反向引物R如SEQIDNo.4所示；-誇變引物Fm如SEQIDNo.5所示，下劃線部分為突變位點(diǎn)；誘變引物Rm如SEQIDNo.6所示，下劃線部分為突變位點(diǎn)；取人宮頸癌細(xì)胞抹Caski,加入Tripure試劑，按照試劑說明提取細(xì)胞總RNA;逆轉(zhuǎn)錄以提取的總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)"為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得野生型HPV16LIDM,具體方法為取濃度為100jig/ml的總RNA5pl、濃度為100嗎/ml的引物1nl、雙蒸水補(bǔ)充體積至10jil，7(TC水浴5分鐘，立即水浴5分鐘，再加入10x逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2pi、畫LV逆轉(zhuǎn)錄酶20U、濃度為10mmol/L的dNTP混合溶液2(xl、RNA酶抑制蛋白20U、雙蒸水補(bǔ)充體積至2042。C水浴l小時，95。C變性5分鐘；第一輪PCR:以野生型HPV16LlDNA為模板，以外側(cè)正向引物F和誘變引物Rm為上下游引物，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，獲得含突變位點(diǎn)及其上游序列的DNA片段FRm;第二輪PCR:以野生型HPV16LIDNA為模板，以誘變引物Fm和外側(cè)反向引物R為上下游引物，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，獲得含突變位點(diǎn)及其下游序列的DNA片段FmR;第三輪PCR:以第一、二輪PCR獲得的2條部分重疊的DNA片段FRm、FmR為模板，以外側(cè)正向引物F和外側(cè)反向引物R為上下游引物，進(jìn)行第三輪PCR擴(kuò)增，獲得由DNA片段FRm和FmR拼接而成的全長含突變位點(diǎn)的DNA片段FR,即HPV16Ll-P?；?；以上三輪PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件相同，反應(yīng)體系為10xPCR反應(yīng)緩沖液5pi、濃度為10mmol/L的dNTP混合溶液1pl、濃度為10pol/L的上、下游引物各O.4(il、模板2pl、TaqDNA聚合酶2U、濃度為50mmol/L的MgCl2溶液lpl、雙蒸水補(bǔ)充體積至50pi;反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘，然后94。C變性l分鐘、45匸退火30秒、72匸延伸2分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸4分鐘；第三輪PCR產(chǎn)物采用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1所示，其中1泳道為PCR分子量標(biāo)準(zhǔn)，2泳道為PCR產(chǎn)物，從圖可知，在約1600bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與理論預(yù)測值相符；將鑒定為正確的第三輪PCR產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)進(jìn)行純化，按照試劑盒說明操作，選擇約1600bp的目的DNA片段進(jìn)行切膠回收純化，獲得HPV16L1-P?；颍粚PV16Ll-P。基因，加入TaqDNA聚合酶和dATP溶液，以溫度72。C、30分鐘進(jìn)行PCR，使HPV16Ll-P?；?'末端加上"a"堿基，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，切膠回收純化目的DNA片段，將所得目的DNA片段與pCRII-T0P0載體(sigma公司)進(jìn)行連接，連接方法為濃度為100嗎/ml的目的DNA片段5pl、濃度為100嗎/ml的載體3pl、濃度為100|_ig/ml的T4DNA連接酶0.5pl、10x緩沖液1pl、雙蒸水補(bǔ)充體積至IOpl，置溫度16。C孵育8小時，定向構(gòu)建重組克隆載體pCRIIHPV16L1-Pd;將重組克隆載體pCRIIHPV16L1-P。轉(zhuǎn)化入CaCh法制備的DH5oc大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法為將濃度為100pg/ml的重組克隆載體2pl加入到細(xì)胞密度為1x107ml的感受態(tài)細(xì)胞200pl中，冰浴30分鐘，42。C水浴熱休克90秒，立即冰浴2分鐘，再加入液體LB培養(yǎng)基，于溫度37。C，150r/min振搖1小時，制得轉(zhuǎn)化細(xì)胞；取轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含氨節(jié)青霉素的LB平板上，于溫度為37。C正置1小時，倒置過夜，從LB平板上隨機(jī)挑取3個白色菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C、150r/min振搖過夜，采用質(zhì)粒提取試劑盒(omega公司)小量提取質(zhì)粒，用酶切和PCR方法鑒定陽性克隆質(zhì)粒，酶切法為濃度為100嗎/ml的質(zhì)粒10pl、濃度為100jig/ml的BglII限制性內(nèi)切酶1nl、10x緩沖液3pl、雙蒸水補(bǔ)充體積至30pl，置溫度37。C孵育4小時，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖2所示，其中1泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2泳道為酶切產(chǎn)物，從圖可見兩條DNA帶，其中一條約1600bp，與理論預(yù)測值基本一致；PCR法為以經(jīng)酶切鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒為才莫板，以步驟1.1所述外側(cè)正向引物F和外側(cè)反向引物R為上下游引物，以步驟1.2所述PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，獲得約1600bp的條帶，與步驟1.2所得第三輪PCR產(chǎn)物的電泳條帶一致；取陽性克隆質(zhì)粒，委托上海生工生物工程技術(shù)公司測定插入片段的序列，獲得1602bp的DNA序列，如SEQIDNo.1所示，與HPV16L1-P?；虻睦碚擃A(yù)測值一致；2.HPV16L1-P。基因的克隆根據(jù)HPV16L1-P?；蛐蛄?，結(jié)合桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual上的內(nèi)切酶位點(diǎn)，設(shè)計如下引物上游引物I如SEQIDNo.7所示，下劃線部分為EheI酶切位點(diǎn)；下游引物I如SEQIDNo.8所示，下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn)；以步驟1所得陽性克隆質(zhì)粒為才莫板，采用上下游引物I,以步驟1所述PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，切膠回收純化目的DNA片段，再按照步驟1所述方法進(jìn)行克隆、篩選陽性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行序列測定，確認(rèn)克隆HPV16Ll-P?；虻捻樞蛘_性；3.重組載體pFastBacDualHPV16Ll-P。的構(gòu)建將步驟2經(jīng)測序鑒定的陽性克隆質(zhì)粒用Ehel和Xhol進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定雙酶切產(chǎn)物，切膠回收純化約1600bp的目的DNA片段；將所得目的DNA片^爻與按相同方法經(jīng)Ehel和Xhol雙酶切消化后的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual(sigma/>司)進(jìn)行連接，定向構(gòu)建重組栽體pFastBacDualHPV16L1-PD;將所得重組載體pFastBacDualHPV16Ll-P。轉(zhuǎn)化入CaCl2法制備的DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆質(zhì)粒并經(jīng)測序鑒定，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)獲得的質(zhì)粒為含有HPV16L1-P?；虻闹亟M質(zhì)粒；4.含有HPV16L1-P?；虻闹亟M桿狀病毒的制備將Sf9細(xì)胞置質(zhì)量百分濃度為10°/的FCS培養(yǎng)基中，于溫度27。C條件卞維系生長，待細(xì)胞于培養(yǎng)亞中長至50-70°/單層時，按照BaculoGoldTM轉(zhuǎn)染試劑盒(sigma公司)說明操作，將步驟3構(gòu)建的重組載體pFastBacDualHPV16LI-PD與桿狀病毒線性DNA(BaculoGoldDNA)共轉(zhuǎn)染，使之在Sf9細(xì)胞內(nèi)同源重組獲得含HPV16LI-P。基因的重組桿狀病毒；轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞于溫度27。C培養(yǎng)3天，細(xì)胞病變率達(dá)90°/。以上，可見細(xì)胞核增大，胞質(zhì)混濁、細(xì)胞變圓等重組桿狀病毒感染特征，收集培養(yǎng)上清作為病毒原液；5.昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和HPV16L1-Pd的純化將步驟4所得病毒原液以感染復(fù)數(shù)(M0I)為5感染對數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞，置溫度27。C培養(yǎng)，3天后細(xì)胞可出現(xiàn)明顯病變，收集受染細(xì)胞；將受染細(xì)胞沉淀重懸于預(yù)冷的濃度為O.1mol/L、pH值為7.4的PBS中，超聲破壁，低速離心收集上清，轉(zhuǎn)移至盛有質(zhì)量百分濃度為40。/。的蔗糖溶液的離心管中，超速離心收集沉淀，再以CsCl密度梯度超速離心，收集管中浮密度為l.34g/ml的白色蛋白條帶，即得病毒衣殼嵌合蛋白HPV16LI-PD，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。(二)病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。的鑒定1.RT-PCR鑒定HPV16L1-P?；虻陌麅?nèi)轉(zhuǎn)錄情況取收集的受染Sf9細(xì)胞，提取總RNA,再釆用RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，結(jié)果在約1600bp處有一明顯條帶，與理論上的產(chǎn)物長度相吻合；切膠回收純化PCR產(chǎn)物并進(jìn)行DNA序列分析，證實(shí)HPV16Ll-P?；蛟赟f9細(xì)胞內(nèi)特異性轉(zhuǎn)錄。2.SDS-PAGE與Westernblot鑒定HPV16L1-P。的表達(dá)量及特異性取制得的HPV16L1-Pd，使用質(zhì)量百分濃度為5%的濃縮膠、質(zhì)量百分濃度為12.5y。的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE,凝膠電泳完畢后，將膠切開，一半進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色分析；另一半轉(zhuǎn)印PVDF膜，洗膜封閉后加入一抗鼠抗人HPV16L1-PD，置溫度37。C孵育1小時，洗膜后加入羊抗鼠二抗，置溫度37。C孵育1小時，洗膜后顯色，進(jìn)4亍Westernblot分4斤。SDS-PAGE結(jié)果如圖3A所示，圖中M泳道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，l-4泳道為HPV16L1-PD,可見感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞有一分子量為63kD的特異性蛋白表達(dá)，即HPV16L1-P。特異性表達(dá)；考馬斯亮藍(lán)法測得500ml受染Sf9細(xì)胞中含有HPV16LI-PdO.5mg，其中1-3泳道的HPV16L1-P。濃度分別測定為209、263、82jig/ml，4泳道未測定HPV16Ll-P。的濃度。Westernblot結(jié)果如圖3B所示，其中1-4泳道為HPV16L1-P。(與圖3A相同)，可見在與SDS-PAGE相對應(yīng)的63kD有一條帶，表明感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞表達(dá)了與抗HPV16L1-P?？贵w特異性結(jié)合的蛋白，即HPV16L1-PD。3.Southernblot鑒定HPV16L1-Pd與DM的結(jié)合力將制得的HPV16Ll-P。通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性裂解、轉(zhuǎn)膜、復(fù)性后與地高辛標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行雜交，洗膜后顯色，觀察。結(jié)果顯示在特異位置出現(xiàn)顯色條帶，表明HPV16L1-P。與DNA具有理想的結(jié)合能力。4.透射電鏡鑒定HPV16Ll-P。的自發(fā)裝配能力將制得的HPV16L1-P。滴于200目銅網(wǎng)上，用質(zhì)量百分濃度為1%的水溶性醋酸鈾進(jìn)行負(fù)染，在80kV透射電鏡下觀察HPV16L1-P。的形態(tài)，結(jié)果如圖4A所示，HPV16L1-P。呈圓形顆粒樣結(jié)構(gòu)，直徑約為50nm，表明在缺乏其它病毒蛋白情況下，HPV16Ll-P?？勺园l(fā)形成VLPs。(三)SLE治療性偽病毒疫苗的制備1.病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。的制備按照(一)所述方法進(jìn)行制備；2.重組載體pcDNA3IgKDT-A的制備pTHA45載體(sigma公司)含IgKDT-A基因片段，該載體經(jīng)ApaI及BglII雙酶切后，插入的IgKDT-A基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、回收、純化，再與經(jīng)同樣雙酶切消化的pcDNA3載體(sigma^^司)在T4連^妄酶作用下進(jìn)行連接，以IgKDT-A基因片段取代穿梭型質(zhì)粒pcDNA3中CMV啟動子得到pcDNA3IgKDT-A重組載體；3.SLE治療性偽病毒疫苗的制備將步驟1所得病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。用濃度為0.1mol/L、pH值為7.4的PBS進(jìn)行溶解，制成濃度為lmg/ml的蛋白溶液，再加入2-巰基乙醇至最終體積百分濃度為5%，置溫度4。C反應(yīng)16小時進(jìn)行蛋白變性，然后在變性的蛋白溶液中加入步驟2所得重組載體pcDNA3IgKDT-A2mg,混勻后轉(zhuǎn)移至透析袋中，在濃度為O.1mol/L、pH值為7.4的PBS中于溫度4。C透析過夜，使變性蛋白逐漸復(fù)性，在復(fù)性過程中HPV16Ll-P。包裹重組載體pcDNA3IgKDT-A,自組裝形成SLE治療性偽病毒疫苗。(四)SLE治療性偽病毒疫苗的鑒定采用透射電鏡觀察所得SLE治療性偽病毒疫苗的結(jié)構(gòu)，透射電鏡圖如閨4所示，圖中A為HPV16L1-P。原液，B為變性后的HPV16LI-P。，C為SLE治療性偽病毒疫苗，從圖可知，HPV16L1-PD呈圓形顆粒樣結(jié)構(gòu)，其在變性劑的作用下解離成細(xì)小的分子結(jié)構(gòu)，但能在PBS中逐漸復(fù)性，又恢復(fù)原來的顆粒樣結(jié)構(gòu)。(五)SLE治療性偽病毒疫苗治療MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的實(shí)驗(yàn)研究一、實(shí)-瞼方法1.動物分組及治療將3月齡、體重20-30g的MRL/lpr狼瘉小鼠12只(由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供)隨機(jī)分成兩組實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組6只；實(shí)驗(yàn)組于尾靜脈回輸本發(fā)明的SLE治療性偽病毒疫苗，每周l次，每次IOOpl，連續(xù)回輸3次；對照組同法處理，但以等體積的濃度為O.1mol/L、pH值為7.4的PBS代替SLE治療性偽病毒疫苗；分別于治療前和治療后，于小鼠眶后靜脈叢采血，分離血清備用。2.尿蛋白的測定分別于治療前和治療后，采用代謝籠準(zhǔn)確測量小鼠24小時尿量，用考馬斯亮藍(lán)法測定尿蛋白量。3.血清尿素氮、肌酐的測定取小鼠血清100pl，用自動生化儀測定尿素氮、肌酐。4.抗ds-DNA抗體滴度的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，具體方法為在酶標(biāo)板中加入濃度為IOO嗎/ml的鮭魚精DNA溶液，100pl/孔，于室溫下包被10小時，用濃度為O.1mol/L、pH值為7.4的PBS洗滌3次，加入質(zhì)量百分濃度為ll的牛血清白蛋白(BSA)溶液，200^1/孔，于室溫下封閉2小時，PBS洗滌3次，加入按l:100稀釋的小鼠血清，100pl/孔，置溫度37。C孵育2小時，PBS洗滌3次，加入濃度為IOOnl/ml的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，100pl/孔，置溫度37。C孵育1小時，PBS洗滌3次，加底物溶液顯色，用酶標(biāo)儀在波長492nm處測定吸光度。5.小鼠生存率的測定觀察兩組小鼠在治療后1月到4月的生存情況。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.尿蛋白的測定兩組小鼠治療前后24小時尿蛋白量見表1，實(shí)驗(yàn)組小鼠治療后的尿蛋白量比治療前明顯降低(P<0.05),而對照組小鼠治療前后的尿蛋白量沒有明顯差異(P〉0.05)。表l.兩組小鼠治療前后24小時尿蛋白量(mg/24h，^士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2.血清尿素氮、肌酐的測定兩組小鼠治療前后血清尿素氮、肌酐量見表2，實(shí)驗(yàn)組小鼠治療后的血清尿素氮、肌酐量比治療前明顯降低(P<0.05)，而對照組小鼠治療前后的血清尿素氮、肌酐量沒有明顯差異(P〉0.05)。表2.兩組小鼠治療前后血清尿素氮、肌酐量(pmol/L，<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3.抗ds-DNA抗體滴度的測定兩組小鼠治療前后抗ds-DNA抗體滴度見表3,實(shí)—瞼組小鼠治療后的抗ds-DNA抗體滴度比治療前明顯降低(P〈0.05)，而對照組小鼠治療前后的抗ds-DM抗體滴度沒有明顯差異(P〉0.05)。表3.兩組小鼠治療前后抗ds-DNA抗體滴度(OD值，^士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>4.小鼠生存率的測定兩組小鼠治療后的生存率比較圖見圖5,如圖5所示，治療后第l個月，兩組小鼠的生存率沒有明顯差異(P〉0.05)，但第2個月后兩組小鼠的生存率差異明顯(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存率明顯高于對照組。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本發(fā)明的新型SLE治療性偽病毒疫苗可顯著改善MRL/lpr小鼠的免疫狀況和腎臟功能，提高小鼠平均生存期。盡管通過參照本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施例，已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。及其制備方法和用途<160>8<210>1<211>1602<212>腿<213>人工序列<220〉<221>CDS<222>(l)...(1602)<220><223>人工序列的描述對HPV16Ll基因定點(diǎn)誘變得到的HPV16Ll-P?；?lt;400>1tgtcgtactaccateMetSerTyrTyrHis15ccgaaaacctgtattThrGluAsnLeuTyr20ccactgtctacttgcAlaThrValTyrLeu35atgaatatgttgcacAspGluTyrValAla50gactacUgcagttgArgLeuLeuAlaValaccateaccateacgattacgatateccaacga48HisHisHisHisHisAspTyrAsplieProThr1015ttcagggcgcctetctttggctgcetagtgagg96PheGinGlyAlaSerLeuTrpLeuProSerGlu2530etcctgteccagtatetaaggttgtaagcaegg144ProProValProValSerLysValValSerThr4045gcacaaacatatattateatgcaggaacatcca192ArgThrAsnlieTyrTyrHisAlaGlyThrSer5560gacatecctattttcetaUaaaaaacetaaca240GlyHisProTyrPheProlieLysLysProAsn65707580ataacaaagtattagttcetaaagUtcaggattacaatacagggtat288AsnAsnLysValLeuValProLysValSerGlyLeuGinTyrArgVal859095ttagaatacatttacctgaccccaataagtttggttttcctgacacct336PheArglieHisLeuProAspProAsnLysPheGlyPheProAspThr100105110cattttataatecagatacacageggctggtttgggcctgtgtaggtg384SerPheTyrAsnProAspThrGinArgLeuValTrpAlaCysValGly115120125ttgaggtaggtcgtggtcagecattaggtgtgggcattagtggccate432ValGluValGlyArgGlyGinProLeuGlyValGlylieSerGlyHis130135140ctttattaaataaattggatgacacagaaaatgetagtgcttatgcag480ProLeuLeuAsnLysLeuAspAspThrGluAsnAlaSerAlaTyrAla145150155160caaatgcaggtgtggataatagagaatgtatatetatggattacaaac528AlaAsnAlaGlyValAspAsnArgGluCyslieSerMetAspTyrLys165170175aaacacaattgtgtttaattggttgcaaaccacetataggggaacact576GinThrGinLeuCysLeulieGlyCysLysProProlieGlyGluHis180185190ggggcaaaggatccccatgtaccaatgttgcagtaaatecaggtgatt624TrpGlyLysGlySerProCysThrAsnValAlaValAsnProGlyAsp195200205gtccaccattagagttaataaacacagttattcaggatggtgatatgg672CysProProLeuGluLeulieAsnThrVallieGinAspGlyAspMet210215220ttgatactggetttggtgetatggactttaetacattacaggetaaca720<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>aaaatactaactttaaggagtacctacgacatggggaggaatatgatt1200LysAsnThrAsnPheLysGluTyrLeuArgHisGlyGluGluTyrAsp385390395400tacagtttatttttcaactgtgcaaaataaccttaactgcagacgtta1248LeuGinPheliePheGinLeuCysLyslieThrLeuThrAlaAspVal405410415tgacatacatacattctatgaattccactattttggaggactggaatt1296MetThrTyrlieHisSerMetAsnSerThrlieLeuGluAspTrpAsn420425430ttggtctacaaccccccccaggaggcacactagaagatacttaUggt1344PheGlyLeuGinProProProGlyGlyThrLeuGluAspThrTyrArg435440445ttgtaacatcccaggcaattgcttgtcaaagacatacacetccagcac1392PheValThrSerGinAlalieAlaCysGinArgHisThrProProAla450455460ctaaagaagatecccttaaaaaatacactttttgggaagtaaatttaa1440ProLysGluAspProLeuLysLysTyrThrPheTrpGluValAsnLeu465470475480aggaaaagttttctgcagacctagateagtUcctttaggacgcaaat1488LysGluLysPheSerAlaAspLeuAspGinPheProLeuGlyArgLys485490495ttttactacaagcaggattgaaggccaaaccaaaatttacattaggaa1536PheLeuLeuGinAlaGlyLeuLysAlaLysProLysPheThrLeuGly.500505510aacgaaaagctacacccaccacctcatctacctctacaactgctaaac1584LysArgLysAlaThrProThrThrSerSerThrSerThrThrAlaLys515520525gcaaaaaacgtaagetgt1602ArgLysLysArglysLeu530<210>2<211>534<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述病毒衣殼嵌合蛋白HPV16LI-PD<400〉2MetSerTyrTyrHisHisHisHisHisHisAspTyrAsplieProThr151015ThrGluAsnLeuTyrPheGinGlyAlaSerLeuTrpLeuProSerGlu202530AlaThrValTyrLeuProProValProValSerLysValValSerThr354045AspGluTyrValAlaArgThrAsnlieTyrTyrHisAlaGlyThrSer505560ArgLeuLeuAlaValGlyHisProTyrPheProlieLysLysProAsn65707580AsnAsnLysValLeuValProLysValSerGlyLeuGinTyrArgVal859095PheArglieHisLeuProAspProAsnLysPheGlyPheProAspThr100105110SerPheTy.rAsnProAspThrGinArglxuValTrpAlaCysValGly115120125ValGluValGlyArgGlyGinProLeuGlyValGlylieSerGlyHis130135140ProLeuLeuAsnLysLeuAspAspThrGluAsnAlaSerAlaTyrAla145150155160AlaAsnAlaGlyValAspAsnArgGluCyslieSerMetAspTyrLys165170175GinThrGinLeuCysLeulieGlyCysLysProProlieGlyGluHis180185190TrpGlyLysGlySerProCysThrAsnValAlaValAsnProGlyAsp195200205CysProProLeuGluLeulieAsnThrVallieGinAspGlyAspMet210215220ValAspThrGlyPheGlyAlaMetAspPheThrThrLeuGinAlaAsn225230235240LysSerGluValProLeuAsplieCysThrSerlieCysLysTyrPro245250255AspTyrlieLysMetValSerGluProTyrGlyAspSerLeuPhePhe260265270TyrLeuArgArgGluGinMetPheValArgHisLeuPheAsnArgAla275280285GlyAlaAspTrpGluTyrSerValGlyGluAsnValProAspAspLeu290295300TyrlieLysGlySerGlySerThrAlaAsnLeuAlaSerSerAsnTyr305310315320PheProThrProSerGlySerMetValThrSerAspAlaGinliePhe325330335AsnLysProTyrTrpLeuGinArgAlaGinGlyHisAsnAsnGlylie340345350CysTrpGlyAsnGinLeuPheValThrValValAspThrThrArgSer355360365ThrAsnMetSerLeuCysAlaAlalieSerThrSerGluThrThrTyr370375380LysAsnThrAsnPheLysGluTyrLeuArgHisGlyGluGluTyrAsp385390395400LeuGinPheliePheGinLeuCysLyslieThrLeuThrAlaAspVal405410415MetThrTyrlieHisSerMetAsnSerThrlieLeuGluAspTrpAsn420425430PheGlyLeuGinProProProGlyGlyThrLeuGluAspThrTyrArg435440445PheValThrSerGinAlalieAlaCysGinArgHisThrProProAla450455460ProLysGluAspProLeuLysLysTyrThrPheTrpGluValAsnLeu465470475480LysGluLysPheSerAlaAspLeuAspGinPheProLeuGlyArgLys485490495PheLeuLeuGinAlaGlyLeuLysAlaLysProLysPheThrLeuGly500505510LysArgLysAlaThrProThrThrSerSerThrSerThrThrAlaLys515520525ArgLysLysArgLysLeu530<210>3.<211〉30<212〉DM<213>人工序列<220><223>人工序列的描述外側(cè)正向引物F<400>3agatctgccaccatgtctctttggctgcct30<210>4<211>30<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223>人工序列的描述外側(cè)反向引物R<400〉4atgtcgtactaccatcaccatcaccatcac30<210>5<211〉28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述誘變引物Fm<400〉5aagctttttacagcttacgttttttgcg28<210>6<211>28<212〉腿<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述i秀變引物Rm<權(quán)〉6aactgctaaacgcaaaaaacgtaagctg28<210〉7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述上游引物I<400>7ggggcgcctctctttggctgcctagtgag29<210>8<211>29.<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述下游引物I<400>8ggctcgagttacagcttacgttttttgcg29權(quán)利要求1.病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-PD，具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。2.權(quán)利要求1所述的病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。的編碼基因，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。3.權(quán)利要求1所述的病毒衣殼嵌合蛋白HPV16LI-P。的制備方法，包括以下步驟a.HPV16Ll-P。基因的構(gòu)建以野生型HPV16LI基因?yàn)槟０?，采用重疊延伸PCR法在HPV16LI基因的798/799位堿基之間插入編碼P。肽的4tt序列，引物設(shè)計如下外側(cè)正向引物F如SEQIDNo.3所示，外側(cè)反向引物R如SEQIDNo.4所示，誘變引物Fm如SEQIDNo.5所示，誘變引物Rm如SEQIDNo.6所示；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，純化約1600bp的目的片段，將所得目的片段克隆入pCRII-TOPO載體，再轉(zhuǎn)化入DH5cx大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用含氨節(jié)青霉素的LB平板篩選陽性克隆菌，提取質(zhì)粒，采用酶切和PCR法鑒定陽性克隆質(zhì)粒并測序，獲得1602bp的HPV16L1-Pd基因，具有如SEQIDNo.1所示的核香酸序列；b.HPV16Ll-P?；虻目寺∫圆襟Ea所得陽性克隆質(zhì)粒為模板，PCR法擴(kuò)增HPV16L1-Pd基因，引物設(shè)計如下上游引物I如SEQIDNo.7所示，下游引物I如SEQIDNo.8所示；PCR產(chǎn)物按照步驟a所述方法再次進(jìn)行鑒定，純化，克隆，轉(zhuǎn)化，篩選，鑒定，測序等一系列過程，確認(rèn)克隆HPV16Ll-P。基因的順序正確性；c.重組載體pFastBacDualHPV16LI-P。的構(gòu)建將步驟b所得陽性克隆質(zhì)粒用Ehel和Xhol進(jìn)行雙酶切，得到HPV16L1-PD基因片段，再克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual，獲得重組載體pFastBacDualHPV16L1—PD;d.含有HPV16L1-P?；虻闹亟M桿狀病毒的制備按照BaculoGold轉(zhuǎn)染試劑盒說明操作，將步驟c構(gòu)建的重組載體pFastBacDualHPV16L1-P。與桿狀病毒線性DM即BaculoGoldDNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，經(jīng)胞內(nèi)同源重組獲得含有HPV16L1-P?；虻闹亟M桿狀病毒；轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞于溫度27。C培養(yǎng)3天，收集培養(yǎng)上清作為病毒原液；e.昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和HPV16Ll-P。的純化將步驟d所得病毒原液感染Sf9細(xì)胞，置溫度27。C培養(yǎng)3天，收集受染細(xì)胞；將受染細(xì)胞沉淀重懸于磷酸鹽緩沖液即PBS中，超聲破壁，低速離心收集上清，轉(zhuǎn)移至盛有質(zhì)量百分濃度為40。/。的蔗糖溶液的離心管中，超速離心收集沉淀，再以CsCl密度梯度超速離心，收集管中浮密度為l.34g/ml的白色蛋白條帶，即得病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-Pd。4.權(quán)利要求1所述的病毒衣殼嵌合蛋白HPV16Ll-P。作為基因或藥物靶向載體的應(yīng)用。5.權(quán)利要求l所述的病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。作為疫苗遞送工具的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。作為疫苗遞送工具的應(yīng)用，其特征在于所述HPV16Ll-P。作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡疫苗遞送工具的應(yīng)用。7.系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療性偽病毒疫苗，其特征在于所述疫苗是以權(quán)利要求l所述的病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。包裹B細(xì)胞特異性啟動子IgK控制下的白喉毒素A鏈即DT-A基因表達(dá)型質(zhì)粒DNA分子，自組裝而成的模擬天然病毒樣結(jié)構(gòu)的偽病毒。8.采用權(quán)利要求1所述的病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療性偽病毒疫苗的方法，包括以下步驟a.病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P。的制備按照權(quán)利要求3所述方法進(jìn)行制備；b.重組載體pcDNA3IgKDT-A的制備pTHA45.載體含有IgKDT-A基因片^爻，以ApaI及BglII雙酶切pTHA45載體，切膠回收純化IgKDT-A基因片段，再與經(jīng)同樣雙酶切消化的pcDNA3載體進(jìn)行連接，獲得重組載體pcDNA3IgKDT-A;c.系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療性偽病毒疫苗的制備取步驟a所得病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-PD,加入變性劑使蛋白變性，再加入步驟b所得重組載體pcDNA3IgKDT-A，于PBS中透析過夜，使變性蛋白逐漸復(fù)性，在復(fù)性過程中HPV16Ll-P。包裹重組載體pcDNA3IgKDT-A,自組裝形成模擬天然病毒樣結(jié)構(gòu)的偽病毒疫苗。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了病毒衣殼嵌合蛋白HPV16L1-P_D及其制備方法和用途；HPV16L1-P_D具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，其編碼基因具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；HPV16L1-P_D的制備方法包括HPV16L1-P_D基因的構(gòu)建，HPV16L1-P_D基因的克隆，重組載體pFastBacDualHPV16L1-P_D的構(gòu)建，含有HPV16L1-P_D基因的重組桿狀病毒的制備，昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和HPV16L1-P_D的純化等多個步驟；HPV16L1-P_D可作為基因或藥物靶向載體以及疫苗遞送工具，可用于制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療性偽病毒疫苗。文檔編號C07K14/025GK101314615SQ20081006988公開日2008年12月3日申請日期2008年6月25日優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日發(fā)明者吳玉章,曌楊,王惠明申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)