一種重組基因vii型新城疫多表位疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，主要涉及一種重組基因VII型新城疫多表位 疫苗制備與應用。具體地，利用基因重組技術(shù)，將與新城疫病毒感染有關(guān)的兩個主要囊膜糖 蛋白：融合蛋白（F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN)及核衣殼蛋白（NP)的B細胞表位、Th 表位以及CTL表位串聯(lián)，并克隆入載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過發(fā)酵、純化、乳化工藝制備，得到 重組新城疫多表位疫苗以及該疫苗在預防新城疫中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] NDV屬于副粘病毒科，副粘病毒屬病毒，是由NDV(NewcastleDiseaseVirus)引起 的侵害禽類的一種高度接觸性、急性、烈性傳染病，是威脅世界養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，被 國際獸疫局（OIE)列為A類傳染病，可感染大多數(shù)禽類。我國于1948年首次分離到NDV，至 今ND在我國全國范圍內(nèi)發(fā)病仍然比較普遍，制約著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展及禽產(chǎn)品的出口，也 對食品安全及人類健康存在潛在的危害。盡管新城疫免疫接種已經(jīng)普及多年并己基本上控 制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍時有發(fā)生。
[0003] 基因VII型NDV自20世紀80年代早期就已經(jīng)在東亞流行（Aldous.etal.，2003)。 1995年，我國臺灣地區(qū)暴發(fā)了嚴重的ND大流行，Yang等證實了基因VII型NDV是造成臺灣 1995年至今ND流行的主要病原。嚴維巍等首次報道了基因VII型在大陸的存在。LiuXF 等對1985-2001年中國部分地區(qū)雞群和鵝群中分離到的新城疫毒株基因型分析發(fā)現(xiàn)，29株 NDV中有14株屬于基因VII型；Qin等從我國1996-2005年全國各個地區(qū)雞，鴨、鵝體內(nèi)分 離到30株NDV，其中17株屬于基因Vll型；LiuHL等對2005年NDV分離株分析發(fā)現(xiàn)，基 因VII型毒株占分離總數(shù)的77%;Zhangrui等根據(jù)我國2001-2009年分離到的17株NDV 發(fā)現(xiàn)基因VII型NDV所占的比重呈逐年上升的趨勢。隨著時間的推移，基因VII型分離株 逐漸變?yōu)閮?yōu)勢毒株。
[0004] 新城疫病毒是有囊膜的單股負鏈RNA病毒，基因組為15kb，編碼至少六種蛋白，順 序為3' -NP-P-M-F-HN-L-5'，分別為核衣殼蛋白（NP蛋白）、磷蛋白（P蛋白）、基質(zhì)蛋白（M 蛋白）、融合蛋白（(F蛋白）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN蛋白）、大分子蛋白（(L蛋白）。NDV 中有兩個主要的成分-融合蛋白（F)和血凝素一神經(jīng)氨酸酶（HN)都與病毒感染有關(guān)。HN 介導病毒與宿主細胞受體的結(jié)合，使病毒吸附到細胞膜上；F介導病毒囊膜與宿主細胞漿 膜的融合，促進病毒的穿入，還可以促進病毒在細胞間的感染。F和HN均是病毒囊膜上的糖 蛋白，均能產(chǎn)生中和抗體，都是重組疫苗的候補對象。研究人員發(fā)現(xiàn)將NDVF和HN基因插 入FPV中構(gòu)建重組病毒，F(xiàn)PV-NDV-F和FPV-NDV-HN均可提供對發(fā)病和死亡的保護。Iritani 等（1991)證明常規(guī)NDV疫苗和重組FPV-NDV結(jié)合使用比單獨使用免疫效果好，Taylor等 (1996)構(gòu)建了表達NDVF和HN基因的重組禽痘病毒，無論將其用于SPF雞還是商品雞都能 有效的保護雞抵抗強毒的攻擊。
[0005] F蛋白是NDV中功能最多的蛋白之一，位于病毒的囊膜上，由1792bp組成，成熟 的F蛋白由553個氨基酸殘基組成，主要負責病毒囊膜與細胞膜的融合，是病毒感染細胞 所必須的重要成分。在病毒的長期進化過程中，F(xiàn)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能保持著高度的穩(wěn)定性，Toyoda等對多株NDV的F蛋白的氨基酸序列進行了比較，結(jié)果表明相互之間保守程度很高， 同源性可達到89. 3%~99. 6%。其與病毒的感染作用密切相關(guān)，對病毒的毒力發(fā)揮決定作 用，但不是唯一的決定因子。F蛋白含有三個已知的抗原表位，分別在161、72、343氨基酸 殘基處，Leu-343位于Fl亞基C末端，這個部位高度保守并且含有大量的半胱氨酸，該表位 在病毒的抗原性以及結(jié)構(gòu)和功能上起重要作用。Fl和F2的裂解位點之間有一個半胱氨酸 殘基，有利于位于F2親水區(qū)的位點Asp-72同F(xiàn)lN末端接近，形成與抑制融合相關(guān)的抗原表 位。位點Thr-161位于FlN端，與前兩個位點相比，該區(qū)的親水性較低，被認為是病毒的融 合體，它使病毒與細胞之間通過疏水作用而融合大多數(shù)毒株F蛋白氨基酸的變異集中在信 號肽區(qū)（1~32aa)，因此，它不是F蛋白功能區(qū)的組成成分。最重要的差異存在于F蛋白的 裂解區(qū)域（112_117aa)，其氨基酸序列及裂解能力是決定病毒毒力的關(guān)鍵，F(xiàn)O蛋白對蛋白 水解酶的敏感性與其毒力強弱呈正相關(guān)。
[0006]HN蛋白是NDV除F蛋白之外另一種較大表面的糖蛋白，HN蛋白是一種纖突狀糖蛋 白，具有多種生物學功能，同時具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性。成熟的HN是一種四聚體寡 聚蛋白。亞單位之間通過二硫鍵相連形成二聚體，兩個二聚體非共價結(jié)合形成四聚體。HN 蛋白是以氨基酸作為跨膜區(qū)的，不同NDV毒株HN蛋白的氨基酸序列差異主要集中在氨基 端。HN蛋白的胞外區(qū)可以分為兩個區(qū)域：一是靠近囊膜的柄狀區(qū)，另一為末端球狀區(qū)。球 狀區(qū)上面分布了受體結(jié)合位點和神經(jīng)氨酸酶活性位點，但對柄狀區(qū)的幾個保守氨基酸進行 突變，也會影響這種生物學功能。Stone-Huslande等研究表明，HN蛋白的促進融合功能與 HN和F蛋白間七肽重復序列的互動有關(guān)。
[0007]NP蛋白基因長度為1746bp，共編碼489個氨基酸，分子量為56kD。NP蛋白是保守 性相對較高的一個，NP基因在基因組中的位置正好是靠近病毒基因組RNA的位置，其與病 毒的復制繁殖密切相關(guān)（Peetersetal. 2000!Phillipsetal. 1998)。NP上分布了三類 活性位點，即P蛋白結(jié)合位點、NP-NP相互結(jié)合位點和與RNA結(jié)合的位點。NP蛋白可能是病 毒轉(zhuǎn)錄與復制的切換因子，感染細胞內(nèi)游離NP的濃度是控制病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復制的主要因 素。NDV基因組的3'端和5'端均有一段RNA序列作為衣殼化信號。P蛋白通過和NP蛋白 之間的相互作用，抑制NP對不含引導序列RNA的結(jié)合，這種作用還提供了可溶性的Np蛋白 來對新合成的RNA衣殼化。在NDV的多個蛋白中，隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，NP基因 的研究價值越來越受到眾多學者的重視。Kho等用體外蛋白結(jié)合試驗證明P蛋白發(fā)生結(jié)合 的位點位于NP蛋白N端的前25個氨基酸區(qū)域，并且NP-P蛋白在此區(qū)域的結(jié)合是相當牢固 的。Ahmad-Raus等用一組單抗分析了NP蛋白上的抗原位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NP蛋白上存在3個 抗原位點，一個位于NP蛋白C端441-489位氨基酸，另外兩個在N端26-121位和122-375 位氨基酸之間。王同燕（2009)運用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建重組病毒的試驗表明，決定NDV毒力 的區(qū)域主要位于NP基因的編碼區(qū)，并且是NP基因的保守區(qū)位置。
[0008] 活疫苗一般由感染胚尿囊液凍干而成，它可以大規(guī)模飲水免疫，經(jīng)濟實惠，也可用 于噴霧和氣霧，在短時間內(nèi)免疫大量雞。Bl株和LaSota株是天然弱毒株，幾乎無致病性，可 作為緩發(fā)型疫苗，經(jīng)滴鼻，點眼，飲水，氣霧等途徑接種免疫，能達到較好的保護效果。而H 株、Roakin株等屬中發(fā)型的疫苗，由于毒力較強，只能用于二次免疫。也有用CS2株、V4株 等作活疫苗的，也能達到良好的免疫效果?；畈《靖腥灸艽碳C體產(chǎn)生局部免疫，免疫后可 較快的得到保護，一般接種后3~5天就能產(chǎn)生抗體，抗體一般可維持20~30天。
[0009]滅活苗一般是由滅活的感染性尿囊液與載體佐劑混合后而制得的。目前，廣泛使 用的滅活苗為油乳劑滅活苗，多用Ulster2e，Bl，LaSota及Rokin等作毒種來生產(chǎn)，這些毒 株均能在雞胚中大量增殖，并且在實際生產(chǎn)中也多用來制造二聯(lián)苗或多聯(lián)疫苗。滅活苗能 夠刺激機體產(chǎn)生有效的免疫應答反應，使抗體以較高的水平在體內(nèi)持續(xù)較長時間，易于儲 存，使用多聯(lián)苗可以節(jié)省勞動力，免疫效力受母源抗體影響較小，免疫后副作用小。但注射 劑量和疫苗對免疫效果有很大的影響，由于滅活疫苗中需要添加佐劑，所以大大提高了免 疫的成本。同時，接種滅活苗的機體產(chǎn)生針對病毒的特異性抗體，干擾了臨床檢測和檢疫以 及流行病學調(diào)查，這是以滅活苗防治ND的最大障礙。
[0010] 抗原表位（epitope)又稱做抗原決定簇（antigendeterminant)，由參與抗原抗 體分子間鍵形成的部分氨基酸殘基組成，是抗原的核心組成部分，是能夠被抗體分子或T 細胞受體（Tcellreceptor，TCR)識別抗原的特定區(qū)域。被Ab識別的抗原表位成為B細 胞抗原表位，被TCR/MHC復合體識別的抗原表位稱為T細胞抗原表位。這些表位是抗原性 產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上提出了表位疫苗。表位疫苗存在著不需要分離傳染性病原體、 不會散毒、減少不同免疫優(yōu)勢抗原表位的互相干擾等優(yōu)點。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明以基因VII型新城疫病毒主要表面糖蛋白：融合蛋白（F)、神經(jīng)氨酸酶（HN) 以及核衣殼蛋白（NP)B細胞表位、Th表位、CTL表位作為疫苗框架結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌中表達 后，經(jīng)過蛋白純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的重組基因VII型新城疫多表位疫 苗。本疫苗免疫靶動物后可誘導有效的體液免疫和細胞免疫反應。
[0013] 本發(fā)明的目的之一在于提供了一種新的能用于預防基因VII型新城疫的重組多 表位疫苗多肽及其疫苗組合物；本發(fā)明的目的之二在于提供了所述新城疫多表位疫苗的構(gòu) 建及獲得方法；本發(fā)明的目的之三在于提供了能夠表達所述新城疫多表位疫苗的基因工程 菌株；本發(fā)明的目的之四在于提供了所述多表位疫苗的制備方法；本發(fā)明的目的之五在于 提供了所述新城疫多表位疫苗在預防基因VII型新城疫中的用途。
[0014] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于預防的重組基因VII型新城疫多表位疫苗多 肽及其組合物