Muc1和gm-csf雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種MUC1和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MUC1基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MUC1基因；所述MUC1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本發(fā)明所述的雙基因共表達(dá)重組載體，采用IRES序列來(lái)連接MUC1基因和GM-CSF基因，能夠在同一載體中同時(shí)表達(dá)人上皮粘蛋白以及粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子，該重組載體可用于腫瘤的基因免疫治療，既能發(fā)揮細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
【專利說(shuō)明】MUC1和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及一種雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的數(shù)據(jù)顯示，每年全球約800萬(wàn)人死于癌癥。我國(guó)近20年來(lái)癌癥呈現(xiàn)年輕化及發(fā)病率和死亡率“三線”走高的趨勢(shì)。全國(guó)腫瘤登記中心發(fā)布的《2012中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》顯示，每年新發(fā)腫瘤病例約為312萬(wàn)例，平均每天8550人,全國(guó)每分鐘有6人被診斷為癌癥,全國(guó)腫瘤死亡率為180.54/10萬(wàn)，每年因癌癥死亡病例達(dá)270萬(wàn)例。[0003]腫瘤免疫治療技術(shù)以現(xiàn)代分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子免疫學(xué)等前沿科學(xué)為基礎(chǔ)，利用機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答,通過(guò)生物手段改變腫瘤和機(jī)體之間的相互作用,調(diào)動(dòng)機(jī)體對(duì)腫瘤的防御機(jī)制，達(dá)到控制腫瘤生長(zhǎng)，提高患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存期的目的，是繼手術(shù)、放療、化療后第四種腫瘤治療模式，也是腫瘤綜合治療的重要組成部分。
[0004]腫瘤免疫治療的目的，不僅要有效激活消除腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，還要建立起長(zhǎng)遠(yuǎn)的抗腫瘤記憶效應(yīng)。腫瘤免疫治療包括兩個(gè)主要的策略:非特異性輔助免疫治療和抗原特異性免疫治療。非特異性輔助免疫治療，是通過(guò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)或局部細(xì)胞因子或共刺激分子的濃度來(lái)刺激免疫系統(tǒng)?？乖禺愋悦庖咧委?，包括抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)、表達(dá)和呈遞，抗原激活的T細(xì)胞的遷移，以及采用抗原負(fù)載的DC細(xì)胞治療等。
[0005]研究表明，通過(guò)載體表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原并共表達(dá)細(xì)胞因子或共刺激分子，表現(xiàn)出相互協(xié)同促進(jìn)的作用，有助于誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。由此可見(jiàn)，要誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫應(yīng)答，不僅需要腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)和呈遞，還需要增強(qiáng)共刺激分子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫作用。在多數(shù)研究中，抗腫瘤免疫應(yīng)答的效果與共表達(dá)的免疫促進(jìn)型細(xì)胞因子和共刺激分子的數(shù)目呈正相關(guān)。
[0006]細(xì)胞因子基因免疫是目前腫瘤基因治療研究的熱點(diǎn)，將具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子基因?qū)胨拗黧w內(nèi)，并使之穩(wěn)定有效地表達(dá)，使體內(nèi)持續(xù)存在一定水平的內(nèi)源性細(xì)胞因子，以發(fā)揮抗腫瘤的作用。然而，現(xiàn)有的細(xì)胞因子基因免疫治療方法只是提高機(jī)體免疫能力，增強(qiáng)共刺激分子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫作用，無(wú)法實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)和呈遞。
[0007]粒細(xì)胞-巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophageColony StimulatingFactor, GM-CSF)是由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生并分泌的一種酸性糖蛋白。GM-CSF是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，廣泛參與機(jī)體的造血、免疫及抗感染等過(guò)程，對(duì)感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展有重要影響。GM-CSF作為目前已知功能最強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)分子，在增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫功能方面顯示了良好的應(yīng)用前景，并被廣泛應(yīng)用于腫瘤的免疫治療。GM-CSF可通過(guò)以下機(jī)制參與免疫調(diào)節(jié):(I)提高腫瘤細(xì)胞MHC分子的表達(dá)；(2)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟、分化并增強(qiáng)抗腫瘤體液免疫；(3)上調(diào)共刺激分子CD86表達(dá)，逆轉(zhuǎn)T淋巴細(xì)胞免疫耐受；(4)促進(jìn)效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)在腫瘤部位浸潤(rùn)，殺傷腫瘤細(xì)胞。GM-CSF可作為化療的輔助用藥，提升腫瘤患者外周血白細(xì)胞水平(主要為粒細(xì)胞與單核細(xì)胞數(shù)量)的同時(shí)，誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)活化，加強(qiáng)對(duì)腫瘤的免疫。除上述生物學(xué)效應(yīng)外，GM-CSF還能增加腫瘤基質(zhì)分泌血管生成抑制素，抑制腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移。GM-CSF的抗腫瘤作用受到廣泛共識(shí)，并已經(jīng)正式開(kāi)始運(yùn)用于臨床腫瘤免疫治療。GM-CSF的基因治療及基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗在研究中同樣顯示了抗腫瘤作用。GM-CSF以其顯著的免疫調(diào)節(jié)作用和低毒性成為腫瘤疫苗重要的免疫佐劑，轉(zhuǎn)染GM-CSF基因的腫瘤疫苗在傷口愈合、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等基礎(chǔ)和臨床研究中均取得了顯著效果。然而，目前的GM-CSF基因免疫治療方法只是局部地提高機(jī)體的GM-CSF蛋白表達(dá)水平，其免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤能力較小，而且缺乏免疫治療的靶向性。
[0008]粘蛋白(Mucins，MUC)在正常人體內(nèi)主要存在于胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道以及乳腺等多種上皮組織中，對(duì)正常的上皮起潤(rùn)滑和保護(hù)作用，同時(shí)還介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞粘附。而在腫瘤組織中，MUC多出現(xiàn)異常表達(dá)，表現(xiàn)為量和質(zhì)的改變，并且與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。
[0009]人上皮黏蛋白(MUCl)是由MUCl基因表達(dá)的粘蛋白家族中的一種I型跨膜蛋白，其多肽骨架主要由胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段組成，胞外區(qū)由可變數(shù)目(20~125個(gè))串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number Tandem Repeats, VNTR)組成,抗原表位即位于VNTR區(qū)。此種肽鏈表位在正常表達(dá)時(shí)，被外周糖鏈所掩蓋，不能被識(shí)別；在癌變時(shí)，由于糖基轉(zhuǎn)移酶活性增高導(dǎo)致不完全糖基化，不完全糖基化又導(dǎo)致側(cè)鏈變短及核心膚暴露，顯現(xiàn)出相關(guān)膚抗原表位、糖抗原表位，從而獲得免疫原性。MUCl已確定在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]基于此，有必要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，該重組載體可用于腫瘤的基因免疫治療，既能發(fā)揮細(xì)胞因子的的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供所述MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法。
[0012]本發(fā)明的再一個(gè)目的是，提供所述MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體在腫瘤的基因免疫治療中的應(yīng)用。
[0013]MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MUCl基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MUCl基因；所述MUCl基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示。
[0014]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為PIRES2-MUC1-GM-CSF重組載體；其中，MUCl基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。
[0015]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體中的EGFP序列被GM-CSF基因替代。
[0016]本發(fā)明所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0017]I)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段；
[0018]2)將步驟I)得到的MUCl基因片段連接于載體，構(gòu)建含有MUCl基因的重組載體； [0019]3)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段；
[0020]4)將步驟3)得到的GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體。
[0021]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的pIRES2-MUCl-GM-CSF重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0022]a)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段:從乳腺癌細(xì)胞MCF-7獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點(diǎn)序列的MUCl特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；
[0023]b)構(gòu)建pIRES2-MUCl-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶Bgl I1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的MUCl基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到pIRES2-MUCl-EGFP重組載體；
[0024]c)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一種GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；
[0025]d)構(gòu)建pIRES2-MUCl-GM-CSF重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstX 1、Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-MUCl-EGFP重組載體，將步驟c)得到的GM-CSF基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-MUC1-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-MUC1-GM-CSF 重組載體。
[0026]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟a)所述的MUCl特異性引物為:
[0027]MUCl 上游引物:5’ -GAAGATCTATGACACCGGGCACCC-3’，
[0028]MUCI 下游引物:5 ’ -TTGAATTCCTACAAGTTGGCAGAAGTGG-3 ’。
[0029]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟c)所述的GM-CSF特異性引物包括GM-CSF第一引物對(duì)和GM-CSF第二引物對(duì)，所述的GM-CSF第一引物對(duì)由GM-CSF上游長(zhǎng)引物和GM-CSF下游長(zhǎng)引物組成，所述的GM-CSF第二引物對(duì)由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物組成:
[0030]GM-CSF第一引物對(duì)為:
[0031 ] GM-CSF 上游長(zhǎng)弓丨物:5’ -AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’，
[0032]GM-CSF 下游長(zhǎng)引物:5’-GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’ ；
[0033]GM-CSF第二引物對(duì)為:
[0034]GM-CSF 上游短引物:5’ -ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’，
[0035]GM-CSF 下游短引物:5’ -GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’。
[0036]本發(fā)明所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體在腫瘤基因免疫治療中的應(yīng)用。[0037]在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染腫瘤患者自身或異體分離的樹(shù)突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，進(jìn)行腫瘤基因免疫治療。
[0038]本發(fā)明所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，采用IRES序列來(lái)連接MUCl基因和GM-CSF基因，能夠在同一載體中同時(shí)表達(dá)人上皮粘蛋白(MUCl)以及粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，可減少基因載體的用量，減少非治療相關(guān)的外源基因序列的引入。其中，MUCl是腫瘤靶向性的相關(guān)抗原，GM-CSF是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，兩者聯(lián)合使用，既可以發(fā)揮細(xì)胞因子的的免疫調(diào)節(jié)作用，又可以靶向性地產(chǎn)生特異性的抗腫瘤效應(yīng)，從而能夠獲得更好的腫瘤免疫治療效果。將雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染腫瘤患者自身或異體分離的樹(shù)突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，MUCl的大量表達(dá)，可刺激樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈MUCl多肽與MHC復(fù)合物，進(jìn)而刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性殺傷性T細(xì)胞，靶向性地殺傷表達(dá)MUCl多肽的腫瘤細(xì)胞；而GM-CSF的大量表達(dá)，能進(jìn)一步增強(qiáng)主要和次要的抗體反應(yīng)，還能誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟、分化，促進(jìn)T細(xì)胞免疫反應(yīng)，一方面增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力，另一方面作為免疫佐劑，協(xié)同擴(kuò)大抗腫瘤免疫效應(yīng)。
[0039]IRES序列是來(lái)源于某些病毒和細(xì)胞mRNA5’端的一段非翻譯區(qū)，可以不依賴帽的方式啟動(dòng)遠(yuǎn)端的mRNA翻譯，可在上游啟動(dòng)子的控制下和與之相連的基因共同轉(zhuǎn)錄，在同一轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的蛋白。IRES連接多基因進(jìn)行共表達(dá)時(shí)，多個(gè)基因的mRNA在同一條轉(zhuǎn)錄子上，但轉(zhuǎn)錄后的翻譯過(guò)程相互獨(dú)立，上游基因以傳統(tǒng)方式進(jìn)行翻譯，下游基因依靠IRES序列以不依賴帽的方式進(jìn) 行翻譯，保證了各個(gè)基因的獨(dú)立結(jié)構(gòu)及功能。利用IRES代替內(nèi)部啟動(dòng)子，不但可使多基因共表達(dá)載體大大縮小，而且還克服了傳統(tǒng)多基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子之間的相互抑制現(xiàn)象，避免融合蛋白的產(chǎn)生。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1為實(shí)施例一所得的含有特異性酶切位點(diǎn)序列的MUCl基因片段的電泳圖，其中，I為MUCl基因，M為標(biāo)記；
[0041]圖2 為 pIRES2-EGFP 質(zhì)粒圖譜；
[0042]圖3為實(shí)施例二所得的PIRES2-MUC1-EGFP重組載體圖譜；
[0043]圖4為實(shí)施例二所得的pIRES2-MUCl-EGFP重組載體的PCR鑒定電泳圖，其中，I為PCR反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0044]圖5為實(shí)施例二所得的PIRES2-MUC1-EGFP重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0045]圖6為實(shí)施例三所得的帶有限制性內(nèi)切酶粘性末端的GM-CSF基因片段的電泳圖，其中，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A，2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B，M為標(biāo)記；
[0046]圖7為實(shí)施例三所述的雜交PCR反應(yīng)的流程圖；
[0047]圖8為實(shí)施例四所得的PIRES2-MUC1-GM-CSF重組載體圖譜；
[0048]圖9為實(shí)施例四所得的PIRES2-MUC1-GM-CSF重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，
I為Bgl II/EcoR 1雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，2為EcoR I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，3為Bgl I I/NotI雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記。
【具體實(shí)施方式】[0049]下述實(shí)施例中，所用到的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，例如PCR技術(shù)、引物設(shè)計(jì)技術(shù)、載體構(gòu)建技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)、電泳技術(shù)等均為基因工程中的常規(guī)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社第三版；或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。在操作過(guò)程中所用到的設(shè)備、試劑、載體、菌株等，均為通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買得到的常規(guī)產(chǎn)品。
[0050]實(shí)施例一:獲取含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段
[0051]1、引物設(shè)計(jì)
[0052]根據(jù)MUCl基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)以及pIRES2_EGFP質(zhì)粒載體上預(yù)期插入的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物如下:
[0053]MUCl上游引物(如序列表中SEQ ID NO: 4所示):
[0054]5? -GAAGATCTATGACACCGGGCACCC-3?(下劃線部分為 Bgl II 酶切位點(diǎn)序列)，
[0055]MUCl下游引物(如序列表中SEQ ID NO: 5所示):
[0056]5，-TTGAATTCCTACAAGTTGGCAGAAGTGG-3，(下劃線部分為 EcoR I 酶切位點(diǎn)序列)。
[0057]2、獲取cDNA模板
[0058]TRIzon法從人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中提取RNA(TRIzon總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為CW0580)，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA (反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為RR019A)。
[0059]3、獲取含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段
[0060]以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中提取的RNA所反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在上述含有特異性酶切位點(diǎn)的上、下游引物的作用下，通過(guò)PCR反應(yīng)獲得MUCl基因片段，其上游含有Bgl II酶切位點(diǎn)序列，下游含有EcoR I酶切位點(diǎn)序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果如圖1所示。
[0061]PCR反應(yīng)體系如下(50 μ L):
【權(quán)利要求】
1.MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MUCl基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MUCl基因; 所述MUCl基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于:所述的載體為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為pIRES2_MUCl-GM_CSF重組載體；其中，MUCl基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于:所述PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體中的EGFP序列被GM-CSF基因替代。
4.權(quán)利要求1所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟: O獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段； 2)將步驟I)得到的MUCl基因片段連接于載體，構(gòu)建含有MUCl基因的重組載體； 3)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段； 4)將步驟3)得到的GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體。
5.權(quán)利要求2所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟: a)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段:從乳腺癌細(xì)胞MCF-7獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點(diǎn)序列的MUCl特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有BglII和EcoR I酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； b)構(gòu)建pIRES2-MUCl-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶BglI1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的MUCl基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到pIRES2-MUCl-EGFP重組載體； c)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一種GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； d)構(gòu)建pIRES2-MUCl-GM-CSF重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstX1、Not I酶切步驟b )得到的PIRES2-MUC1-EGFP重組載體，將步驟c )得到的GM-CSF基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-MUC1-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-MUC1-GM-CSF 重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟a)所述的MUCl特異性引物為: MUCl 上游引物:5’ -GAAGATCTATGACACCGGGCACCC-3’， MUCl 下游引物:5’ -TTGAATTCCTACAAGTTGGCAGAAGTGG-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟c)所述的GM-CSF特異性引物包括GM-CSF第一引物對(duì)和GM-CSF第二引物對(duì)，所述的GM-CSF第一引物對(duì)由GM-CSF上游長(zhǎng)弓丨物和GM-CSF下游長(zhǎng)引物組成，所述的GM-CSF第二引物對(duì)由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物組成: GM-CSF第一引物對(duì)為: GM-CSF 上游長(zhǎng)引物:5’ -AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’， GM-CSF 下游長(zhǎng)引物:5’ -GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’ ； GM-CSF第二引物對(duì)為: GM-CSF 上游短引物:5’ -ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’， GM-CSF 下游短引物:5’ -GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’。
8.權(quán)利要求1或2所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體在腫瘤基因免疫治療中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:將所述的MUCl和GM-CSF雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染腫瘤患者自身或異體分離的樹(shù)突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，進(jìn)行腫瘤基因免疫治療。`
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103602706SQ201310611552
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】曹毓琳, 左百樂(lè), 栗炳南, 連杰, 林俊堂, 豐慧根 申請(qǐng)人:河南省華隆生物技術(shù)有限公司