一種提高基因編輯后綿羊胚胎成纖維細胞同源重組修復頻率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種提高基因編輯后綿羊胚胎成纖維細胞同 源重組修復頻率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 利用人工核酸內(nèi)切酶化ngineered endonuclease,EEN)，如鋒指酶（Zinc finger nucleases，ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（Transcription activator-l ike effector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palin化omic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated 9(Cas9))，定點切割基因組，產(chǎn)生特 定位點基因組雙鏈斷裂化ouble-strand brakes,DSBs)或缺克(化cks)，促進精確編輯哺乳 動物基因組的研究。
[0003] 細胞主要通過非同源末端連接途徑(Non-homologous end joining,NHEJ)修復 DSBs，產(chǎn)生基因敲除表型。共同轉(zhuǎn)染EEN和單鏈寡核巧酸，或同源序列的供體模板，通過依賴 同源模板修復途徑，如微同源臂介導連接(Microhomology-mediated end joining,MMEJ) 和同源重組化omologous recombination,皿），精確地將外源目的基因敲入細胞基因組，實 現(xiàn)基因編輯。即使采用高效的CRISPR/tas9系統(tǒng)產(chǎn)生基因組的DSBs，細胞選擇NHEJ修復事件 的發(fā)生概率超過90%，利用同源模板的修復概率低于10%。說明多數(shù)細胞中，NHEJ遠遠超過 依賴同源模板修復事件的發(fā)生概率。
[0004] 抑制NHEJ途徑，促使細胞采用皿修復途徑，能夠提高皿修復頻率。用邸N定點斷裂 果蛹細胞基因組，RNA干擾(RNA inMbite，RNAi)瞬時抑制Lig4基因 （DNA Ligase 4，Lig4) 翻譯，PCR擴增短的左右同源臂(80和60nt)供體模板，在藥物篩選的細胞中，同源重組效率 達50%。邸N處理Lig4-/-突變體的果蛹胚胎、擬南芥，與野生型比較，同源重組效率顯著提 高。調(diào)控抑制線蟲(化enorhabditis elegans)體細胞中的Lig4蛋白因子，從而抑制NHEJ，使 有機體修復DSBs途徑轉(zhuǎn)向MMEjDBmku70蛋白是NHEJ的必須因子，敲除Bmku70基因的家蠶胚 胎，顯微注射CRISPR/Cas9系統(tǒng)質(zhì)粒和供體模板，與野生型家蠶胚胎比較，皿效率更高。SCR7 (5,6-bis(benzylideneamino)-2-mercapt〇-pyrimidin-4-〇l)特異性同人類 Li 邑 4 蛋白的 DNA結(jié)合域化NA binding domain，D抓)結(jié)合，阻斷了Lig4與DNA結(jié)合，抑制畑EJ修復途徑，提 高HR修復頻率4-5倍。
[0005] Lig4敲除的果蛹能夠正常生存，但小鼠 Lig4基因敲除表現(xiàn)為胚胎致死，至今對哺 乳動物Lig4基因敲除的研究較少。哺乳動物細胞修復DSBs的3條主要途徑:畑EJ、MMEJ和皿， 呈現(xiàn)互補競爭關(guān)系，抑制NHEJ將刺激細胞選用HR修復途徑。
[0006] Gorbunova實驗室定量研究N肥J和皿修復途徑，獲得細胞老齡化狀態(tài)不同，對基因 組DSBs修復結(jié)果不同；人類體細胞修復DSBs，主要采用NHEJ途徑，而且在細胞周期各個階段 都可W使用NHEJ;HR修復主要發(fā)生在S期。
[0007] 基因打祀技術(shù)W同源重組為基礎(chǔ)，是一種定向改變生物活體遺傳信息的實驗手 段，促進了生物學研究。正常哺乳動物細胞發(fā)生同源重組概率極低，造成基因打祀效率極低 (1〇-6)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個目的是提供抑制Lig4基因表達和/或活性的物質(zhì)的用途。
[0009] 本發(fā)明提供了抑制Lig4基因表達和/或活性的物質(zhì)在制備促進離體綿羊胚胎成纖 維細胞在基因編輯時進行同源重組修復產(chǎn)品中的應用。
[0010] 上述應用中，所述基因編輯為將經(jīng)過特定位點剪切后外源DNA分子導入離體綿羊 胚胎成纖維細胞中，使所述剪切后外源DNA分子在細胞中進行同源重組修復；
[0011] 或所述基因編輯為將外源DNA分子同源重組到經(jīng)過特定位點剪切后的離體綿羊胚 胎成纖維細胞基因組上。
[0012] 所述特定位點剪切是通過I-Scel酶切實現(xiàn)。
[0013] 上述應用中，所述抑制Lig4基因表達的物質(zhì)為用于干擾離體綿羊胚胎成纖維細胞 中Lig4基因表達的siRNA。
[0014] 上述應用中，所述siRNA的核巧酸序列為序列表中序列3或序列4。
[0015] 本發(fā)明另一個目的是一種使離體綿羊胚胎成纖維細胞在基因編輯時進行同源重 組修復頻率提高的方法。
[0016] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:抑制進行基因編輯的離體綿羊胚胎成纖維細 胞中Lig4基因表達，實現(xiàn)離體綿羊胚胎成纖維細胞在基因編輯時進行同源重組修復頻率提 局。
[0017] 上述方法中，所述抑制進行基因編輯的離體綿羊胚胎成纖維細胞中Lig4基因表達 為將用于抑制離體綿羊胚胎成纖維細胞中Lig4基因表達的物質(zhì)導入所述進行基因編輯的 離體綿羊胚胎成纖維細胞中。
[0018] 上述方法中，所述基因編輯為將經(jīng)過特定位點剪切后外源DNA分子導入離體綿羊 胚胎成纖維細胞中，使所述剪切后外源DNA分子在細胞中進行同源重組修復；
[0019] 或所述基因編輯為將外源DNA分子同源重組到經(jīng)過特定位點剪切后的離體綿羊胚 胎成纖維細胞基因組上。
[0020] 上述方法中，所述抑制離體綿羊胚胎成纖維細胞中Lig4基因表達的物質(zhì)為用于干 擾離體綿羊胚胎成纖維細胞中Lig4基因表達的siRNA;
[0021 ]所述siRNA的核巧酸序列具體為序列表中序列3或序列4。
[0022] 上述方法中，所述使離體綿羊胚胎成纖維細胞在基因編輯時進行同源重組修復頻 率提高為抑制進行基因編輯的離體綿羊胚胎成纖維細胞中Lig4基因表達的細胞同源重組 修復頻率高于進行基因編輯的離體綿羊胚胎成纖維細胞的同源重組修復頻率。
[0023] 上述外源DNA分子為HR質(zhì)粒。
[0024] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明篩選到抑制綿羊Lig4基因表達的SiRNA，通過SiRNA抑 制綿羊Lig4基因表達，抑制綿羊胚胎成纖維細胞的NHEJ修復途徑從而刺激細胞內(nèi)HR修復途 徑，提高了細胞采用HR修復的頻率，為提高綿羊胚胎成纖維細胞基因打祀效率和研究綿羊 基因組精確編輯提供基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0025] 圖1為針對綿羊Lig4基因設(shè)計的siRNA位點示意圖。
[0026] 圖2為分析HR修復途徑的報告基因結(jié)構(gòu)(a)和斷裂DNA粘性末端(b)圖。
[0027] 圖3為綿羊Lig4基因 CDS序列PCR擴增結(jié)果。
[0028] 圖 4 為pMD18T-aiLig4 菌體 PCR 檢測。
[0029] 圖5為SiRNA影響綿羊Lig4基因表達的實時巧光定量PCR結(jié)果。
[0030] 圖6為SiRNA干擾綿羊Lig4基因表達的Western blot圖。
[0031 ]圖7為HR修復載體重連巧光成像結(jié)果。
[0032] 圖8為HR修復載體重連流式細胞儀檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0033] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0034] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035] Lig4基因的核巧酸序列為序列1，編碼蛋白的氨基酸序列為序列2。
[0036] 部分材料如下：pcDNA3. 1 +載體（Invitrogen)，pMD18-T(TaKaRa)，HR 質(zhì)粒 Gorbunova實驗室惠贈，pDsRed2-Nl (Clontech)，pEGFP-Nl (Clontech)，stbl3菌種 (Invihogen)，電轉(zhuǎn)儀(Amax NucleofectorH )，流式細胞儀(BDFACSAria虹），綿羊胚胎成 纖維細胞由本實驗室原代培養(yǎng)保存。
[0037] 部分試劑如下：RealBand 10KB(0.25-10化）DNA Ladder(Cat N0.B600031-0500) 上海生工；DL 2000DNA MarkeHCat N0.3427A，TaKaRa)〇Taq DNA Polymerase(Cat NO.ETlOl-02)，小量質(zhì)粒提取試劑盒（Cat N0.DP103-02,天根生化科技有限公司）。 PrimerSTAR DNA 化lymerase(Cat N0.R045，Takara)，膠回收試劑盒（Cat N0.D2500-02， OMEGA);限制性內(nèi)切酶(Thermo Fisher) ;Lig4 單克隆抗體（（Cat NO.GTX100100，GeneTex); EasyScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(Cat N0.AT314北京全式金生物技術(shù)有限公司）；實時巧光定量PCR試劑盒(Cat N0.B639271，上海 生工)。
[0038] TrizoHCat NO. 15596-026，Invitrogen);哺乳動物蛋白抽提試劑（Cat N0.CW0889)、BCA蛋白定量試劑盒（Cat N0.CW0014)、蛋白酶抑制劑混合物（Cat N0.CW2200)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(Cat N0.CW0022)、速泳SDS-PAGE電泳緩沖液（10 X ) (Cat N0.CW2566)、蛋白示蹤上樣緩沖液（5X)(Cat N0.CW0027A)、山羊抗兔IgG 皿P(Cat N0.CW0103)、抗GAPDH兔多克隆抗體（Cat N0.CW0101)、Western Blot封閉液I(BSA)(Cat 顯.〔￥0054)、￥63*6腳抗體稀釋液（〔日*顯.〔￥2340)、高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒（〔曰* NO. CW0049B)、蛋白印跡膜再生液（Cat NO. CW0056A)購自康為世紀；15-150kDa雙色預染蛋 白Marker(化t NO.C610011)購自上海生工;耗材購自上海生工。
[0039] 實驗室用DEPC處理的水配制電轉(zhuǎn)液。Solutionl(10ml):2g ATP-Na2，1.2g MgCb* 6此0;5〇1111:;[0]111 (5001111):6邑1(出口04,