專利名稱：一種基因重組解淀粉芽胞桿菌及菌劑制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物抗病促生工程菌及菌劑制備方法，尤其是涉及一種含有透明
顫菌血紅蛋白基因的基因重組解淀粉芽胞桿菌及菌劑制備方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料的使用量逐年增加，引起環(huán)境污染、生態(tài)惡化、土壤板結(jié)和土壤退化等問題，對食品安全、人類健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了巨大的威脅和挑戰(zhàn)。因此，發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)，就要減少化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料的使用量，尋找有效的替代品。 微生物農(nóng)藥和微生物肥料，具有持效期長、不污染環(huán)境、成本低等特點，是化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料的最有效替代品。合理開發(fā)和利用微生物農(nóng)藥和微生物肥料，是我國農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要途徑。 植物根圍促生細菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，簡稱PGPR)是一種生存在植物根圈范圍中，對植物生長有促進或?qū)Σ≡修卓棺饔玫挠幸婕毦慕y(tǒng)稱。PGPR在植物根圍的聚集，可以加強土壤中有機物質(zhì)的分解，促進植物營養(yǎng)元素的礦化，增強對作物營養(yǎng)的供應(yīng)。某些PGPR菌株產(chǎn)生的植物激素可促進植物根系生長，增強根系吸收礦物營養(yǎng)和水分的能力，從而達到調(diào)控作物生長、增強抗逆性，達到提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、減少化肥使用、提高土壤肥力的目的。同時，PGPR在根圍的定殖能在一定程度上抑制作物病原菌的發(fā)生和傳播。 解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，是一種研究比較多的植物根際促生防病細菌。它能促進植物根部的生長，增強作物對非生物因素(例如高鹽分和缺水等)和生物因素(生物病原體)的耐受力，提高作物的產(chǎn)量。其運行機理是，基于通過釋放生長素和其它植物激素，如噴哚-3-乙酸(IAA)，剌激和推動作物生長；同時能產(chǎn)生胞外植酸酶分解土壤中的植酸為植物提供生長必需的磷，還能產(chǎn)生嗜鐵素(Siderophore)向植物提供鐵_嗜鐵素復(fù)合體，從而增加植物對鐵營養(yǎng)的吸收，還能產(chǎn)生固氮酶，可將根圍的氮素供給作物；此外，還能對作物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced systemic resistance, ISR)，提高對植物病蟲害的抗性，同時還能分泌幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶以及次生代謝產(chǎn)物表面活性素(surfcatin)、伊枯草菌素(iturin)、芬薺素(fengycin)和桿菌抗霉素Bacillomycin D等脂肽類抗生素，起到預(yù)防植物病害和抑制植物病原菌作用。 解淀粉芽胞桿菌是一種高好氧細菌，在其工業(yè)發(fā)酵中后期，由于菌體密度過大造
成供氧不足，影響菌體的生長以及次生脂肽類抗生素的合成。此外，在施入土壤后，如果土
壤中氧氣含量低，會影響該菌體的生長和定殖能力，進而影響其防病促生效果。透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是由透明顫菌屬
(Vitreoscilla sp.)產(chǎn)生的一種可溶性血紅蛋白，這種血紅蛋白能在貧氧條件下被大量誘
導(dǎo)合成，使透明顫菌在微氧條件下能夠很好地生存。透明顫菌血紅蛋白已經(jīng)被成功克隆到
多種細菌中，VHb的表達提高了宿主的耐低氧能力，提高了菌體的密度和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。2008年華中農(nóng)農(nóng)業(yè)大學(xué)的馮亮等將vgb基因轉(zhuǎn)入蘇云金芽胞桿菌后，低氧發(fā)酵條件下其菌體數(shù)量和殺蟲晶體蛋白產(chǎn)量分別提高了 1. 59倍和3. 13倍，1996年，Pay li等將vgb基因轉(zhuǎn)入產(chǎn)淀粉酶枯草芽胞桿菌1012M15后，其發(fā)酵后菌體數(shù)量和淀粉酶活力分別提高了 30%和17%。 2000年，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的文瑩等將vgb基因轉(zhuǎn)入阿維鏈霉菌(S. avermiti lis)和肉桂地鏈霉菌(S. cinnamonensis)中，提高了抗生素的產(chǎn)量。2003年，Bhave等證實了 VHb在酵母菌(Y. lipolytics)中的表達使細胞具有更高的生長率，加強了氧呼吸效率，并提高了呼吸效能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對氧的利用率高，發(fā)酵產(chǎn)孢數(shù)和抗菌脂肽產(chǎn)量高的基
因重組解淀粉芽胞桿菌及菌劑制備方法。 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 本發(fā)明之基因重組解淀粉芽胞桿菌通過以下方法得到將透明顫菌血紅蛋白基因vgb，通過重疊延伸PCR技術(shù)置于強啟動子P43的調(diào)控下，構(gòu)建到基因重組整合載體pDGP43-vgb中，通過基因重組整合載體pDGP43-vgb中含有的解淀粉芽胞桿菌a _淀粉酶基因amyE的上下游兩端同源臂，將-P43-vgb-片段整合到野生型植物促生防病細菌解淀粉芽胞桿菌FZB42的染色體上，得到基因重組解淀粉芽胞桿菌XLV09-1 (Bacillusamyloliquefaciens XLV09-1);所述基因重組解淀粉芽胞桿菌XLV09-1保藏日期2009年12月10日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC);保藏單位地址武漢，珞珈山，武漢大學(xué)內(nèi)；保藏編號CCTCC M209299。 本發(fā)明之菌劑制備方法是利用基因重組解淀粉芽胞桿菌XLV09-1在生產(chǎn)和應(yīng)用過程中，表達有活性的VHb蛋白，主要工藝流程包括菌種活化、一級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)、二級
種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和生產(chǎn)用發(fā)酵罐培養(yǎng)，具體包括以下步驟
(1)菌種活化 將保藏的解淀粉芽胞桿菌XLV09-1劃線接種于固體種子培養(yǎng)基斜面上，接種前將裝有培養(yǎng)基的扁瓶在12rC條件下滅菌30分鐘，接種后在28 35t:條件下培養(yǎng)30 48h，配成孢子液，以5%的接種量用于種子罐接種；
(2)種子罐發(fā)酵 先將一級種子罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至3(TC，將孢子液接入培養(yǎng)液中，通入無菌空氣培養(yǎng)，可得一級種子罐發(fā)酵菌液；將二級種子罐在12rC下滅菌30min，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至3(TC，將一級種子罐發(fā)酵液按5% 8%接種量接入二級種子罐，通入無菌空氣和攪拌進行培養(yǎng)，可得二級種子罐發(fā)酵菌液；
(3)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng) 先將發(fā)酵罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫至25°C 3(TC，按5% 8%的
接種量將二級種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通過無菌空氣；
(4)濃縮 發(fā)酵罐中發(fā)酵結(jié)束后，將菌液通過超濾進行濃縮、補加增效添加劑、隨后裝瓶；
滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在12rC，壓力0. 3 0. 5kg/cm2條件下滅菌30min，發(fā)酵罐接種后，在28 35t:條件下培養(yǎng)36 48小時，通氣量1 2Vols/vol/min，氧氣含量
種子罐培養(yǎng)液配方牛肉膏O. 3 0.8%，蛋白胨0. 7 1.2%，葡萄糖0. 1 0. 6%， NaCl 0. 1 0. 6%， MgS04 7H20 0. 01 0. 06%， K2HP04 0 . 01% 0. 06%， MnS040. 02% 0. 08%，余為水，pH值消毒前7. 0 7. 8，消毒后pH6. 8 7. 5 ;
發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方葡萄糖2 8%， L-谷氨酸鈉0. 3 1. 5%， KH2P04 0 . 08 0. 22%， K2HP04 0. 10 2. 2%， CaC03 0. 1 2. 20%， FeS04 7H20 0. 001 0. 005%，余為水，pH值消毒前8. 5 11. 0，消毒后6. 5 9. 5 ; 發(fā)酵液要求發(fā)酵液含活芽胞數(shù)每毫升達80億以上，菌體量不足5X時放罐，pH值
7. 0-8.0，無雜菌污染； 所述百分比為重量百分比。 透明顫菌血紅蛋白功能驗證 1. Western-Blot檢測透明顫菌血紅蛋白基因的表達 將已純化的目標透明顫菌血紅蛋白免疫兔子，獲得抗體后與辣根過氧化物酶連
接，形成酶聯(lián)抗體；將培養(yǎng)的細菌用超聲波處理后，將總蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜、用抗體雜交，洗
脫、顯色，確定是否有VHb表達。 2.透明顫菌血紅蛋白的生物活性 通過一氧化碳差光譜法檢測表達的VHb是否具有生物活性。
3.工程菌生長情況的檢測 通過血球計數(shù)板和稀釋涂平板法來測定發(fā)酵后的產(chǎn)孢數(shù)。
4、抗菌脂肽產(chǎn)量及其抗真菌活性的測定 采用HPLC來測定抗菌脂肽的產(chǎn)量，同時采用平板抑菌試驗來測定抗菌脂肽的抗真菌活性。 本發(fā)明利用透明顫菌血紅蛋白基因在解淀粉芽胞桿菌中的表達，提高了解淀粉芽胞桿菌對氧氣的利用率。 本發(fā)明之植物促生防病工程菌基因重組解淀粉芽胞桿菌菌劑，是一種產(chǎn)生透明顫菌血紅蛋白的解淀粉芽胞桿菌制劑，為綠色農(nóng)藥，無殘毒，對人、畜安全，有利保護生態(tài)環(huán)境。 本發(fā)明與現(xiàn)有的促生防病菌菌劑相比具有以下優(yōu)點 (1)、產(chǎn)孢數(shù)量高該制劑的基因重組解淀粉芽胞桿菌的芽胞含量比原始菌株提高了 14. 49%，達到100億/ml以上； (2)、抗菌脂肽產(chǎn)量高工程菌抗菌總脂肽產(chǎn)量達到lg/L以上，抗菌效果好，比常規(guī)生防菌株提高30% 60% ; (3)、遺傳穩(wěn)定性更高由于外源基因是直接整合到宿主菌的染色體上，所以在生產(chǎn)和使用過程中，外源基因能穩(wěn)定的遺傳和表達。工程菌所攜帶的血紅蛋白基因?qū)θ?、畜均無害。 解淀粉芽胞桿菌XLV09-1保藏日期、保藏單位全稱及簡稱、保藏編號 保藏日期2009年12月10日； 保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC ; 保藏編號CCTCC M209299。


圖1為P43啟動子和vgb的重疊延伸拼接及中間載體pMD-P43vgb和重組整合載體 pDGP43-vgb的構(gòu)建流程圖； 圖2為P43啟動子和vgb的PCR擴增及重疊延伸PCR圖譜；
圖3為中間載體pMD-P43vgb的酶切鑒定圖譜；
圖4為重組整合載體pDGP43-vgb的酶切鑒定圖譜；
圖5為重組整合載體pDGP43-vgb的部分測序圖譜； 圖6為P43啟動子和vgb融合片段整合到解淀粉芽胞桿菌染色體上穩(wěn)定遺傳的示 意圖； 圖7為本發(fā)明基因重組解淀粉芽胞桿菌的PCR鑒定圖譜； 圖8為本發(fā)明基因重組解淀粉芽胞桿菌和出發(fā)菌株的淀粉酶活力測定圖； 圖9為本發(fā)明基因重組解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程圖； 圖10為本發(fā)明基因重組解淀粉芽胞桿菌表達VHb的SDS-PAGE和Western-Blot
圖譜； 圖11為本發(fā)明基因重組解淀粉芽胞桿菌的一氧化碳差光譜圖； 圖12為本發(fā)明基因重組解淀粉芽胞桿菌和出發(fā)菌株產(chǎn)生抗菌脂肽的HPLC檢測圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。 本發(fā)明實施例利用植物根圍促生防病菌_解淀粉芽胞桿菌 (Bacillusamyloliquefaciens)FZB42作為受體菌，將透明顫菌血紅蛋白基因vgb，通過構(gòu) 建基因重組整合載體pDGP43-vgb，將vgb整合到解淀粉芽胞桿菌中實現(xiàn)高表達，構(gòu)建出產(chǎn) 孢數(shù)和抗菌脂肽產(chǎn)量更高的植物促生防病工程菌解淀粉芽胞桿菌工程菌菌株XLV09-1，并 制備解淀粉芽胞桿菌工程菌菌劑。 —、基因重組解淀粉芽胞桿菌工程菌的構(gòu)建方法實施例
(1)PCR擴增P43啟動子 提取枯草芽胞桿菌B. subtilis 168菌株的總DNA，方法參考文獻 [Isolation ofBacillus subtilis chromosomal DNA. Recombinant DNA Techniques. Addison-WesleyPublishing Co. ， Inc. ， Reading,Mass, 1983，pp. 162-163]，根據(jù)GenBank中 登錄的B. subtilis P43 fragment (ACCESSION No. K02174. 1)序歹lj，設(shè)計引物，P _F :CCCAAGC HGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTG，下劃線為Hind III酶切位點；P43_R :GGTTTGCTGGTCTAACATG TGTACATTCCTCTCTT。以B. subtilis菌株總DNA為模板，P43_F/P43-R為引物，擴增長為0. 37kb 的P43啟動子。反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性4min ;94。C變性45sec，58。C退火30sec，72。C延伸 30sec ;30個循環(huán)；72。C延伸10min ;
(2)PCR擴增透明顫菌血紅蛋白基因vgb 根據(jù)GenBank中登錄的透明顫菌血紅蛋白基因(ACCESSION No.M27061)序列， 以質(zhì)粒pRK404-VHb為模板用vgb-F :AAGAGAGGAATGTACACATGTTAGACCAGCAAACC和vgb-R :CCCGAATTCTTATTCAACCGCTTGAGCG,下劃線為EcoRI酶切位點，以質(zhì)粒pRK404_VHb為模板， Vgb-F/Vgb-R為引物，擴增0. 44kp的透明顫菌血紅蛋白基因vgb ;反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性 4min ;94。C變性45sec， 58。C退火30sec，72。C延伸30sec，30個循環(huán)；72。C延伸10min ;
(3)重疊延伸拼接P43啟動子和vgb 用PCR回收試劑盒回收所述兩次PCR的產(chǎn)物，并以兩種回收產(chǎn)物為模板，以P43_F/ Vgb-R為引物，采用重疊延伸拼接的方法擴增0. 81kb的融合基因，反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性 4min ;94。C變性45sec， 58。C退火lmin，72。C延伸lmin，30個循環(huán)；72。C延伸10min ;具體流 程參照圖1， PCR詳細結(jié)果見圖2。
(4)中間載體pMD-P43vgb的構(gòu)建 用PCR回收試劑盒回收重疊PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體，連接體系為 2 iil PCR產(chǎn)物，2. 5iU Solution I，O. 5iU pMD18-T載體，16。C連接過夜，連接產(chǎn)物全部用 來轉(zhuǎn)化Ecoli ToplO感受態(tài)細胞，次日挑選抗性斑劃線，用菌落PCR初步篩選陽性轉(zhuǎn)化子； 然后將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接小搖瓶，37t:搖床培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，提取質(zhì)粒進行用Hind III/ EcoRI雙酶切鑒定轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，，進一步確定轉(zhuǎn)化子，酶切鑒定結(jié)果見圖3 ;將酶切鑒定正確 的質(zhì)粒pMD-P43vgb測序； (5)基因重組整合載體pDGP43-vgb的構(gòu)建 提取基因重組質(zhì)粒pMD-P43vgb和整合載體pDG1730，將質(zhì)粒pMD-P43vgb和整 合載體pDG1730同時用Hind III/EcoR I雙酶切，回收其目的片段，將兩者連接形成質(zhì)粒 pDGP43-vgb，轉(zhuǎn)化E. coli ToplO感受態(tài)細胞，Amp抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子經(jīng)快速裂 解、菌落PCR和酶切鑒定，篩選正確的陽性轉(zhuǎn)化子pDGP43-vgb。其具體流程參照圖l，酶切 鑒定結(jié)果見圖4 ;將酶切鑒定的質(zhì)粒pDGP43-vgb送測序鑒定，部分測序圖見圖5 ;
(6)基因重組解淀粉芽胞桿菌XLV09-1的構(gòu)建 解淀粉芽胞桿菌感受態(tài)細胞的制備參照文獻[Extracell y lar phytase activity ofBacillus amy 1o1iquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect. J. Microbiology, 2002， 148 :2097-2109]進行；具體整 合流程參照圖6進行，用Xho I將基因重組整合載體pDGP43-vgb線性化，切膠回收，隨后 100ng DNA加入200 y 1感受態(tài)中，孵育20min ;加入LB和抗生素，培養(yǎng)90min，然后涂布壯 觀霉素抗性平板。37t:倒置培養(yǎng)12-16h ;挑選抗性菌落，劃線到另一個平板；從壯觀霉素平 板上挑取轉(zhuǎn)化子，然后在另一平板上劃線培養(yǎng)，同時挑取一部分菌株做模板進行菌落PCR， 以確定vgb表達框是否真正整合到解淀粉芽胞桿菌FZB42的染色體上，PCR檢測結(jié)果見圖 7 ;然后，使用淀粉酶水解圈試驗來驗證目的基因是否正確整合到解淀粉芽胞桿菌的amyE 基因位點將amyE基因阻斷，具體操作如下將PCR篩選出的陽性菌落點種到含2 %淀粉的 LB平板上，用原始菌株作為對照，倒置培養(yǎng)三天，然后在平板中加入碘液進行染色，看菌落 周圍是否出現(xiàn)了水解圈，具體檢測結(jié)果見圖8 ;篩選出沒有水解圈的菌落，得到正確的基因 重組解淀粉芽胞桿菌菌株XLV09-1。 二、解淀粉芽胞桿菌XLV09-1菌劑的生產(chǎn)發(fā)酵工藝實施例 本發(fā)明解淀粉芽胞桿菌XLV09-1菌劑發(fā)酵工藝(參照圖9)，主要包括菌種活化、一
級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)、二級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和生產(chǎn)用發(fā)酵罐培養(yǎng)。
1.菌種活化
將保藏的解淀粉芽胞桿菌XLV09-1劃線接種于固體種子培養(yǎng)基斜面上，接種前將 裝有培養(yǎng)基的扁瓶在12rC條件下滅菌30分鐘，接種后在3(TC條件下培養(yǎng)48h，配成孢子 液，以5%的接種量用于種子罐接種；
2.種子罐發(fā)酵 先將一級種子罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至3(TC，將孢子液接入培養(yǎng)液 中，通入無菌空氣培養(yǎng)，可得一級種子罐發(fā)酵菌液；將二級種子罐在12rC下滅菌30min，裝 入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至3(TC，將一級種子罐發(fā)酵液按5%接種量接入二級種子罐，通入 無菌空氣和攪拌進行培養(yǎng)，可得二級種子罐發(fā)酵菌液；
3.生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng) 先將發(fā)酵罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫至25°C 3(TC，按5%的接種量
將二級種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通過無菌空氣；
4.濃縮 發(fā)酵罐中發(fā)酵結(jié)束后，將菌液通過超濾進行濃縮、補加增效添加劑、隨后裝瓶；
滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在12rC，壓力0. 5kg/cm2條件下滅菌30min，發(fā)酵罐接 種后，在3(TC條件下培養(yǎng)48小時，通氣量2Vols/vol/min，氧氣含量40% 。
種子罐培養(yǎng)液配方牛肉膏0.8%，蛋白胨1.2%，葡萄糖0.6%， NaCl 0.6%， MgS04 7H20 0. 06%，K2HP04 0 . 06%，MnS04 0 . 02 % ，余為水，pH值消毒前7. 5，消毒后pH
7. 2 ; 發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方葡萄糖2%丄-谷氨酸鈉0. 5%，KH2P04 0 . 08%，K2HP040. 10%，
CaC03 0. 1 % ， FeS04 7H20 0. 001 % ，余為水，pH值消毒前7. 5，消毒后pH 7.2。 發(fā)酵液要求發(fā)酵液含活芽胞數(shù)每毫升達100億以上，菌體量不足5%時放罐，pH
值6.8，無雜菌污染。 透明顫菌血紅蛋白功能驗證 1. Western-Blot檢測透明顫菌血紅蛋白基因的表達 將已純化的目標透明顫菌血紅蛋白免疫兔子，獲得抗體后與辣根過氧化物酶連 接，形成酶聯(lián)抗體；將培養(yǎng)的細菌用超聲波處理后，將總蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜、用抗體雜交，洗 脫、顯色，確定該制劑表達了 VHb蛋白(圖10)。
2.透明顫菌血紅蛋白的生物活性 通過一氧化碳差光譜法檢測表達的VHb是否具有生物活性(圖11)，該制劑的一氧 化碳光譜中存在特異的419nm的吸收峰，而原始菌制劑的一氧化碳光譜中沒有該吸收峰， 證明該制劑表達的VHb蛋白具有血紅蛋白生活活性。
3.工程菌生長情況的檢測 通過血球計數(shù)板和稀釋涂平板法來測定發(fā)酵后的產(chǎn)孢數(shù)，該制劑基因重組解淀粉 芽胞桿菌的芽胞含量比原始菌株提高了 14.49%，達到103億/ml ;。
4、抗菌脂肽產(chǎn)量及其抗真菌活性的測定 采用HPLC來測定抗菌脂肽的產(chǎn)量(圖12)，本實施例菌劑中抗菌脂肽fengycin的 含量比原始菌株菌劑提高了 1. 74倍，達到769. 8mg/L， surfactin的含量提高了 3. 14倍， 達到197. 8mg/L ;同時采用抑菌試驗來測定抗菌脂肽的抗真菌活性，該制劑抗菌脂肽粗溶 液對立枯絲核菌Rhizitoconia solani有很好的抑制效果，比原始菌抗菌脂肽粗溶液提高
10了 61. 54%，對辣椒白絹病Sclerotiumrolfsi的抑制效果提高了 36. 4%，對煙草赤星病菌 Alternaria alternata的抑制效果提高了 38. 9% 。
權(quán)利要求
一種基因重組解淀粉芽胞桿菌，其特征在于，該基因重組解淀粉芽胞桿菌染色體上整合有透明顫菌血紅蛋白基因vgb，其分類命名為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)XLV09-1，保藏編號CCTCC M209299。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組解淀粉芽胞桿菌，其特征是，構(gòu)建所用的整合表達 載體為pDGP43-vgb，采用P43啟動子。
3. —種權(quán)利要求1所述基因重組解淀粉芽胞桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將透明顫 菌血紅蛋白基因vgb，通過重疊延伸PCR技術(shù)置于強啟動子P^的調(diào)控下，構(gòu)建到基因重組 整合載體pDGP43-vgb中，通過基因重組整合載體pDGP43-vgb中含有的解淀粉芽胞桿菌 a _淀粉酶基因amyE的上下游兩端同源臂，將_P43-vgb-片段整合到野生型植物促生防病 細菌解淀粉芽胞桿菌FZB42的染色體上，即得到基因重組解淀粉芽胞桿菌XLV09-1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因重組解淀粉芽胞桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以 下具體步驟(1) PCR擴增^啟動子提取枯草芽胞桿菌B. subtilis 168菌株的總DNA，根據(jù)GenBank中登錄的登記號為 No. K02174. 1的B. subtilis P43 fragment序列，設(shè)計引物P43_F :CCCAAGCTTGATAGGTGGTATG TTTTCGCTTG，下劃線為Hind III酶切位點；P43_R :GGTTTGCTGGTCTAACATGTGTACATTCCTCTCT T，以B. subtilis菌株總DNA為模板，P^F/^-R為引物，擴增長為0. 37kb的P43啟動子，反 應(yīng)條件為94。C預(yù)變性4min ;94。C變性45sec， 58。C退火30sec， 72。C延伸30sec ;30個循環(huán)； 72。C延伸10min ;(2) PCR擴增透明顫菌血紅蛋白基因vgb根據(jù)GenBank中登錄的登記號為No. M27061的透明顫菌血紅蛋白基因序列，以質(zhì) 粒pRK404-VHb為模板，用vgb-F :AAGAGAGGAATGTACACATGTTAGACCAGCAAACC禾P vgb-R : CCCGAATTCTTATTCAACCGCTTGAGCG，下劃線為EcoRI酶切位點，以質(zhì)粒pRK404-VHb為模板， Vgb-F/Vgb-R為引物，擴增0. 44kp的透明顫菌血紅蛋白基因vgb ;反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性 4min ;94。C變性45sec， 58。C退火30sec，72。C延伸30sec，30個循環(huán)；72。C延伸10min ;(3) 重疊延伸拼接P43啟動子和vgb用PCR回收試劑盒回收兩次PCR的產(chǎn)物，并兩種回收產(chǎn)物為模板，以P43_F/Vgb-R為引 物，采用重疊延伸拼接的方法擴增O. 81kb的融合基因，反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性4min ;94°C 變性45sec，58。C退火lmin，72。C延伸lmin，30個循環(huán)；72。C延伸10min ;(4) 中間載體pMD-P43vgb的構(gòu)建用PCR回收試劑盒回收重疊PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接pMD18-T載體，連接體系為2 y 1 PCR產(chǎn)物，2. 5iU Solution I，O. 5iU pMD18-T載體，16。C連接過夜，連接產(chǎn)物全部用來轉(zhuǎn) 化E.coli ToplO感受態(tài)細胞，次日挑選抗性斑劃線，用菌落PCR初步篩選陽性轉(zhuǎn)化子；然后 將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接小搖瓶，37t:搖床培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，提取質(zhì)粒進行用Hind III/EcoRI 雙酶切鑒定轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，，進一步確定轉(zhuǎn)化子，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒pMD-P43vgb測序；(5) 基因重組整合載體pDGP43-vgb的構(gòu)建提取基因重組質(zhì)粒pMD-P43vgb和整合載體pDG1730，將質(zhì)粒pMD-P43vgb和整合 載體pDG1730同時用Hind III/EcoR I雙酶切，回收其目的片段，將兩者連接形成質(zhì) 粒pDGP43-vgb，轉(zhuǎn)化E. coli ToplO感受態(tài)細胞，Amp抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)化子經(jīng)快速裂解、菌落PCR和酶切鑒定，篩選正確的陽性轉(zhuǎn)化子pDGP43-vgb ;將酶切鑒定的質(zhì)粒 pDGP43-vgb送測序鑒定；(6)基因基因重組解淀粉芽胞桿菌工程菌XLV09-1的構(gòu)建制備解淀粉芽胞桿菌感受態(tài)細胞；用Xho I將基因重組整合載體pDGP43-vgb線性 化，切膠回收，隨后lOOng DNA加入200 y 1感受態(tài)中，孵育20min ;加入LB和抗生素，培養(yǎng) 90min，然后涂布壯觀霉素抗性平板，37t:倒置培養(yǎng)12_16h ;挑選抗性菌落，劃線到另一個 平板；從壯觀霉素平板上挑取轉(zhuǎn)化子，然后在另一平板上劃線培養(yǎng)，同時挑取一部分菌株做 模板進行菌落PCR，以確定vgb表達框是否真正整合到解淀粉芽胞桿菌FZB42的染色體上， PCR的三對引物分別為P43_F/P43-R、 Vgb-F/Vgb-R和P43-F/Vgb-R ;然后，使用淀粉酶水解圈 試驗來驗證目的基因是否正確整合到解淀粉芽胞桿菌的amyE基因位點將amyE基因阻斷， 具體操作如下將PCR篩選出的陽性菌落點種到含2X淀粉的LB平板上，用原始菌株作為 對照，倒置培養(yǎng)三天，然后在平板中加入碘液進行染色，看菌落周圍是否出現(xiàn)了水解圈；篩 選出沒有水解圈的菌落，即為基因重組解淀粉芽胞桿菌XLV09-1。
5. —種基因重組解淀粉芽胞桿菌菌劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1) 、菌種活化將保藏的基因重組解淀粉芽胞桿菌XLV09-1劃線接種于固體種子培養(yǎng)基斜面上，接種 前將裝有培養(yǎng)基的扁瓶在12rC條件下滅菌30分鐘，接種后在28 35t:條件下培養(yǎng)30 48h，配成孢子液，以5%的接種量用于種子罐接種；(2) 、種子罐發(fā)酵先將一級種子罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30°C ，將孢子液接入培養(yǎng)液中，通 入無菌空氣培養(yǎng)，可得一級種子罐發(fā)酵菌液；將二級種子罐在12rC下滅菌30min，裝入培 養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至3(TC，將一級種子罐發(fā)酵液按5% 8%接種量接二級種子罐，通入 無菌空氣和攪拌進行培養(yǎng)，可得二級種子罐發(fā)酵菌液；(3) 、生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)先將發(fā)酵罐滅菌，裝入培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫至25°C 3(TC，按5% 8%的接種 量將二級種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通過無菌空氣；(4) 、濃縮發(fā)酵罐中發(fā)酵結(jié)束后，將菌液通過超濾進行濃縮，補加增效添加劑，隨后裝瓶； 所述滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在12rC，壓力0. 3-0. 5kg/cm2條件下滅菌30min，發(fā)酵罐接種后，在28 35t:條件下培養(yǎng)36 48小時，通氣量1 2Vols/vol/min，氧氣含量30 40% ;種子罐培養(yǎng)液配方牛肉膏O. 3 0. 8%，蛋白胨0. 7 1.2%，葡萄糖0. 1 0. 6%， NaCl 0. 1 0. 6%，MgS04 *7H20 0. 01 0. 06%，K2HP04 0 . 01% 0. 06%，MnS04 0 . 02% 0. 08%，余為水，pH值消毒前7. 0 7. 8，消毒后pH6. 8 7. 5 ;發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖2 8%， L-谷氨酸鈉O. 3 1.5%， KH2P040 . 08 0. 22%， K2HP04 0. 10 2. 2%， CaC03 0. 1 2. 20%， FeS04 7H20 0. 001 0. 005%，余為 水，pH值消毒前8. 5 11. 0，消毒后6. 5 9. 5 ;發(fā)酵液要求發(fā)酵液含活芽胞數(shù)每毫升達80億以上，菌體量不足5 %時放罐，pH值 7. 0-8.0，無雜菌污染；。
全文摘要
一種基因重組解淀粉芽胞桿菌及菌劑制備方法。本發(fā)明以解淀粉芽胞桿菌FZB42菌株為宿主菌，經(jīng)過構(gòu)建基因重組整合載體，構(gòu)建帶有P43強啟動子調(diào)控下的透明顫菌血紅蛋白基因重組解淀粉芽胞桿菌XLV09-1。用該解淀粉芽胞桿菌菌珠發(fā)酵生產(chǎn)制備的菌劑的產(chǎn)孢數(shù)達到100億/ml以上，總抗菌脂肽產(chǎn)量達到1g/L以上，對多種植物真菌病害的防治效果提高了30％以上。所述菌劑為綠色微生態(tài)制劑，無殘毒，對人、畜安全，有利保護生態(tài)環(huán)境。
文檔編號C12P21/02GK101717744SQ20091022719
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者丁學(xué)知, 余子全, 劉清術(shù), 夏立秋, 孫運軍, 胡勝標 申請人:湖南師范大學(xué)