專利名稱：Hsv1-tk基因重組溶瘤腺病毒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組溶瘤腺病毒，特別涉及HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，還涉 及該重組溶瘤腺病毒的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類健康的重要疾病，腫瘤治療新方法的研究一直是醫(yī)學和生命科學 研究的重點。腫瘤的生物治療已被世界醫(yī)學界公認為是繼手術(shù)、放射治療和化學治療之后 的第四大治療方法，其中免疫治療與基因治療更是生物治療中最有效、最前沿的科研項目。
腫瘤基因治療的原理是將目的基因用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)導入靶細胞，使其表達此基因 而獲得特定的功能，繼而執(zhí)行或介導對腫瘤的殺傷和抑制作用，從而達到治療之目的?；?治療主要涉及目的基因、載體及受體細胞三方面。載體影響目的基因?qū)牒捅磉_的效率，是 決定腫瘤基因治療成敗的關(guān)鍵因素。載體可分為病毒載體和非病毒載體，其中病毒載體又 可分為復(fù)制型病毒載體和復(fù)制缺陷型病毒載體。為了確保在體治療的安全性，傳統(tǒng)的病毒 載體采用復(fù)制缺陷型病毒載體，但其在技術(shù)上很難達到100%的轉(zhuǎn)染效率。近年來，隨著現(xiàn) 代生物學和醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，復(fù)制型病毒載體在腫瘤基因治療中備受矚目。
溶瘤病毒是一種通過遺傳學改變而具有復(fù)制能力的病毒，不僅能夠利用腫瘤細胞 中抑癌基因的失活或缺陷，選擇性地在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制，最終導致腫瘤細胞的溶解和死亡， 而且能夠通過死亡的腫瘤細胞釋放出病毒顆粒，產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)，放大溶細胞效果，直至腫瘤 細胞被全部清除。此外，腫瘤細胞的破裂會釋放出腫瘤抗原，從而誘導機體抗腫瘤免疫反 應(yīng)，這也可能增強病毒的溶細胞效果。利用這種病毒進行的腫瘤治療稱為溶瘤病毒治療。既 往研究證實，溶瘤病毒能夠在強力殺死癌細胞的同時確保不傷害正常細胞。
在腫瘤基因治療中，自殺基因療法近年來也顯示出較好的應(yīng)用前景。該法采用藥 物敏感基因(即自殺基因)轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，以提高腫瘤細胞對無毒的前體藥物的敏感性，從 而達到殺傷腫瘤細胞的目的。至今已發(fā)現(xiàn)多個自殺基因，其中研究最多的是胸腺嘧啶核苷 激酶(TK)基因。目前用于基因治療的TK基因為病毒TK基因，包括單純皰疹病毒I型胸苷 激酶(HSV1-TK)基因和水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶(VZW-TK)基因等，尤以前者應(yīng)用最多。 HSV1-TK基因轉(zhuǎn)錄部分約1300個核苷酸，蛋白質(zhì)編碼區(qū)為1128個核苷酸，編碼376個密碼 子，基因中無內(nèi)含子，其轉(zhuǎn)錄起始部(Mrna5p端)有107個核苷酸的非翻譯區(qū)。用于HSV-TK 基因療法的前體藥物包括丙氧鳥苷(GCV)和無環(huán)鳥苷(ACV)等，其中GCV對HSV-TK轉(zhuǎn)基因 瘤細胞的抑制作用比ACV強10倍，為目前HSV-TK基因療法中最常用的前體藥物。GCV和ACV 本身對細胞無毒害作用，TK可以將其磷酸化為二磷酸核苷，后者在細胞內(nèi)激酶作用下形成 三磷酸核苷，三磷酸核苷具有強烈的細胞毒性，能抑制DNA聚合酶活性或作為DNA鏈延伸的 終止子阻止DNA合成，最終導致細胞死亡。這種獨特的自殺效應(yīng)能選擇性地殺死腫瘤細胞 而保護正常細胞，從而避免了傳統(tǒng)腫瘤治療方法對人體帶來的傷害。此外，研究還表明，轉(zhuǎn) 導了自殺基因的腫瘤細胞在給予前體藥物后被殺死，其相鄰或更遠的未被轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞 也可被殺死，這種作用被稱為旁觀者效應(yīng)。旁觀者效應(yīng)明顯擴大了自殺基因的細胞殺傷范圍，顯示了其對于腫瘤治療的獨特優(yōu)勢，并大大克服了自殺基因轉(zhuǎn)染率的限制。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，有效 結(jié)合自殺基因和溶瘤病毒的特性，轉(zhuǎn)染效率高，穩(wěn)定性好，腫瘤治療譜廣；目的之二在于提 供所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法；目的之三在于提供所述HSV1-TK基因重 組溶瘤腺病毒的應(yīng)用。 為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 1、 HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，該重組溶瘤腺病毒基因組中由上游至下游依次 包含啟動子、腺病毒E1區(qū)基因和HSV1-TK全長編碼基因。
進一步，所述腺病毒El區(qū)基因為E1A全長編碼基因；
進一步，所述啟動子為CMV啟動子。 2、所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法，包括以下步驟 a、克隆兩端分別帶有Not I酶切位點和Xholl酶切位點的HSV1-TK全長編碼基
因； b、克隆兩端分別帶有Xba I酶切位點和Sal I酶切位點的E1A全長編碼基因；
c、將兩端分別帶有Xba I酶切位點和Sal I酶切位點的E1A全長編碼基因用Xba I和Sal I雙酶切后，插入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中， 得重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ElA ;再將兩端分別帶有Notl酶切位點和Xhol I酶切位點的 HSVl-TK全長編碼基因用Not I和XholI雙酶切后，插入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的重組質(zhì) 粒pAdTrack-CMV-ElA中，得重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ElA-TK ;
d、將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ElA-TK與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn) 染人胚胎腎293細胞進行細胞內(nèi)同源重組，待出現(xiàn)明顯細胞病變效應(yīng)時收集細胞，反復(fù)凍 融使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得HSV1-TK基因重組溶瘤腺病 毒。 進一步，步驟a的具體方法為以HSV1基因組DNA為模板，以5' -tagcggcc-gcat ggcttcgtacccctgccatc-3' 和5' _gcctcgaggttagcctcccccatctc_3' 為上下游弓l物，PCR 擴增HSV1-TK全長編碼基因，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94t:預(yù)變性5分鐘，然后94。C變性60 秒，56t:退火90秒，72t:延伸75秒，共35個循環(huán)，最后72。C延伸20分鐘；
進一步，步驟b的具體方法為以含有E1A全長編碼基因的pXCl質(zhì)粒為模板，以 5， -gctctagaaccatgagacatattatc-3，和5， -gcgtcgacttatggcctggggcg-3，為上下游弓l物， PCR擴增E1A全長編碼基因，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94t:預(yù)變性5分鐘，然后94。C變性1分 鐘，56。C退火1分鐘，72t:延伸4分鐘，共30個循環(huán)。 3、所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，有效結(jié)合自殺
基因和溶瘤病毒的特性，使溶瘤病毒局限在腫瘤細胞中高效復(fù)制，同時HSV1-TK基因的表
達產(chǎn)物將無毒的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘晕镔|(zhì)，導致腫瘤細胞"自殺"，而正常組織細胞由
于溶瘤病毒不能復(fù)制表達HSV1-TK基因，不能將無毒的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘晕镔|(zhì)，從
而避免損傷；該重組溶瘤腺病毒還具有轉(zhuǎn)染效率高，穩(wěn)定性好，腫瘤治療譜廣，制備方法簡
4單等優(yōu)點，可用于制備抗腫瘤藥物，在腫瘤基因治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述，其中 圖1為HSV1-TK全長編碼基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2為E1A全長編碼基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖3為MTT法測定細胞存活率；
圖4為兩組小鼠腫瘤生長曲線圖；
圖5為兩組小鼠生存率圖。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
—、 HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備
1、構(gòu)建HSV1-TK基因重組表達載體 將單純皰疹病毒I (HSV1)用LB液體培養(yǎng)基在溫度為37°C 、振搖速度為250r/min 的條件下培養(yǎng)過夜，用基因組DNA分離純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取基 因組DNA，按照試劑盒說明書操作。 根據(jù)Genbank登錄號為AF303108. 1的HSV1-TK基因序列設(shè)計并合成如下引物F 1:5' -tagcggccgcatggcttcgtacccctgccatc-3'(下劃線部分為Not I酶切位點，SEQ ID No.l);Rl:5' -gcctcgaggttagcctcccccatctc-3'(下劃線部分為Xhol I酶切位點，SEQ ID No.2)。 以HSV1基因組DNA為模板，以Fl和Rl為上下游引物，PCR擴增HSV1-TK全長編 碼基因，PCR體系為50iU，循環(huán)條件參數(shù)為94t:預(yù)變性5分鐘，然后94t:變性60秒，56t: 退火90秒，72t:延伸75秒，共35個循環(huán)，最后72"C延伸20分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠 電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與pGEM-T質(zhì)粒在T4DNA連接酶的作用下連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提 取質(zhì)粒，測序鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為pGEM-T-TK。 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在約1100bp處呈單一特異性條帶(圖1)，與 目的片段大小相符；測序結(jié)果顯示陽性克隆質(zhì)粒的插入基因序列(SEQ IDNo.3)與GenBank 登錄號為AF303108. 1的HSV1-TK全長編碼基因序列一致。
2、構(gòu)建E1A基因重組表達載體 根據(jù)Genbank登錄號為NC 001460. 1的E1A基因序列設(shè)計并合成如下引物F2 : 5， _gci￡i^g^accatgagacatattatc_3，(下劃線部分為Xba I酶切位點，SEQ IDNo. 4) ;R2 : 5' -gcgtcgacttatggcctggggcg-3，(下劃線部分為Sal I酶切位點，SEQID No. 5)。
以含有E1A全長編碼基因的pXCl質(zhì)粒為模板，以F2和R2為上下游引物，PCR擴 增E1A全長編碼基因，PCR體系為50 ii l，循環(huán)條件參數(shù)為94t:預(yù)變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘，56t:退火1分鐘，72t:延伸4分鐘，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒 定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶Xbal和Sal I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng) 凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)XbaI和Sal I雙酶切的pDC315質(zhì)粒連接，連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì) 粒，Xba I和Sal I雙酶切鑒定和測序鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為pAdSU。
瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在約800bp處呈單一特異性條帶(圖2)，與目 的片段大小相符；測序結(jié)果顯示陽性克隆質(zhì)粒的插入基因序列(SEQ IDNo.6)與GenBank登 錄號為NC 001460. 1的EIA全長編碼基因序列一致。
3、構(gòu)建HSV1-TK基因重組腺病毒穿梭質(zhì)粒 將pAdSU質(zhì)粒用Xba I和Sal I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純 化后，與同樣經(jīng)Xba I和Sal I雙酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，Xba I和Sal I雙酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為pAdTrack-CMV-ElA ;再將pGEM-T-TK質(zhì)粒用 Not I和Xhol I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)Not I和 Xhol I雙酶切的pAdTrack-CMV-ElA質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞， 用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，Not I和Xhol I雙酶切鑒定，將陽 性克隆質(zhì)粒命名為pAdTrack-CMV-ElA-TK。
4、制備HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒 將人胚胎腎293細胞以40% 60%的細胞密度接種至T-25培養(yǎng)瓶中，待 細胞生長至30% 50%融合時棄去培養(yǎng)液，采用脂質(zhì)體法將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-ElA-TK與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細胞，進行胞內(nèi)同源重組，通過 顯微鏡觀察細胞病理改變，待出現(xiàn)明顯細胞病變效應(yīng)時離心收集細胞，用PBS重懸，反復(fù)凍 融4次使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得HSV1-TK基因重組溶瘤 腺病毒原液；將病毒原液重新感染293細胞以擴增病毒，收集含病毒的上清液，用氯化銫梯 度超速離心法純化，4t:透析過夜，測定病毒滴度，-7(TC保存?zhèn)溆谩?
二、 HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的抗腫瘤作用檢測
1、體外抗腫瘤作用 MTT法測定細胞存活率分別將人肝癌細胞H印G2和美洲綠猴腎細胞C0S-7接種 于96孔板，培養(yǎng)24小時后，將HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒按感染復(fù)數(shù)(M0I)為100感染 細胞，同時設(shè)置相應(yīng)對照組(用PBS替代HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒)，感染4天后，每孔 加入濃度為50mg/ml的MTT (用PBS配制)20 y 1， 37"培養(yǎng)4小時，棄去含MTT的培養(yǎng)液，加 入酸化異丙醇100 y 1，充分溶解后，在酶標儀上測定波長595nm處的吸光度A值，按下述公 式計算細胞存活率細胞存活率=A樣。。。/A柳g X 100%。 結(jié)果見圖3，經(jīng)HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒處理的腫瘤細胞H印G2的存活率明顯 下降，平均存活率為24% ;而經(jīng)HSVl-TK基因重組溶瘤腺病毒處理的正常細胞C0S-7的存 活率未見明顯變化，平均存活率為78%。
2、體內(nèi)抗腫瘤作用 將1 X 105個H印G2細胞接種于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠，將荷瘤裸鼠隨機分為兩 組對照組和實驗組，對照組尾靜脈注射PBS，實驗組尾靜脈注射HSV1-TK基因重組溶瘤腺
6病毒，觀察60天內(nèi)兩組小鼠的生存率和腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。 結(jié)果兩組小鼠腫瘤生長曲線見圖4，第30天時，對照組小鼠腫瘤體積達到
5000mm 而實驗組小鼠腫瘤生長緩慢，腫瘤體積僅為2000mm3 ;兩組小鼠生存率見圖5，對照
組小鼠于30天內(nèi)全部死亡，而實驗組小鼠60天的生存率為50% ;說明本發(fā)明的HSV1-TK基
因重組溶瘤腺病毒能夠有效抑制腫瘤細胞的生長，同時能夠延長荷瘤裸鼠的平均生存期并
提高平均生存率。 最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參
照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可
以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明
的精神和范圍。 序列表 〈110〉中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學 〈120>HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒及其制備方法和應(yīng)用 〈160>6 〈210>1 〈211>32 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉引物F1 〈400〉 1 tagcggccgc atggcttcgt acccctgcca tc 32 〈210>2 〈211>26 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉引物R1 〈400>2 gcctcgaggt tagcctcccc catctc 26
〈210>3
〈211>1131
〈212>DNA 〈213>單純皰疹病毒I (Herpessimplexvirus-1)
〈400>3 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccategca accgacgtec ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcctggagc agaaaatgcc cacgctectg cgggtttete tegacggtcc tcacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggt tcgcgcgacga tetcgtctec 240
7gtacccgagccgatgacttectggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc300tecacc3C3caacaccgcctcg3cc3gggt g卿tetcgg ccggggEicgc ggcggtggte360atgac朋gcgcccagateacaatgggcatg ccttetgccg tgaccgacgc cgttctggct420cctcatetcggggggg郷ctgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc■ttcgaccgccatcccatcgccgccctcctg tgctecccgg ccgcgcgate ccttetgggc540agcatgaccccccaggccgtgctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc6003C3朋C3tCgtgttgggggcccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc660cagcgccccggcgagcggcttgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttecggg720ctgcttgccaatecggtgcggtetctgC3g ggCggCgggt CgtggCgggEl gg￡lttgggg￡l780cagctttcggggacggccgtgccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca840cgaccccatetcggggacacgttetttecc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc■朋cggcgacctgteteacgtgtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt960cccatgcacgtctttatcctggattecgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg1020ctgcaacttecctccgggatggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cateccgacg1080atctgcgacctggcgcgcacgtttgcccgg gg3gtggggg郷Ct雄tg 31131〈210>4〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物F2〈400>4gctctegaacC3tg3g3C3tattetc26〈210>5〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物Rl〈400>5gcgtcgacttatggcctggggcg23〈210>6 [o川]〈211>801 〈212>DNA〈213>腺病毒(adenovirus)〈400>6atgag朋ctg 3朋tgactcccttggtcctg tcgtetcagg aagctgacga catettggag60catttggtgg acaactttttteacgaggte cccagtgatg atgatcttte tgttccgtct120ctttecgaactgtetgatcttgatgtggag tctgccggtg aagateatea tgaacaggcg180
8
gtg皿tgagttttttcccgaatcgcttettttegctgccagtg郷ggttgttttteccg240gagcctcctgtectttctcctgtctgtgagcctettgggggcg皿tgtetgccacaactg300caccctgaagatetggatttattgtgctecg卿tgggctttccctgtegcgattcgg皿360gacgagc皿g3Cg3g皿Cgg皿tggcgcatgtttctgcatccgcagctgctgctgccgct420gateggg皿cgtg郷agtttcagttegaccatccagagttgcccggacac皿ttgteag■tcctgtgagc3CC3CCgg皿tegtectggaaatectgactteatgtgctctttgtgctet540ctgcgagcctacaacatgttcatttecagtcctgtttccgateatgagcctgaaccteat600agcactttgggcgaccctcacccccga皿ctegg皿gtgcggttccag皿660ggagteateaaacctgtgcctcagcgggtg3Ctggg郷Cgt卿tgtgctgtgg腿gc720attttggatttgattc^gagg皿g皿3gatgcctgttgatctgtcagtg780aaacgccctegatgteatte80權(quán)利要求
HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，其特征在于該重組溶瘤腺病毒基因組中由上游至下游依次包含啟動子、腺病毒E1區(qū)基因和HSV1-TK全長編碼基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述腺病毒El 區(qū)基因為EIA全長編碼基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述啟動子為 CMV啟動子。
4. 權(quán)利要求1所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法，其特征在于包括以下 步驟a、 克隆兩端分別帶有Not I酶切位點和Xhol I酶切位點的HSV1-TK全長編碼基因；b、 克隆兩端分別帶有Xba I酶切位點和Sal I酶切位點的EIA全長編碼基因；c、 將兩端分別帶有Xba I酶切位點和Sal I酶切位點的EIA全長編碼基因用Xba I 和Sal I雙酶切后，插入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中， 得重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ElA ;再將兩端分別帶有Notl酶切位點和Xhol I酶切位點的 HSVl-TK全長編碼基因用Not I和Xhol I雙酶切后，插入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的重組 質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ElA中，得重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ElA-TK ;d、 將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-ElA-TK與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染人 胚胎腎293細胞進行細胞內(nèi)同源重組，待出現(xiàn)明顯細胞病變效應(yīng)時收集細胞，反復(fù)凍融使 細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法，其特征在于步驟 a的具體方法為以HSV1基因組DNA為模板，以5' -tagcggcc-gcatggcttcgtacccctgccatc -3'和5' -gcctcgaggttagcctcccccatctc-3'為上下游引物，PCR擴增HSV1-TK全長編碼 基因，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94t:預(yù)變性5分鐘，然后94t:變性60秒，56。C退火90秒，72°C 延伸75秒，共35個循環(huán)，最后72t:延伸20分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒的制備方法，其特征 在于步驟b的具體方法為以含有E1A全長編碼基因的pXCl質(zhì)粒為模板，以 5， -gctctagaaccatgagacatattatc-3，和5， -gcgtcgacttatggcctggggcg-3，為上下游弓l物， PCR擴增E1A全長編碼基因，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94t:預(yù)變性5分鐘，然后94。C變性1分 鐘，56。C退火1分鐘，72t:延伸4分鐘，共30個循環(huán)。
7. 權(quán)利要求1所述HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HSV1-TK基因重組溶瘤腺病毒及其制備方法和應(yīng)用，該重組溶瘤腺病毒基因組中由上游至下游依次包含啟動子、腺病毒E1區(qū)基因和HSV1-TK全長編碼基因；該重組溶瘤腺病毒有效結(jié)合自殺基因和溶瘤病毒的特性，使溶瘤病毒局限在腫瘤細胞中高效復(fù)制，同時HSV1-TK基因的表達產(chǎn)物將無毒的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘晕镔|(zhì)，導致腫瘤細胞“自殺”；該重組溶瘤腺病毒還具有轉(zhuǎn)染效率高，穩(wěn)定性好，腫瘤治療譜廣，制備方法簡單等優(yōu)點，可用于制備抗腫瘤藥物，在腫瘤基因治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號A61P35/00GK101768576SQ20101004200
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月4日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學