專利名稱：表達(dá)pcv-2免疫原基因的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表達(dá)PCV-2免疫原基因的重組減毒 鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是圓環(huán)病毒屬的代表種，它是一 種小而無囊膜、二十面體對稱、共價閉合、環(huán)狀、單股DNA病毒，病毒粒子直徑平均為17nm， 是目前獸醫(yī)學(xué)上發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。PCV可分為兩個血清型，即PCV-I和PCV-2。PCV-I對豬無致病性，為非致病性PCV， PCV-2對豬有致病性，可引起PMWS (斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征)，又稱PMWS相關(guān)PCV。1991 年加拿大首次爆發(fā)該病，隨后世界上許多國家和地區(qū)都有該病的報道，目前我國的很多豬 場均有該病存在，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。通過對PCV基因組分析，發(fā)現(xiàn)PCV-I和PCV-2均可能含有11個開放閱讀框(ORF)。 PCV各閱讀框中，ORFl和0RF2為主要閱讀框，現(xiàn)已證實ORFl編碼是與病毒復(fù)制相關(guān)的R印 蛋白，而PCV-2的0RF2基因編碼病毒核衣殼蛋白(Cap)，是PCV-2主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是中 和抗體識別的主要靶蛋白，既可誘導(dǎo)體液免疫，又可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。Liu等將0RF2基因連接 到MBP-His (8) -tag基因3’端，在細(xì)菌中表達(dá)0RF2融合蛋白，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白可被抗PCV-2 多克隆抗體和PCV-2感染豬血清識別，表明0RF2蛋白與PCV-2的免疫反應(yīng)性有關(guān)。Truong 等用從實驗性感染豬制備的PCV-2抗血清，建立ELISA方法，發(fā)現(xiàn)PCV2-0RF2編碼蛋白具 有與抗原性相關(guān)的線性表位，其中從69-83和117-131殘基的兩個抗原表位對PCV-2來說 具型有特異性，0RF2抗原表位可以作為PCV-2感染的血清學(xué)標(biāo)志以檢測PCV-2抗體效價。PCV-2是目前嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要的病毒。目前對PCV-2的控制目前 尚無疫苗。因此發(fā)展新型疫苗來控制PCV-2已是當(dāng)務(wù)之急。減毒鼠傷寒沙門氏菌能通過粘附、侵襲、定居在腸道相關(guān)淋巴組織，有效地刺激機 體產(chǎn)生粘膜、細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，是攜帶抗原的良好載體和天然粘膜免疫佐劑，越來越廣 泛地應(yīng)用于疫苗接種。根據(jù)共同粘膜免疫理論，以減毒傷寒沙門氏菌為載體制成的口服疫 苗可在口腔、乳腺、生殖道、淚腺等粘膜部位誘發(fā)較強的粘膜免疫，且口服接種的方式安全。 特別是近來利用不以抗生素作為選擇壓力的載體-宿主平衡致死系統(tǒng)構(gòu)建的減毒鼠傷寒 沙門氏菌載體疫苗已顯示出良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體的PCV-2 口服減毒鼠傷寒沙門氏 菌活載體疫苗，可作為預(yù)防PRRS感染的口服活載體亞單位疫苗。本發(fā)明提供的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗，其包含PCV-2結(jié)構(gòu)蛋白0RF2， 其中，上述的抗原亞單位0RF2來源于PCV-2陜西分離株。
本發(fā)明還提供一種上述重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗的制備方法，步驟包 括1)制備0RF2基因。制備方法為用PCR方法擴增了 PCV-2陜西株0RF2基因，并 將其克隆到pGEM-T easy載體，構(gòu)建了 pGEM-T_0RF2質(zhì)粒；2)將上述的0RF2基因，插入到原核表達(dá)載體PYA3341的Ptrc啟動子下游，構(gòu)建含 PCV-2的0RF2基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341-0RF2 ；3)將上述重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341-0RF2轉(zhuǎn)入第一中間宿主菌內(nèi)進(jìn)擴增，所述的第 一中間宿主菌株優(yōu)選為大腸桿菌X6212 ；4)將上述重組表達(dá)質(zhì)粒PYA3341-0RF2轉(zhuǎn)入第二中間宿主菌內(nèi)進(jìn)行甲基化修飾， 獲得經(jīng)甲基化修飾的重組質(zhì)粒DNA。作為優(yōu)選，所述第二中間宿主菌株優(yōu)選為減毒鼠傷寒沙 門氏菌X3730 ；5)步驟4)中鑒定正確的甲基化修飾的重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化終宿主菌株。將步驟4 得到的甲基化修飾的重組質(zhì)粒DNA通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化終宿主菌株中，誘導(dǎo)表達(dá)，得到重 組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗。終宿主菌株優(yōu)選為減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550，其中所述 的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550優(yōu)選為asd基因缺陷型菌株。此外，上述制備方法還包括如下鑒定步驟6)鑒定步驟5)中得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗中0RF2的表達(dá)；7)通過Western免疫印跡檢測，檢測步驟5)中得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載 體疫苗中0RF2的免疫原性；8)重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗攻毒保護(hù)實驗；9)在有、無選擇壓力的情況下進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，鑒定重組減毒鼠傷寒沙門氏菌 載體疫苗穩(wěn)定性。具體地說，本發(fā)明提供一種制備豬圓環(huán)病毒重組活載體疫苗的方法重組表達(dá)質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化終末宿主菌X4550后，培養(yǎng)18h，離心收集菌體，測定重組菌的CFU，調(diào)整重組菌的濃 度使其達(dá)到101(lCFU/ml?？赏ㄟ^口服免疫或加強免疫，口服免疫具體可為約IXIOiciCFU/ 只/次，每次間隔1 2周；加強免疫具體可為口服免疫2 4次后間隔一定時間口服加 強免疫一次，這里所述的一定時問視生物體的情況而定，可以為一周或一個月等。上述的減 毒鼠傷寒沙門氏菌X4550優(yōu)選為asd基因缺陷型菌株。綜上所述，本發(fā)明采用平衡-致死系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)PCV-20RF2蛋白的重組減毒鼠 傷寒沙門氏菌載體疫苗株，并且構(gòu)建的疫苗株無論有無選擇壓力均能穩(wěn)定地在體外傳代 培養(yǎng)，通過口服疫苗菌株免疫方案免疫小鼠和豬后證明該疫苗具有良好的免疫原性和免疫 保護(hù)效果。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果為1)成功構(gòu)建了重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體PYA3341-0RF2，可在宿主菌中表達(dá) PCV-2含有病毒中和表位的主要結(jié)構(gòu)蛋白0RF2。本發(fā)明的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌活載 體疫苗具有下述優(yōu)點可以口服，免疫者易于接受；能夠快速產(chǎn)生抗體，且產(chǎn)生的抗體水平 較高；所表達(dá)的靶抗原不需純化，可直接用于免疫保護(hù)試驗，免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工 序；價格低廉；易于生產(chǎn)、儲存和運輸；可以避免現(xiàn)有技術(shù)中表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白分離純 化的繁瑣過程和缺陷例如費時費力，代價昂貴，不能大規(guī)模應(yīng)用于目的蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)
4寸。2)本發(fā)明利用鼠傷寒沙門氏菌是腸道菌得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌可刺激 小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫，尤其有效地激發(fā)粘膜免疫應(yīng)答；3)該載體-宿主平衡致死系統(tǒng)表達(dá)的0RF2蛋白可與PCV-2抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。4)本發(fā)明得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌對實驗動物是安全的，無任何病理現(xiàn)象 出現(xiàn)。5)本發(fā)明得到的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌具有很好的體外遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)多次傳 代后外源基因不丟失。6)本發(fā)明所使用的目的基因為PCV_2(血清2型，自陜西分離)國內(nèi)分離株，從而 構(gòu)建的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌可作為我國預(yù)防PRRS的口服活載體疫苗。7)將0RF2基因克隆入原核表達(dá)載體而不是真核表達(dá)載體，降低了操作難度，提高 了表達(dá)水平，制備方法易于大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1是重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341-0RF2構(gòu)建流程圖；圖2是PCV-20RF2基因的克??；圖2中標(biāo)號說明M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)， 泳道1為PCV-20RF2基因PCR結(jié)果(大約570bp)。圖3是重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341-0RF2經(jīng)雙酶切獲得目的基因，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu) 建成功；圖3中標(biāo)號說明M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)，泳道1為PCV-20RF2基因PCR結(jié) 果，泳道2為重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341-0RF2經(jīng)雙酶切獲得目的基因-0RF2鑒定結(jié)果，泳道3 為表達(dá)質(zhì)粒PYA3341經(jīng)雙酶切鑒定結(jié)果；圖4是重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341-0RF2PCR鑒定；圖4中標(biāo)號說明M為DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)(Marker)；泳道1為重組質(zhì)粒pYA3341_0RF2PCR鑒定結(jié)果；圖5是重組蛋白0RF2的表達(dá)的SDS-PAGE分析；圖5中標(biāo)號說明M為蛋白分子量 標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為重組鼠傷寒沙門氏菌PYA3341蛋白分析，無23ku的0RF2蛋白表達(dá)；泳道2 為重組鼠傷寒沙門氏菌PYA3341-0RF2蛋白分析，表達(dá)了 23ku的0RF2蛋白；圖6是重組0RF2蛋白的Western blot分析；圖6中標(biāo)號說明泳道1為同PCV-2 陽性血清反應(yīng)的重組鼠傷寒沙門氏菌PYA3341-0RF2表達(dá)的0RF2蛋白，2為重組鼠傷寒沙門 氏菌pYA3341表達(dá)的蛋白與PCV-2陽性血清不反應(yīng)(負(fù)對照)；圖7小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、回腸末端免疫熒光檢測結(jié)果，其中7A為小鼠脾臟陰 性對照(X200)，7B為免疫后小鼠脾臟免疫熒光檢測(X200)，7C為小鼠腸系膜淋巴結(jié)陰性 對照(X200)，7D為免疫后小鼠腸系膜淋巴結(jié)免疫熒光檢測(X200)，7E為小鼠回腸末端陰 性對照(X200)，7F為免疫后小鼠回腸末端免疫熒光檢測(X200)；
圖8重組菌的生長曲線； 圖9免疫小鼠血清抗體水平； 圖10免疫豬血清抗體水平。
具體實施例方式本發(fā)明利用pYA3341的載體-宿主平衡致死系統(tǒng)表達(dá)PCV-20RF2保護(hù)性抗原，構(gòu) 建以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體的PCV-2疫苗，并通過動物實驗觀察重組載體疫苗的免疫原性及免疫保護(hù)性，為發(fā)展新型的PCV-2疫苗提供實驗依據(jù)。本發(fā)明用PCR方法擴增了 PCV-2陜西株0RF2基因(具體序列見SEQID NO. 1)，并將 其克隆到pGEM-T easy載體，構(gòu)建了 pGEM_T_0RF2質(zhì)粒。酶切pGEM_T_0RF2質(zhì)粒，回收0RF2 基因。將回收的0RF2插入到表達(dá)載體pYA3341的Ptrc啟動子下游，構(gòu)建含PCV-2的0RF2 的重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341-0RF2 ；將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主-載體平衡致死表達(dá)系統(tǒng) 感受態(tài)大腸桿菌X6212內(nèi)，使其進(jìn)行大量克隆，并用萘啶酮酸進(jìn)行營養(yǎng)篩選。篩選后的重組 質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)入宿主_載體平衡致死表達(dá)系統(tǒng)的中間宿主菌沙門氏菌X3730甲基化修飾，同 樣用萘啶酮酸進(jìn)行營養(yǎng)篩選。篩選的經(jīng)甲基化修飾的重組質(zhì)粒最后轉(zhuǎn)入宿主-載體平衡致 死表達(dá)系統(tǒng)的終末宿主菌沙門氏菌X4550，萘啶酮酸進(jìn)行營養(yǎng)篩選。重組表達(dá)質(zhì)粒分別經(jīng)聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、酶切鑒定、免疫蛋白印記(western blot)試驗進(jìn)行檢測，篩選獲得陽 性重組表達(dá)質(zhì)粒菌株；將篩選的陽性重組表達(dá)質(zhì)粒菌株分別免疫BALB/c小鼠和豬并進(jìn)行 了免疫學(xué)指標(biāo)的檢測。本發(fā)明所用的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550具有如下特征其為asd基因缺陷型細(xì) 菌，由于asd基因是DAP ( 二氨基庚二酸，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分)生物合成途徑 中必需的酶，該基因的缺失可導(dǎo)致該突變株在無外源性DAP存在的條件下溶菌死亡，從而 高效減毒。減毒鼠傷寒沙門氏菌能表達(dá)外源抗原，在哺乳動物中經(jīng)口、鼻、直腸等粘膜途徑 免疫能誘導(dǎo)強大而特異的免疫反應(yīng)。能夠定居在宿主小腸和腸相關(guān)淋巴組織，不致病并且 能穩(wěn)定表達(dá)外源基因。所表達(dá)的靶抗原不需純化，可直接用于免疫保護(hù)試驗，免去了蛋白質(zhì) 后處理的復(fù)雜工序。下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅以舉例的方式提供，用于 對本發(fā)明中的制備方法進(jìn)行詳細(xì)描述，以便更容易地理解本發(fā)明，應(yīng)理解的是，這些實施例 僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的 簡單改進(jìn)，都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。下面敘述本發(fā)明的具體實施方法實施例1、PCV-2陜西株0RF2基因的克隆1. 1引物的設(shè)計根據(jù)發(fā)表的PCV-2GX株(GenBank :EF675237)的基因組序列，設(shè)計1對特異性引物 (P1/P2)。上游引物 Pl:5' -CCG GAATTCGCATGaatggcatcttc-3‘ 5'端加上 EcoR I 酶切 位點，下游引物P2:5' -ACGGTCGAC AAGTGGGGGGTCTTTAAG-3‘，5'端加上 Sal I 酶切位點。 預(yù)期擴增片斷為570bp，含有去掉N端核定位區(qū)基因的完整的0RF2基因。1.2病毒基因組 的提取1. 2病毒基因組的提取取出-80°C保存的PCV-2細(xì)胞毒，按照寶生物工程(大連)有限公司的病毒DNA 提取試劑盒說明書提取病毒DNA。PCR反應(yīng)體系如下10 XPCRBuffer 5 μ L、dNTPs 4μ L, Ρ1/Ρ2 各 1 μ L、rTaq 1 μ L、病毒 DNA 3 μ L、加水至 50 μ L。反應(yīng)程序95°C變性 5min ；94°C lmin，56°C 45s, 72°C 1. 5min，共30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后取10 μ L PCR產(chǎn)物加入適量6 X Loading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴增產(chǎn)物。1. 3PCR產(chǎn)物的純化與回收參照上海生工UNIQ-10膠回收試劑盒說明書回收目的基因。
2.大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)以無菌接種環(huán)刮取凍存于-80°C冰箱的大腸桿菌DH5ci菌種，劃線接種于不含氨 芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)16h左右。挑取單一菌落，接種到100ml LB培養(yǎng) 基中，37°C、250r/min振搖培養(yǎng)到0D600 = 0. 4 0. 6，在無菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到 兩個無菌并以冰預(yù)冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無菌)，冰浴lOmin，使培養(yǎng)物冷卻 到 0°C ；4°C>2000r/min 離心 lOmin，棄上清，以 IOml 用冰預(yù)冷的 75mmol/L CaC12、IOmmol/ L(pH6. 5)溶液重懸沉淀，冰浴10min,4°C,2000r/min離心lOmin，棄上清，以2ml用冰預(yù)冷 的，含 15% ν/ν、)甘油的 75mmol/L CaC12、10mmol/L Tris .Cl(pH6· 5)溶液重懸每管沉淀， 用無菌吸頭將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無菌微量離心管中，每管200μ 1 ；標(biāo)明菌株、體積和日期， 置-80°C冰箱凍存?zhèn)溆谩?. 0RF2基因片段與pGEM-T easy載體的連接反應(yīng)取0. 5 μ g pGEM-T載體，力Π 3 5倍摩爾量的0RF2DNA片段，2 μ 1 5 X連接緩沖液 加水定容至10 μ 1，最后加入IWeiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16°C連接1 4h，取 7 μ 1連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化上述Ε. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。4.轉(zhuǎn)化將適量連接產(chǎn)物DNA (體積質(zhì)粒< 1 μ 1，連接產(chǎn)物< 10 μ 1，DNA < 50ng)加入 200 μ 1上述感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min ；42°C水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min ； 加入200 μ 1 37°C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37°C 150r/min振搖培養(yǎng)50min ；取培養(yǎng)液涂布于含 Amp (50 μ g/ml)的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)14 16h后，得到轉(zhuǎn)化菌落。5.質(zhì)粒的提取(堿裂解法)挑取單個上述轉(zhuǎn)化菌落，接種到2ml含50 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)液(下同)中， 370C 250r/min振搖培養(yǎng)12 16h ；將1. 5ml轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄 上清。以 200 μ 1 冰預(yù)冷的溶液 I (50rnmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris · Cl，ρΗ8· O ；IOmmol/ L EDTA, ρΗ8· 0)重懸沉淀，加入200 μ 1新配制的溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，顛倒 數(shù)次混勻，加入200 μ 1用冰預(yù)冷的溶液III(3mol KAc，5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4°C 12000r/min離心lOmin，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)，氯仿 /異戊醇(24 1)各抽提一次；加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，置-20°C 30min,4°C 12000r/min離心lOmin，棄上清，沉淀用70%冷乙醇洗滌抽干。以20 μ 1含終濃度20 μ g/ ml RNA 酶(無 DNA 酶)的 TE(10mmol/L Tri s · HCl, ρΗ8· 0，lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0，下同) 溶解沉淀，并于37°C水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-20°C保存。6.重組質(zhì)粒pGEMT-0RF2的酶切鑒定將1. 0 μ g質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18 μ 1，分別加入2 3單位EcoR I和Sal I限制性內(nèi)切酶及1 μ 1相應(yīng)的IOX限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離 心，置最適反應(yīng)溫度水浴2 3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。酶切結(jié)果均與預(yù)計完全相同者，即 為目的重組質(zhì)粒。完全酶切后，-20°C保存，以備進(jìn)一步鑒定或回收片段之用。7.攜帶PCV-20RF2基因重組表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoRI和SalI雙酶切pGEMT_0RF2質(zhì)粒，回收0RF2基因，將其插入到同樣經(jīng)過 EcoRI和SalI雙酶切的表達(dá)載體pYA3341，進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建含有0RF2基因的表達(dá)載體 PYA3341-0RF2。具體構(gòu)建過程如下
7. 1 制備 “NA” LB 平板將高壓蒸汽滅菌后的LB液體培養(yǎng)基(含1. 5%瓊脂粉)置超凈臺內(nèi)，待其溫度冷 卻至50°C左右時加入萘啶酮酸(NA)至終濃度為20 μ g/mL混勻后立即鋪制平板。7. 2大腸桿菌X6212感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)同大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。7. 30RF2基因片段與pYA3341載體的連接反應(yīng)取0. 5 μ g pYA3341載體，力Π 3 5倍摩爾量的0RF2DNA片段，2 μ 1 5 X連接緩沖 液加水定容至10 μ 1，最后加入IWeiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16°C連接1 4h， 取7 μ 1連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化上述大腸桿菌Χ6212感受態(tài)細(xì)胞。7. 4 轉(zhuǎn)化過程與步驟4相同。取培養(yǎng)液涂布于含NA(20 μ g/ml)的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng) 14 16h后，得到轉(zhuǎn)化菌落。7. 5質(zhì)粒的提取(堿裂解法)同步驟5方法7. 6重組質(zhì)粒pYA3341-0RF2的酶切鑒定將1. 0 μ g質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18 μ 1，分別加入2 3單位EcoR I和Sal I限制性內(nèi)切酶及1 μ 1相應(yīng)的IOX限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離 心，置最適反應(yīng)溫度水浴2 3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。酶切結(jié)果均與預(yù)計完全相同者，即 為目的重組質(zhì)粒。完全酶切后，-20°C保存，備用。8.甲基化修飾8. 1中間宿主菌X3730感受態(tài)的制備采用電轉(zhuǎn)化法制備減毒鼠傷寒沙門氏菌X3730感受態(tài)細(xì)胞，整個過程要求在無菌 條件下完成。具體實驗步驟如下(1)從-80°C冰箱取出減毒鼠傷寒沙門氏菌X3730，手握解凍，用無菌鉬絲直接蘸 取X3730菌種在LB平板(含50 μ g/ml DAP)表面劃線接種，37°C恒溫倒置培養(yǎng)16 18h ；(2)挑取1個直徑約為2 3mm的單菌落接種至4ml LB培養(yǎng)液(含50 μ g/mlDAP) 中，37°C，230r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過夜；(3)按1 100比例將培養(yǎng)物接種至50ml LB培養(yǎng)液(含50 μ g/ml DAP)中，37°C、 230r/min恒溫振蕩培養(yǎng)2 3h ；(4)取出100 200 μ 1培養(yǎng)物檢測0D600,當(dāng)0D600介于0. 8 1. 0之間時，將培 養(yǎng)物置于冰浴中l(wèi)Omin，使培養(yǎng)物冷卻到0°C ；(5) 40C，5000r/min離心IOmin收集菌體，棄去培養(yǎng)液；(6)用2 5ml 10%的滅菌甘油洗滌后離心，重復(fù)3次，用10%的滅菌甘油懸浮細(xì) 菌，使細(xì)菌數(shù)約2X 1010個/ml，100 150 μ 1/管分裝，標(biāo)明菌株、體積和日期，置_80°C冰 箱凍存?zhèn)溆谩?. 2pYA3341-0RF2 轉(zhuǎn)化 X3730 感受態(tài)(1)取2 3 μ 1 pYA3341-0RF2加入到Χ3730感受態(tài)細(xì)菌中，混勻；(2)將混合液立即轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯中，吸干電轉(zhuǎn)杯外面水跡，然后放 入電轉(zhuǎn)儀樣品槽中；
8
(3)轉(zhuǎn)化條件Cuvette Gap 0. 2cm, Voltage 2. 5kV, Field Strengh 12. 5kV/cm, Capacitor 25Uf, Resistor 200 Ω , Time Constant 4. 5 5. Omsec ；(4)電擊后，馬上取出電轉(zhuǎn)杯，迅速加入37°C預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基中(含50 μ g/ml DAP)，并將菌液轉(zhuǎn)移到無菌的印pendorf管中；(5) 370C、120r/min振搖培養(yǎng)45 60min，取100 150 μ 1菌液涂布于LB固體培 養(yǎng)基(含20μ g/ml ΝΑ)表面，將平板正放于37°C培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)液完全被吸收后，倒置培 養(yǎng)16 18h ；(6)從篩選出的含有重組質(zhì)粒PYA3341-0RF2的陽性菌X3730中提取出質(zhì)粒。8. 3獲得甲基化的重組質(zhì)粒PYA3341-0RF2陽性重組菌的鑒定因重組沙門菌中質(zhì)?？截悢?shù)較低，利用PCR法進(jìn)行鑒定，將PCR鑒定正確的重組子 電轉(zhuǎn)入終宿主菌X4550中，方法同前，并經(jīng)PCR方法和雙酶切鑒定，具體方法同前述方法。9.構(gòu)建口服活載體疫苗菌株9. 1終末宿主菌X4550感受態(tài)細(xì)胞的制備(電轉(zhuǎn)化法)同8. 1方法中間宿主菌X3730制備方法9. 2甲基化重組質(zhì)粒pYA3341-0RF2轉(zhuǎn)化X4550中間宿主菌X3730的轉(zhuǎn)化方法同8. 2方法。同法構(gòu)建空質(zhì)粒菌X4550 (pYA3341) 作為陰性對照。9. 3陽性重組菌的鑒定因重組沙門菌中質(zhì)?？截悢?shù)較低，利用PCR法進(jìn)行鑒定，將PCR鑒定正確的重組子 電轉(zhuǎn)入終宿主菌X4550中，方法同前，并經(jīng)PCR方法和雙酶切鑒定，具體方法同前述方法。10.重組工程菌的誘導(dǎo)將重組工程菌接種于3ml LB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)的重 組工程菌按的比例轉(zhuǎn)種于20ml LB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)(200r/分鐘)待0D_ = 0. 8時，加入IPTG至終濃度為lmmol/L開始誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)后4小時取樣并測定其0D600值， 同時作空載體菌誘導(dǎo)對照。實施例2、SDS-PAGE檢測PCV-20RF2蛋白的表達(dá)重組菌X4550 (pYA3341-0RF2)和空質(zhì)粒菌 X4550 (pYA3341)分別接種于含 20 μ g/ ml NA的LB液體培養(yǎng)基中37°C振搖18h后，離心棄上清，收集菌體，加0. OlM(pH7. 2)PBS 溶液重懸菌體后，加5X蛋白上樣Buffer，煮沸15min，離心收集上清，于12 %凝膠進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。配制SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，待凝膠完全聚合后，拔出上樣梳，用陰級 緩沖液清洗上樣孔并用濾紙吸干孔內(nèi)水分。待測樣本與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)同時上樣，當(dāng)考馬 斯亮藍(lán)到達(dá)凝膠底部時停止電泳。凝膠于固定液中固定30 60分鐘，考馬斯亮藍(lán)加熱至 60°C染色20分鐘，脫色液脫色至背景無色。UVP掃描分析電泳結(jié)果。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SDS-PAGE電泳顯示0RF2基因在重組沙門氏菌X4550中有較高 水平的表達(dá)，有分子質(zhì)量約為23ku的目的蛋白條帶出現(xiàn)，與預(yù)期的去掉信號肽0RF2蛋 白分子量一致，而對照組菌未出現(xiàn)該蛋白條帶(圖5)。該實驗結(jié)果證明了重組沙門氏菌 X4550 (pYA3341-0RF2)中能夠表達(dá) 0RF2 蛋白。實施例3、Western免疫印跡檢測0RF2蛋白的免疫反應(yīng)性按照上述方法先進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉或3%牛血清白蛋白緩沖液(lOmmol/L Tri s Cl, pH7. 5,150mmol/ LNaCl，0. 05% Tween20)37°C 封閉 2h，洗滌緩沖液(lOmmol/L Tris · Cl ρΗ7· 5，150mmol/ L NaCl,0. 05% Tween20)洗滌3次，每次10 15min，將豬抗PCV-2陽性血清用封閉緩沖 液稀釋(1 300)覆蓋膜上，室溫感作2h，洗滌3 5次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬 IgG(l 2000)室溫感作2h，洗滌3 5次后，每次10 15min，最后用蒸餾水清洗一次，夾 出PVDF膜稍晾干，配制ECL (enhanced chemiluminescence)工作液，在可見光下室溫孵育 膜數(shù)分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片 壓在膜上曝光數(shù)秒到數(shù)分鐘，顯影定影后蛋白質(zhì)條帶可清晰顯示在X光膠片上。Western blot結(jié)果顯示，在23ku處位置上有相應(yīng)的蛋白條帶(圖6)，證明了重組 沙門氏菌X4550 (pYA3341-0RF2)中表達(dá)的0RF2蛋白能很好地與PCV-2陽性血清特異性結(jié)合。實施例4、重組菌體外穩(wěn)定性試驗將37°C振蕩培養(yǎng)過夜的菌體按10%接種于含50 μ g/ml DAP的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù) 培養(yǎng)12h，將上述培養(yǎng)物再按10%量接種于含50 μ g/ml DAP的LB液體中培養(yǎng)12h，如此連 續(xù)培養(yǎng)四代至50h，相當(dāng)于菌體傳代100代。將培養(yǎng)物稀釋IO6倍，取100 μ 1稀釋液涂含 50 μ g/ml DAP的LB瓊脂平板，過夜培養(yǎng)后，隨機挑選100個單菌落，轉(zhuǎn)種在DAP-的LB瓊脂 平板上，如果質(zhì)粒丟失，細(xì)菌不會在DAP-的LB瓊脂平板上生長，以此測定重組質(zhì)粒的穩(wěn)定 性。隨機挑取20個菌落重培養(yǎng)，且進(jìn)行PCR和酶切鑒定，以確定外源基因在鼠傷寒沙門氏 菌宿主表達(dá)的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，兩種重組菌中有選擇壓力組的各100個菌株，在不含DAP的 平皿上生長的菌落數(shù)都為100個。各隨機挑取20個菌落提取質(zhì)粒，顯示100%含有重組質(zhì) 粒。在無選擇壓力組，重組X4550 (pYA3341-0RF2)和X4550 (pYA3341)菌傳代后所挑取的 100個菌落，在不含DAP的平皿上僅分別生長86和84個菌落，表明DAP非依賴性細(xì)菌占 86%和84%。從中隨機挑取20個菌落提取質(zhì)粒，顯示分別有16和15個含有重組質(zhì)粒，DAP 非依賴性細(xì)菌重組質(zhì)粒的陽性率分別為80%和75%。上述實驗結(jié)果說明依賴asd基因的宿主質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)保護(hù)的重組減毒沙門 氏菌質(zhì)粒在體外不丟失，在體外能穩(wěn)定傳代。實施例5、重組菌生長曲線的測定挑取單克隆X4550(pYA3341-0RF2)和 X4550 (pYA3341)分別接種于含 20 μ g/ml NA 的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)IOh后，取50 μ 1接種于5ml含20 μ g/ml LB液體培養(yǎng) 基中，37°C振蕩培養(yǎng)，每隔Ih測定0D600值，繪制兩種菌的生長曲線。重組菌生長曲線的測定結(jié)果如圖8，從圖8可以看出兩種重組菌在接種3h后細(xì)菌 呈對數(shù)生長，在12h以后0D600nm值開始穩(wěn)定。重組菌生長曲線的測定結(jié)果表明，兩種菌的生長狀態(tài)基本一致，即表示在減毒鼠 傷寒沙門氏菌中轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒，不影響該菌的生長。實施例6、重組菌的安全性試驗重組菌的安全性，通過BALB/c小鼠口服不同劑量來確定。取BALB/c小鼠各27只，分為3組，其中2組分別口服兩種重組菌1 X IO12Cfu/只，陰性對照組口服等體積PBS溶 液，觀察小鼠口服菌株后的反應(yīng)及成活率。試驗結(jié)果，BALB/c小鼠 口服重組菌X4550 (pYA3341_0RF2)和 X4550(pYA3341) 1.0 X IO12Cfu 30d后，存活率仍為100%。與PBS對照組相比較，體重變化 無明顯差別，且無活動異常等不良反應(yīng)。由此可見，重組菌株對小鼠是安全的。實施例7、重組疫苗株口服免疫后在小鼠脾、腸系膜淋巴結(jié)、回腸末端定植的檢測重組菌經(jīng)LB培養(yǎng)液培養(yǎng)后，用滅菌生理鹽水洗滌1次，重懸于滅菌生理鹽水中，以 每只5 X IO9CFU活菌液口服免疫BALB/c雌性小鼠。免疫后隨機分為6組，每組5只，于免 疫后第2、7、14、21、28和35日各取1組，無菌取小腸、腸系膜淋巴結(jié)和脾臟，研磨后分別涂 于含20 μ g/ml萘啶酮酸的LB平板上，37°C培養(yǎng)18h，菌落計數(shù)，統(tǒng)計分析。取疫苗免疫后的 小鼠脾、腸系膜淋巴結(jié)和回腸末端進(jìn)行沙門氏菌免疫熒光檢測。 實驗結(jié)果表明，口服免疫后第2日，腸系膜淋巴結(jié)和脾臟定居的重組菌尚較少，隨 后漸增多，至第28日腸系膜淋巴結(jié)測不到定居的重組疫苗菌，脾臟于第35日也測不到重 組疫苗菌(參見表1)。由此可見，該重組疫苗能較持續(xù)在體內(nèi)存活28天左右，這有利于持 久刺激機體的免疫應(yīng)答。免疫熒光染色結(jié)果表明，重組菌X4550(pYA3341-0RF2)免疫組小 鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和小腸可以看到較強的熒光，重組菌X4550(pYA3341)免疫組小鼠脾 臟、腸系膜淋巴結(jié)和小腸切片沒有熒光(圖7)，該現(xiàn)象證明重組菌定居在小鼠脾臟、腸系膜 淋巴結(jié)和小腸中，并表達(dá)出0RF2蛋白。表1重組菌X4550(pYA3341_0RF2) 口服免疫后在不同組織內(nèi)的定居
權(quán)利要求
一種重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗，其特征在于包含PCV 2ORF2抗原亞單位，且所述重組減毒鼠傷寒沙門氏菌帶有如SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗，其特征在于所述的抗原 亞單位來源于分離陜西株P(guān)CV-2。
3.—種在動物體內(nèi)產(chǎn)生PCV-2免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-2中任一 項所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗以口服接種的方式給予動物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在動物體內(nèi)產(chǎn)生PCV-2免疫應(yīng)答的方法，其特征在于所述的 動物為人工養(yǎng)殖豬或野豬。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的在動物體內(nèi)產(chǎn)生PCV-2免疫應(yīng)答的方法，其特征在于所述的 人工養(yǎng)殖豬或野豬為斷奶仔豬。
6.權(quán)利要求1所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗在制備預(yù)防或治療豬圓環(huán)病 毒病的藥物中的應(yīng)用。
7.—種權(quán)利要求1所述的重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗的制備方法，其特征在于 包括以下步驟1)通過PCR方法獲得PCV-20RF2基因；2)0RF2基因與原核表達(dá)載體pYA3341連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pYA3341_0RF2。3)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第一中間宿主菌株，獲得重組子；4)重組子轉(zhuǎn)化第二中間宿主菌株，鑒定陽性重組子；5)步驟4)中鑒定正確的陽性重組子轉(zhuǎn)化終宿主菌株；6)誘導(dǎo)表達(dá)，得到重組減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于步驟5)中所述的終宿主菌株為asd基 因缺陷型減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)PCV-2免疫原基因的口服減毒鼠傷寒沙門氏菌重組活載體疫苗及其制備方法和應(yīng)用。具體地說涉及一種口服減毒鼠傷寒沙門氏菌，所述重組減毒鼠傷寒沙門氏菌帶有SEQ ID NO.1所示的序列，該重組細(xì)菌能表達(dá)PCV-2衣殼蛋白ORF2。將所述減毒鼠傷寒沙門氏菌接種LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，調(diào)整細(xì)菌濃度為1010CFU/ml，制得一種安全、有效的口服減毒鼠傷寒沙門氏菌活載體疫苗，用于預(yù)防豬圓環(huán)病毒病。
文檔編號A61P31/20GK101954074SQ20101021112
公開日2011年1月26日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者張琪, 童德文, 許信剛 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)