一種降解脂肪的基因重組釀酒酵母及構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及一種高效降解脂肪的基因重組釀酒酵 母。
[0002] 本發(fā)明還設(shè)及上述基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法。
[0003] 本發(fā)明還設(shè)及上述基因重組釀酒酵母在降解脂肪方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0004]隨著工業(yè)催化技術(shù)的發(fā)展，脂肪酶作為一種重要的生物催化劑現(xiàn)已成為研究熱 點。微生物源脂肪酶催化反應(yīng)時不需要輔酶、條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物少，廣泛應(yīng)用于食品 加工、生物柴油制備、酶傳感器等領(lǐng)域，是工業(yè)用脂肪酶的重要來源。然而，在實際應(yīng)用中存 在著酶成本高、活性低、穩(wěn)定性低等問題，篩選和開發(fā)具有新型催化活性和高穩(wěn)定性的微生 物脂肪酶成為當(dāng)前亟待解決的主要問題，基因工程技術(shù)為該問題的解決及該酶的應(yīng)用改造 提供了平臺。
[0005] 釀酒酵母是工業(yè)化發(fā)酵的常見菌種，生物安全性高，其表面展示系統(tǒng)能夠使外源 蛋白在細(xì)胞表面大量表達。細(xì)胞表面展示技術(shù)的原理是將外源膚W融合蛋白的形式固定在 細(xì)胞的外膜，被表達的多膚可W保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，該技術(shù)集表達、純化 和固定于一體，在醫(yī)藥、食品、生物燃料、環(huán)境保護等多個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。截至目 前，對于密碼子改造后的Iip基因在釀酒酵母細(xì)胞表面展示是否可W提高酶活性，國內(nèi)外 尚未見相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種高效降解脂肪的基因重組釀酒酵母。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是提供一種上述基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的降解脂肪的基因重組釀酒酵母，含有外源脂肪酶 基因。
[0009] 本發(fā)明提供的上述基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，步驟為：
[0010]S1、按照釀酒酵母密碼子偏愛性，改造脂肪酶基因編碼序列，合成該基因；
[0011]S2、將脂肪酶基因與釀酒酵母表面展示載體PYDl連接構(gòu)建重組表達載體；
[001引S3、將上述構(gòu)建得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae化BYlOO中，構(gòu)建基因重組釀酒酵母。
[0013] 本發(fā)明提供的基因重組釀酒酵母可用于大量生產(chǎn)高純度脂肪酶，表達量高，成本 低，應(yīng)用范圍廣，為脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供一種新方法，為油脂精深加工、生物能源制備、 餐廚廢棄物資源化、工業(yè)脂肪酶源開發(fā)等方面提供技術(shù)參考。
【附圖說明】
[0014] 圖1是表達載體pYDl質(zhì)粒圖譜。
[0015] 圖2是重組脂肪酶釀酒酵母轉(zhuǎn)化子菌落PCR鑒定圖。
【具體實施方式】
[0016] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種表面展示脂肪酶的重組釀酒酵母，通過在細(xì)胞 表面表達脂肪酶，增大酶與底物的接觸面積，達到提高脂肪降解效率的目的。所述脂肪酶基 因連接到載體pYDl(見圖1)，并轉(zhuǎn)化到釀酒酵母僅cerevisiae化BYlOO中。同時，對該酶 特性進行了分析。
[0017] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的具體方案為：
[0018] 1)按照釀酒酵母密碼子偏愛性，改造脂肪酶基因編碼序列，合成該基因；
[0019] 2)將脂肪酶基因與釀酒酵母表面展示載體PYDl連接，構(gòu)建重組表達載體；
[0020] 扣將上述構(gòu)建得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae化BYlOO中，得到基因重組釀酒酵母。
[0021] W下為本發(fā)明技術(shù)方案的具體描述：
[0022] 質(zhì)粒及基因重組釀酒酵母的構(gòu)建：
[0023] 根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公布的脂肪酶基因編碼序列，經(jīng)密碼子改造后，進行全基 因合成；將人工合成的脂肪酶基因克隆到質(zhì)粒PYDl(購自Invitrogen生物技術(shù)有限公司， 貨號：V835-01)構(gòu)建表面展示表達載體；將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母邸YlOO(MATa ura3-52trplleu2Alhis3A200P巧4::HIS3prblA1.6RcanlGAL(pIU211:URA3))。 PCR方法驗證陽性轉(zhuǎn)化子，引物序列為：LIP1-GGATCCATGTCTGCTTCTTCT， LIP2-CTCGAGCAAACCCTTAGACTTCA。
[0024] 釀酒酵母的培養(yǎng)：
[00巧]Yro培養(yǎng)基：用于釀酒酵母（S.cerevisiae)的生長、培養(yǎng)。1%酵母提取物燈east extract) ,2%膜化蛋白腺（Typtone) ,2%葡萄糖（Glucose) ,2%瓊脂（Agar)(配制固體培 養(yǎng)基），1. 05kg/cm2、121. 3°C條件下滅菌20min。配制YPD固體培養(yǎng)基時，為防止葡萄糖在 高溫下發(fā)生焦化，不與瓊脂一起高溫滅菌，而采用過濾除菌后加入培養(yǎng)基中。
[0026]MD基本培養(yǎng)基：用于釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)、篩選。0. 67 %YNB(含硫酸錠，不含氨 基酸），2%葡萄糖（Glucose)，0. 01%亮氨酸(Xeucine)，0. 01%色氨酸（Trypto地an)(按試 驗要求添加），2%瓊脂（Agar)(配制固體培養(yǎng)基），1. 05kg/cm2、121. 3°C條件下滅菌20min。 2 %葡萄糖過濾除菌后加入培養(yǎng)基。
[0027] 釀酒酵母的活化：使用處于4°C保存的釀酒酵母前必須首先進行活化。用接種針 挑取一個釀酒酵母單菌落，在新的Yro平板上劃線，于30°C靜置培養(yǎng)2d。
[0028] 酶學(xué)特性分析：
[0029] 使用YTO培養(yǎng)基培養(yǎng)重組釀酒酵母，檢測不同反應(yīng)抑、溫度、化Cl濃度、抑制劑 和變性劑等對外源脂肪酶活性的影響，比較最優(yōu)反應(yīng)條件下密碼子改造對重組酶活性的影 響。
[0030] 本發(fā)明通過基因改造，將脂肪酶基因Iip轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞，實現(xiàn)了該蛋白在細(xì) 胞表面的展示，獲得了一株高效降解脂肪酶的基因重組釀酒酵母邸Y100-LIP。S下酸甘油 醋（0. 5% )平板檢測表明該重組酶具有脂肪酶生物學(xué)活性，在誘導(dǎo)4她時活性較高。該工 程菌所產(chǎn)酶的酶學(xué)特性：最適抑為8. 0 ;最適反應(yīng)溫度為55°C;1M化Cl可W刺激酶活增 加，3. 5M W下保持70%W上活性，表現(xiàn)出較強的耐鹽特性；對乙二胺四乙酸巧DTA)、十二燒 基硫酸鋼（SDS)、二硫蘇糖醇值TT)具有較高抗性，對咪挫、尿素抗性相對較弱；與出發(fā)菌株 邸YlOO相比，密碼子改造后重組酶活性提高了27.2%。W上特性表明該重組脂肪酶耐鹽、 耐高溫，對抑制劑和變性劑具有普遍抗性，對堿性環(huán)境表現(xiàn)出較強的適應(yīng)力，具有非常好的 市場應(yīng)用前景，可應(yīng)用于環(huán)境領(lǐng)域脂肪類物質(zhì)的降解，或工業(yè)領(lǐng)域脂肪酶的規(guī)模發(fā)酵與生 產(chǎn)。本發(fā)明提供的構(gòu)建方法簡單，適于標(biāo)準(zhǔn)化。
[0031] W下做詳細(xì)說明。
[0032] 1、目的序列獲得與表達載體構(gòu)建
[0033] 從Genbank上獲得脂肪酶基因編碼序列，分析釀酒酵母密碼子使用規(guī)律，使用偏 愛密碼子代替稀有密碼子。同時，在C端和N端分別引入BamHI和化Ol兩個酶切位點，獲 得改造的脂肪酶基因序列：
[0034] GGATCCATGTCTGCTTCTTTCTTGAAGTTCCCAATCGTTTTGGTTCACGGTTTGTTGGGTTTCGACAAG ATTGGTGGTATTTACCCATACTTCTACGGTATTAAGGAAGCTTTGGAAAAGGCTGGTGCTAAGGTTTACATTGCTAC TTTGTCTGCTTTGAACTCTAACGAATTGAGAGGTGAACAATTGTTGGAATTCGTTAGAAAGGTTCAAGCTGAAACTG GTGCTGCTAAGGTTAACTTGATTGGTCACTCTCAAGGTCCATTGGCTTGTAGATACGTTGCTGCTACTCACCCAGAA TTGATTGCTTCTGTTACTTCTGTTAACGGTGTTAACCACGGTTCTGAAGTTGCTGACTTGGTTAGATTGGCTTTGAC TCCAGGTAGATTGCCAGAATCTATTGCTAACGCTGCTATGTCTGCTTTCGGTCAATTGTTGTCTGCTTTGGCTGGTT CTCCAAGATTGCCACAATCTGGTATTGAAGCTTTGGAAGCTTTGACTTCTGAAGGTGTTGCTGCTTCCAACAACAAG TACCCACAAGGTTTGCCAGCTGAATGGGGTGGTGAAGGTAAGGAATTGGTTAACGGTGTTTACTACTACTCTTGGTC TGGTGTTATTGACTACAACCCATTGCACCAAGGTGCTAACAACTTGGACCCATTGCACGTTGCTATGTTGGCTTTCT CTATTTTGTTCACTAACGAAAGATTCCAAAACGACGGTTTGGTTGGTAGATACTCTTCTCACTTGGGTAAGGTTATT GGTTATGACTACTCTATGGACCACGTTGACGCTATTAACCAATTGGCTGGTGTTGTTGCTAACAACACTGACCCAGT TCAATTGTTCGTTGAACACGTTGCTAGATTGAAGTCTAAGGGTTTGCTCGAG
[0035] 按上述序列，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成改造的脂肪酶基因，使用常 規(guī)方法將該基因連接到質(zhì)粒PYDl上，得到重組質(zhì)粒pYD-lip，制備大腸桿菌D冊a感受態(tài) 細(xì)胞，采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D冊a中，獲得含有質(zhì)粒pYD-lip的陽性菌 株，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 2、重組質(zhì)粒pYD-lip的提取
[0037] 采用堿變性法，參考普通質(zhì)粒小提試劑盒的使用說明，具體方法如下：
[00測 （1)柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500yL的平衡液 BL，1200化pm離