在花瓣中發(fā)揮功能的來(lái)自藍(lán)豬耳的啟動(dòng)子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明設(shè)及新型啟動(dòng)子。更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明設(shè)及來(lái)自藍(lán)豬耳的類黃酬3'，5'-徑化酶 (W下簡(jiǎn)寫(xiě)為F3'5'H。）基因或黃酬合成酶（W下簡(jiǎn)寫(xiě)為FNS。）基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域及其利 用。
【背景技術(shù)】 通過(guò)利用基因重組技術(shù)，使有用的基因在目的植物中表達(dá)，可賦予其植物新的性狀。如 此制備的基因重組植物已被廣泛商業(yè)化栽培。因基因表達(dá)調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄階段進(jìn)行控制， 所W，轉(zhuǎn)錄調(diào)控在調(diào)控基因表達(dá)上也最為重要。即在適合的時(shí)期、適合的組織中、W適合的 強(qiáng)度轉(zhuǎn)錄目的基因，對(duì)制備產(chǎn)業(yè)上有用的基因重組植物非常重要。轉(zhuǎn)錄開(kāi)始在很多情況下 通過(guò)位于翻譯區(qū)域的5'側(cè)的DNA序列來(lái)控制。將確定基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，直接調(diào)控其頻率 的DNA上的區(qū)域稱為啟動(dòng)子。啟動(dòng)子有時(shí)存在于起始密碼子的5 '側(cè)數(shù)十bp處，多包含TATA盒 等的序列。其進(jìn)一步還在5'側(cè)具有結(jié)合各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的順式作用元件，運(yùn)些順式作用 元件的存在控制轉(zhuǎn)錄的時(shí)期、進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的組織、轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度等。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子根據(jù)其氨基酸 序列的不同被分為很多家族。例如，Myb型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、地LH(堿性/螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix loop helix))型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等為有名的家族。實(shí)際上，在很多情況下，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū) 域和啟動(dòng)子在相同意義上使用，并無(wú)嚴(yán)格的區(qū)別。 作為花色的主要成分的花色素巧為總稱為類黃酬的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一?；ㄉ厍傻念?色依賴于其結(jié)構(gòu)。即作為花色素巧的發(fā)色團(tuán)的花色素 B環(huán)的徑基數(shù)增加時(shí)變藍(lán)。代表性的花 色素中有花翠素、花青素、花葵素，B環(huán)的徑基數(shù)分別為3個(gè)、2個(gè)、1個(gè)。其中，花翠素最藍(lán)(參 照?qǐng)D1)。此外，還已知修飾花色素巧的芳香族酷基(香豆酷基、咖啡酷基等）的數(shù)量增加時(shí)， 花色素巧的顏色變藍(lán)（即最大吸收值向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)），花色素巧的穩(wěn)定性增加?；蜻€已 知，黃酬等的類黃酬與花色素巧共存時(shí)，顏色變藍(lán)變深。將此種效果稱為輔色素效果，黃酬 為輔色素的1種下參照非專利文獻(xiàn)1)。與花色素巧的生物合成有關(guān)的酶、編碼該酶的基 因已被充分研究（參照上述非專利文獻(xiàn)1)。例如，催化使B環(huán)的徑基數(shù)增加的反應(yīng)的酶為類 黃酬3 ' -徑化酶（W下簡(jiǎn)寫(xiě)為F3 'H。）和F3 ' 5 ' HdF3 'Η是花青素合成所必需的酶，F(xiàn)3 ' 5 'Η為花 翠素合成所必需的酶。因月季、康乃馨、菊花等不合成花翠素，所W，運(yùn)些植物中無(wú)藍(lán)色品 種。已有通過(guò)使F3'5'H基因在運(yùn)些植物中表達(dá)，從而使花色變藍(lán)的實(shí)例（參照國(guó)際公開(kāi)第 W01996/036716號(hào)、W下專利文獻(xiàn)4同第W02009/062253號(hào)）。黃酬通過(guò)FNS的催化由黃燒酬合 成。已有通過(guò)使黃酬合成酶基因在矮牽牛中表達(dá)而改變花色的實(shí)例（參照Plant Biotechnol 21 377-386(2004))〇 而且對(duì)于花色素巧的生物合成酶的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控也得到了結(jié)論。在位于運(yùn)些基因的 起始密碼子的5'側(cè)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域中，有結(jié)合了Myb型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、bHLH型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 的順式作用元件序列。已知Myb型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和地LH型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子控制矮牽牛、玉米、 紫蘇等的花色素巧的合成(參照上述非專利文獻(xiàn)1)。 在植物中負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子下也稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。）中，有在任何組織或發(fā) 育階段的任何時(shí)期均發(fā)揮功能的所謂組成型啟動(dòng)子、僅在特定器官·組織內(nèi)發(fā)揮功能的器 官?組織特異性啟動(dòng)子和僅在發(fā)育階段的特定時(shí)期表達(dá)的時(shí)期特異性啟動(dòng)子。作為用于使 有用基因在基因重組植物中表達(dá)的啟動(dòng)子，常用組成型啟動(dòng)子。作為代表性的組成型啟動(dòng) 子，有花挪菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、在其基礎(chǔ)上構(gòu)建的啟動(dòng)子下參照非專利文獻(xiàn)3)、Macl 啟動(dòng)子下參照非專利文獻(xiàn)4)等。但是，植物中，很多基因?yàn)榻M織·器官特異性或時(shí)期特 異性表達(dá)。其表明使基因進(jìn)行組織?器官特異性或時(shí)期特異性表達(dá)對(duì)植物是必需的。已有 利用此種組織?器官特異性或時(shí)期特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域進(jìn)行植物的基因重組的實(shí)例。還 有例如使用種子特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域使蛋白質(zhì)在種子中積累的實(shí)例。 對(duì)于在花瓣內(nèi)特異性發(fā)揮功能或在花瓣內(nèi)主要發(fā)揮功能的啟動(dòng)子及其利用，已有一些 報(bào)道。例如，已有使用來(lái)自金魚(yú)草或矮牽牛的查耳酬合酶基因的啟動(dòng)子，使F3'5'H基因在矮 牽牛和康乃馨內(nèi)表達(dá)而改變花瓣顏色的實(shí)例。并顯示出月季的查耳酬合酶基因的啟動(dòng)子在 月季、菊花中發(fā)揮了功能。也有通過(guò)使瓜葉菊的F3'5'H基因的啟動(dòng)子在矮牽牛中表達(dá)而改 變花色的實(shí)例。此外，還有為使F3'5'H基因在菊花花瓣中表達(dá)而使用菊花的黃燒酬3-徑化 酶基因啟動(dòng)子的實(shí)例。 但是，此種啟動(dòng)子在目的重組植物中，能在何種程度上發(fā)揮強(qiáng)的功能，是否能帶來(lái)目的 表現(xiàn)型，還很難預(yù)測(cè)。而且，轉(zhuǎn)入與宿主植物相同或類似的堿基序列或轉(zhuǎn)入基因在染色體中 進(jìn)行多拷貝或重復(fù)插入時(shí)，有時(shí)會(huì)引起基因的沉默(參照W下非專利文獻(xiàn)5)。因此，為使多 個(gè)外源基因表達(dá)而重復(fù)使用相同啟動(dòng)子，有時(shí)會(huì)引起基因的沉默，所W應(yīng)避免。此外，即使 說(shuō)與類黃酬的合成有關(guān)的酶基因在花瓣內(nèi)發(fā)揮功能，其表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)也不同。已知通常黃 酬、黃酬醇與花色素巧相比，會(huì)在花更早期的時(shí)候即表達(dá)。例如，為了改變花色，獲得表達(dá)時(shí) 間點(diǎn)不同的多個(gè)啟動(dòng)子在產(chǎn)業(yè)上非常重要。 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)1國(guó)際公開(kāi)第W096/25500號(hào) 專利文獻(xiàn)2國(guó)際公開(kāi)第WOO 1/72984號(hào) 專利文獻(xiàn)3國(guó)際公開(kāi)第W094/28140號(hào) 專利文獻(xiàn)4國(guó)際公開(kāi)第W005/17147號(hào) 非專利文獻(xiàn) 非專利文獻(xiàn) 1 Plant J.54,737-749,2008 非專利文獻(xiàn)2 Agri州hural and Biological Qiemistry,53,797-800,1989 非專利文獻(xiàn)3 lant Cell I^ysiology 1996,37,49-59 非專利文獻(xiàn)4 Plant Molecular Biology 1990,15,373-381 非專利文獻(xiàn)5 Annals of Bo化ny 1997,79,3-12

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明要解決的課題在于，提供用于改變植物花色的有用的新型啟動(dòng)子。 本發(fā)明者為解決上述課題而深入研究，不斷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了作為用于改變植物花色 的有用的新型啟動(dòng)子的來(lái)自藍(lán)豬耳的F3'5'H基因和FNS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，并確認(rèn)了其 有用性，從而完成了本發(fā)明。 即本發(fā)明如下。
[1 ]一種核酸，其特征在于，選自W下核酸： (1) 核酸，其由序列號(hào)20所示的堿基序列組成， (2) 核酸，其可作為藍(lán)豬耳F3'5'H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，且由對(duì)序列號(hào)20所示 的堿基序列進(jìn)行1個(gè)或多個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代的修飾后的堿基序列組成， (3) 核酸，其可作為藍(lán)豬耳F3'5'H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，且可與由序列號(hào)20所 示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，及 (4) 核酸，其可作為藍(lán)豬耳F3'5'H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，且與序列號(hào)20所示的 堿基序列有至少90 %的序列同一性。
[2 ] -種表達(dá)載體，其特征在于，包含所述[1 ]中所述的核酸。
[3] 根據(jù)所述[2]中所述的表達(dá)載體，其特征在于，包含序列號(hào)20所示的堿基序列。
[4] 一種非人宿主，其特征在于，通過(guò)所述[2]或[3]中所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
[5] -種植物或者其后代或它們的部分或者組織，其特征在于，轉(zhuǎn)入所述[1]中所述的 核酸。
[6] 根據(jù)所述[5]中所述的植物或者其后代或它們的部分或者組織，其特征在于，為切 花。
[7] -種切花加工品，其特征在于，為將所述[6]中所述的切花用作原料而得到的切花 加工品。
[引一種核酸，其特征在于，選自W下核酸： (1) 核酸，其由序列號(hào)12所示的堿基序列組成， (2) 核酸，其可作為藍(lán)豬耳F3'5'H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，且由對(duì)序列號(hào)12所示 的堿基序列進(jìn)行1個(gè)或多個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代的修飾后的堿基序列組成， (3) 核酸，其可作為藍(lán)豬耳F3'5'H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，且可與由序列號(hào)12所 示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，及 (4) 核酸，其可作為藍(lán)豬耳F3'5'H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，且與序列號(hào)12所示的 堿基序列有至少90 %的序列同一性。
[9 ] 一種表達(dá)載體，其特征在于，包含所述[引中所述的核酸。
[10] 根據(jù)所述[9]中所述的表達(dá)載體，其特征在于，包含序列號(hào)12所示的堿基序列。
[11] 一種非人宿主，其特征在于，通過(guò)所述[9]或[10]中所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
[12] -種植物或者其后代或它們的部分或者組織，其特征在于，轉(zhuǎn)入所述[引中所述的 核酸。
[13] 根據(jù)所述[12]中所述的植物或者其后代或它們的部分或者組織，其特征在于，為 切花。
[14] 一種切花加工品，其特征在于，為將所述[13]中所述的切花用作原料而得到的切 花加工品。
[1引一種核酸，其特征在于，選自W下核酸： (1) 核酸，其由序列號(hào)21所示的堿基序列組成， (2) 核酸，其可作為藍(lán)豬耳FNS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，且由對(duì)序列號(hào)21所示的 堿基序列進(jìn)行1個(gè)或多個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代的修飾后的堿基序列組成， (3) 核酸，其可作為藍(lán)豬耳FNS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，且可與由序列號(hào)21所示 的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，及 (4) 核酸，其可作為藍(lán)豬耳FNS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，且與序列號(hào)21所示的堿 基序列有至少90 %的序列同一性。
[16] -種表達(dá)載體，其特征在于，包含所述[1引中所述的核酸。
[17] 根據(jù)所述[16]中所述的表達(dá)載體，其特征在于，包含序列號(hào)21所示的堿基序列。
[1引一種非人宿主，其特征在于，通過(guò)所述[16]或[17]中所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
[19] 一種植物或者其后代或它們的部分或者組織，其特征在于，轉(zhuǎn)入所述[15]中所述 的核酸。
[20] 根據(jù)所述[19]中所述的植