以miR-155前體為模板制備RNA探針的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸診斷領(lǐng)域，具體設(shè)及一種WmiR-155前體為模板制備RNA探針的方 法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 巧光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是一種重要的 非放射性原位雜交技術(shù)，巧光染料標(biāo)記的特異核酸探針與細胞內(nèi)相應(yīng)的祀DNA或RNA分子雜 交，如果被檢測的染色體祀DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性， 由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而探針可W直接與染色體進行 雜交從而將特定的基因在染色體上定位。通過在巧光顯微鏡下觀察巧光信號，W確定與特 異探針雜交后結(jié)合了巧光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位，對待 測DNA進行定性、定量或相對定位分析。
[0003] 巧光原位雜交技術(shù)(FISH)具有很多優(yōu)點，無需放射性同位素標(biāo)記，安全性較高； FISH的實驗周期短，探針穩(wěn)定性強;通過多次免疫化學(xué)反應(yīng)，使其雜交信號放大，提高靈敏 度，檢測的靈敏度接近同位素探針雜交;FI甜的分辨率高達3-20Mb; FI甜可W用不同修飾核 巧酸分子標(biāo)記不同的探針，即可W制備成多色探針。
[0004] FISH技術(shù)已經(jīng)在基因定位、基因作圖、基因擴增和缺失的檢測、產(chǎn)前診斷、哺乳動 物染色體進化研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，特別是在腫瘤診斷方面，F(xiàn)ISH技術(shù)被廣泛用于 乳腺癌、膀脫癌、肺癌、淋己瘤等實體瘤的早期診斷、療效檢測、個體化治療和預(yù)后判斷等幾 個方面。cRNA探針比cDNA探針有更多的優(yōu)勢:避免了雙鏈cDNA探針在雜交反應(yīng)中兩條鏈之 間易復(fù)性的可能性，提高了雜交反應(yīng)的敏感性;cRNA與RNA之間形成的雜交體比cDNA-RNA雜 交體更穩(wěn)定;且cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響，因此雜交反應(yīng)后可用RNA酶 處理，W除去未結(jié)合的探針，可降低本底信號的影響。
[0005] 制備特異性強、靈敏度高和穩(wěn)定性強的腫瘤檢測探針，生產(chǎn)易保存和運輸相關(guān)試 劑及試劑盒，對腫瘤早期診斷和治療至關(guān)重要。研發(fā)出用于診斷和治療多種腫瘤的高品質(zhì) 探針及相關(guān)試劑盒，不僅能提高人民的健康水平，而且具有很大的經(jīng)濟效益、社會效益及廣 闊的市場前景。
[0006] miRNA是內(nèi)源性的非編碼RNA分子，由長約18~25個核巧酸組成的單鏈RNAs，呈高 度保守性、時序表達特異性W及組織表達特異性，是參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要致病因子， 在實體惡性腫瘤W及血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)病過程中起著重要的作用。miRNAs具有腫瘤的抑癌基 因與癌基因的雙重作用，參與了生物體的發(fā)育、增殖、分化和調(diào)亡等方面的調(diào)控。miRNAs對 其祀基因的轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)節(jié)非常重要，當(dāng)miRNAs和祀向mRNA完全或幾乎完全互補時，導(dǎo)致 目的mRNA的降解，當(dāng)miRNAs和祀向mRNA不完全互補時，則負調(diào)控翻譯過程，阻礙蛋白質(zhì)翻 譯。
[0007] 膜腺癌是惡性程度比較高的消化系統(tǒng)疾病，其起病隱匿、早期發(fā)現(xiàn)困難，一旦發(fā)現(xiàn) 多屬晚期，失去手術(shù)時機，能施行手術(shù)的患者只有15%-20%。目前，手術(shù)切除是膜腺癌治療 的唯一根治療法，但因其早期即可發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致膜腺癌手術(shù)切除治愈率低。
[0008] 膜腺癌腫瘤標(biāo)記物的診斷則包括許多方面，如血清類腫瘤標(biāo)記物、癌胚腫瘤標(biāo)志 物、基因類腫瘤標(biāo)志物及其他幾十種膜腺癌相關(guān)基因和它們表達的蛋白質(zhì)、生長因子、黏附 分子等。但上述標(biāo)記物檢測時均有不足之處，故需尋找更多的生物標(biāo)記，而近年來miRNA在 膜腺癌診斷中的運用是人們關(guān)注的熱點。膜腺癌的早期診斷和早期治療確實能提高膜腺癌 患者的生存率。因此，制備出膜腺癌的早期診斷相關(guān)miRNA RNA檢測探針至關(guān)重要。
[0009] miRNAs通過與勒ImRNA的3'端非編碼區(qū)（3'-unhanslational region，UTR)結(jié)合， 降解或者抑制mRNA的翻譯實現(xiàn)祀基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，從而參與祀基因功能的調(diào)節(jié)。miRNAs 可在腫瘤發(fā)生過程中調(diào)節(jié)細胞增殖或調(diào)亡，有些miRNAs還可作為原癌基因或抑癌基因調(diào)控 腫瘤，Bloomston等應(yīng)用miRNA忍片技術(shù)監(jiān)測326個miRNA的表達，研究表明在90%的膜腺癌 中21個miRNA上調(diào)和4個miRNA下調(diào)。運些miRNA的表達譜用于鑒別慢性膜腺炎和膜腺癌的準(zhǔn) 確性達到93% (Bloomston M,Frankel WL'Petrocca F et al,Mi;rcorRNAexpression patterns to differentiate pancratic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis [J] JAMA,2007,297(17) :1901-1908)〇Szafranska等對新鮮冰凍 標(biāo)本和16例膜腺細針穿刺標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可用于鑒別膜腺癌和膜腺良性疾病 (Szafranska-Schwarzbach AE1,Adai AT,Lee LS,Conwell DL,Andruss BF.Development of 曰 miRNA-b曰sed diagnostic assay for pancreatic duct曰1 曰denoc曰rcinom曰.Expert Rev Mol Diagn. 201 lApr; 11 (3) :249-57)?；痚等研究認為:miR-155表達增高是膜腺癌發(fā) 生的早期事件，可作為診斷導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液瘤的腫瘤標(biāo)志物化abbe N，Koorstra JB， Mendell JT,0fferhaus GJ,Ryu JK,Feldmann G,Mullendore ME,Goggins MG,Hong SM, Maitra A.MicroRNA miR-155 is a biomarker of early pancreatic neoplasia.Cancer Biol Ther.2009 化b;8(4):340-6)。
[0010] miR-155 前體基因定位于人染色體 21q21，是 BIC 基因（MIR155 host gene, B-cell receptor inducible gene)的241-262核巧酸編碼的，在正常情況下miR-155協(xié)助B細胞產(chǎn) 生高親和力抗體，調(diào)控免疫應(yīng)答。有研究表明，miR-155很可能在膜腺癌細胞中特異表達，與 膜腺癌的生物學(xué)特性存在密切關(guān)系，同時能積極反映膜腺癌的進展，可能是一個重要的預(yù) 后診斷標(biāo)志物（化t)be N,Koors1:ra JB,Mendell JT,0ffe;rhaus GJ,Ryu JK,Feldmann G, Mullendore ME,Goggins MG,Hong SM,Maitra A.MicroRNA miR-155is a biomarker of early pancreatic neoplasia.Cancer Biol Ther.2009Feb；8(4):340-6；Faraonia I, Antonettib FR,Cardonea J,Bonmassar E.miR-155 gene:A typical multifunctional microRNA.Biochimica et Bio地ysica Acta,2009,1792(6):497-505)0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種利用miR-155前體為模板制備RNA探針的方法。
[0012]本發(fā)明所述的WmiR-155前體為模板制備RNA探針的方法包括W下步驟:A.針對 miR-155前體序列設(shè)計至少一對引物，所述引物的PCR擴增產(chǎn)物為多重DNA片段，所述多重 DNA片段能包括所有祀序列;B.從miR-155前體cDNA質(zhì)粒中，采用步驟A的所述引物，通過PCR 擴增得到所述多重DNA片段，純化后混合，作為模板;C.加入RNA聚合酶和帶有生物素標(biāo)記的 UTP進行反應(yīng)，將UTP滲入產(chǎn)物，純化后得到RNA探針。
[OOU]根據(jù)本發(fā)明所述的WmiR-155前體為模板制備RNA探針的方法的進一步特征，所述 RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5 '端加上T7啟動子序列。
[0014]根據(jù)本發(fā)明所述的WmiR-155前體為模板制備RNA探針的方法的進一步特征，所述 RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶，引物的5 '端分別加上SP6啟動子序列。
[001引根據(jù)本發(fā)明所述的WmiR-155前體為模板制備RNA探針的方法的進一步特征，所述 RNA聚合酶是T3RNA聚合酶，引物的5 '端分別加上T3啟動子序列。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明所述的WmiR-155前體為模板制備RNA探針的方法的進一步特征，所述 RNA聚合酶是化C RNA聚合酶，引物的5 '端分別加上化C啟動子序列。
[0017] T7啟動子序列：5 ' -TAATACGACTCACTATAG-3'
[001 引 SP6啟動子序列：5 ' -CATACGATTTAGGTGACACTATA-3'
[0019] T3啟動子序列：5'-AATTAACCCTCACTAAAG-3'
[0020] Trc啟動子序列：5 ' -TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAAT-3'
[0021] 上述四種RNA聚合酶與相應(yīng)啟動子的組合為同類型的設(shè)計，可W替換使用。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種快速檢測膜腺癌相關(guān)的miR-155表達的試劑盒。
[0023] 本發(fā)明所述的試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明所述的方法所制備的RNA探針。
[0024] 本發(fā)明所述的方法只用一步反應(yīng)即可制備200-500nt理想長度的cRNA探針，并且 可直接用于下一步的雜交試驗，可W提高試驗效率，節(jié)約檢測時間。
[0025] 本發(fā)明所述的方法有利于篩選和制備高特異性探針，并可消除非編碼RNA及非特 異性信號的影響。
[0026] 本發(fā)明所述的方法制備的探針，其用途是生產(chǎn)在受試者樣本中區(qū)分相關(guān)疾病樣本 和正常樣本的試劑盒。
[0027] 本發(fā)明還提供了用于在受試者樣本中區(qū)分相關(guān)疾病樣本和正常樣本的試劑盒。
[0028] 本發(fā)明所述的用于在受試者樣本中區(qū)分相關(guān)疾病樣本和正常樣本的試劑盒，包 括：（a)適合于檢測相關(guān)疾病的檢測試劑；W及(b)適合于測定由所述檢測試劑檢測的相關(guān) 疾病