大黃素衍生物及其在制備抗hiv-1藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大黃素衍生物及其在制備用于治療HIV-ι藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類免疫缺陷病毒（HIV)是艾滋病（AIDS)的病原體。自AIDS流行以來，全世界 累計有7500萬HIV感染者，我國亦有將近75萬人感染HIV，2014年新報告感染者和病人達(dá) 10. 4萬例，較上年增加14. 8%。然而，目前世界上還沒有任何一個地區(qū)解決了艾滋病的治 療問題，HIV感染者人數(shù)將會持續(xù)增長。
[0003]目前有十幾種抗艾滋病病毒藥經(jīng)批準(zhǔn)用于治療艾滋病。國際公認(rèn)的治療方法是 "雞尾酒"或稱高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（即2種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑+1種蛋白酶抑制劑），這種 療法可以顯著降低感染者和艾滋病患者血漿病毒載量，延長生存時間，改善生活質(zhì)量。但 尚存在一些問題，如停藥后病毒載量反彈、不能恢復(fù)免疫功能、容易出現(xiàn)耐藥性、價格昂貴 (人年均費用約8萬元）、由于嚴(yán)重的毒副作用不能長期堅持用藥等。為了解決艾滋病治療 中存在的問題，可以采取的途徑有兩種，一種是發(fā)展新的有效、低毒、價廉的藥物，另一種是 探索新的治療方法。多年來，我們在第一種途徑，即發(fā)展新藥研制方面進(jìn)行了大量實驗室篩 選，發(fā)現(xiàn)了一些具有抗病毒活性的中草藥及提取物，并在實驗動物中也證明了其抗病毒作 用，這其中就包含有大黃來源的大黃素。
[0004] 大黃屬寥科植物，性味苦寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)。具有瀉下攻積、清熱瀉火、 解毒、止血、活血祛淤等多種功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，大黃有抗腫瘤、抗菌消炎、抗動脈硬 化、降血壓、瀉下利尿、保肝利膽、清除自由基等多種作用；同時還有抗流感病毒、乙型肝炎 病毒、單純皰疹病毒、柯薩奇病毒、風(fēng)疹病毒等作用。我們前期實驗結(jié)果也顯示，中藥大黃提 取物中大黃素能通過上調(diào)CC-趨化因子、I型干擾素、AP0BEC3G抑制HIV-1R5毒株在人巨 噬細(xì)胞中的感染。而且有研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬性，促進(jìn)干擾素分 泌，從而提尚小鼠免疫力。
[0005] 大黃素屬于蒽醌類化合物，其發(fā)揮抗病毒作用的主要部分為蒽醌，但是大黃素溶 解性很差，幾乎不溶于水，僅溶于堿和一些有機(jī)溶劑如乙醇、二甲基亞砜（DMS0)，而且穩(wěn)定 性比較差，容易氧化變質(zhì)。這成為大黃素臨床應(yīng)用開發(fā)的一大障礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本研究嘗試在保留蒽醌的基礎(chǔ)上，添加或者改變一些功能團(tuán)，使得新蒽醌類化合 物既能夠保留抗病毒的功能，又可以增加水溶性或脂溶性，具有更好的成藥性，未來用于 AIDS的治療。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)過化學(xué)修飾的大黃素衍生物，及其在用于治療HIV-1 的藥物的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的大黃素衍生物為以下結(jié)構(gòu)式所示：
[0009]
[0010] 式I，3-乙酸大黃素
[0011]
[0012] 式II，1，8-二己酰大黃素
[0013] 本發(fā)明所述的大黃素衍生物，是將商品化的大黃素經(jīng)過化學(xué)修飾得到的化合物。
[0014] 制備本發(fā)明的大黃素衍生物的反應(yīng)如以下反應(yīng)式所示：
[0015] 1、3-乙酸大黃素反應(yīng)式及鑒定
[0016] 反應(yīng)式：
[0019] 2、1，8-二己酰大黃素反應(yīng)式及鑒定
[0020] 反應(yīng)式：
[0023] 通過大黃素衍生物抗HIV-1的活性測定表明，本發(fā)明的大黃素衍生物能夠抑制 HIV-1在人巨噬細(xì)胞中的感染與復(fù)制。因此，可用于制備治療HIV-1的藥物。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種用于治療HIV-1的藥物，其含有上述本發(fā)明的大黃素衍生物 以及藥學(xué)上可接受的輔助劑。該藥物可以制成注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、懸浮劑、或乳劑 的形式使用，其給藥途徑可為口服、經(jīng)皮、靜脈或肌肉。
[0025] 大黃素衍生物3-乙酸大黃素和1，8-二己酰大黃素脂溶性和水溶性較大黃素好， 且無明顯毒副作用，為臨床用藥提供了新的選擇。
【附圖說明】
[0026] 圖1是3-乙酸大黃素的核磁氫譜圖。
[0027] 圖2是1，8-二己酰大黃素的核磁氫譜圖。
[0028] 圖3是3-乙酸大黃素和1，8-二己酰大黃素對人巨噬細(xì)胞的毒性作用的結(jié)果圖。
[0029] 圖4是3-乙酸大黃素和1，8-二己酰大黃素抑制HIV-1在人巨噬細(xì)胞中感染與復(fù) 制作用的結(jié)果圖。
[0030] 圖4a是HIV-1Bal毒株感染人巨噬細(xì)胞2h后，于感染后第8天收集細(xì)胞，Gag基 因mRNA表達(dá)圖；
[0031] 圖4b是HIV-1Bal毒株感染人巨噬細(xì)胞2h后，于感染后第8天收集細(xì)胞上清， ELISA檢測細(xì)胞上清中P24蛋白表達(dá)圖；
[0032] 圖4c是HIV-1Bal毒株感染人巨噬細(xì)胞2h后，于感染后第8天收集細(xì)胞，蛋白印 跡法測定細(xì)胞中P24表達(dá)圖；
[0033] 圖4d是在光鏡下觀察（X200倍），大黃素、3-乙酸大黃素和1，8-二己酰大黃素 處理后，人巨噬細(xì)胞中的病毒包涵體；
[0034] 圖5是3-乙酸大黃素和1，8-二己酰大黃素抗HIV-1作用的時間效應(yīng)圖。
[0035] 圖5a是人巨噬細(xì)胞中Gag基因mRNA的水平隨感染時間的變化而改變的圖；
[0036] 圖5b是人巨噬細(xì)胞上清中P24蛋白表達(dá)隨感染時間的變化而改變的圖；
[0037] 圖6是3-乙酸大黃素和1，8-二己酰大黃素抗HIV-1作用的劑量效應(yīng)圖。
[0038] 圖6a是人巨噬細(xì)胞中Gag基因mRNA的水平隨藥物濃度的變化而改變的圖；
[0039] 圖6b是人巨噬細(xì)胞上清中P24蛋白表達(dá)隨藥物濃度的變化而改變的圖；
【具體實施方式】
[0040] 通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施 例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。
[0041] 大黃素是分子量為270. 24的Γ3'8-三羥基-6-甲基蒽醌，其已商品化，下述 實施例中所用大黃素購于Sigma公司，其純度彡98 %。取2. 7mg大黃素通過二甲基亞砜 (DMS0)助溶溶解于10mL雙蒸水，超凈臺內(nèi)0. 45μm-次性過濾器過濾除菌，即為ImM大黃 素母液，4°C冰箱儲備備用。臨用時用完全DMEM(10 %FCS、2mmol/mL谷氨酰胺、100U/mL青 霉素、l〇〇yg/mL鏈霉素和非必需氨基酸）稀釋成不同濃度（0. 1μΜ，1μΜ，10μΜ，100μΜ， 1000以]\1)。0150終濃度低于0.2%。
[0042] 【實施例1】大黃素衍生物的制備、提純及鑒定
[0043] 3-乙酸大黃素：取125mg大黃素和138mg碳酸鉀加入5mL丙酮，50°C下回流反 應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入鹽酸調(diào)pH值1-2,過濾得紅色固體，于真空干燥箱中烘干。將該產(chǎn)物 74. 3mg于圓底燒瓶加入34. 7mg氫氧化鈉和15mL乙醇，30°C攪拌4h，將反應(yīng)液放至無液體 析出，加水稀釋，用鹽酸調(diào)pH值1-2,用乙酸乙酯萃取水相，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥放干， 得到紅色固體，通過核磁鑒定產(chǎn)物為3-乙酸大黃素（圖1)。
[0044] 1，8-二己酰大黃素：取lg大黃素溶于50mL圓底燒瓶中，無水無氧操作，加入20mL 無水吡啶，_5°C攪拌，緩慢滴加3.lmL乙酰氯，反應(yīng)8h，待原料已基本反應(yīng)完，將反應(yīng)液放干 加入100mL二氯甲燒稀釋，分別用50mL的1M鹽酸飽和碳酸氫鈉溶液以及飽和含鹽水各萃 取兩次，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥。將產(chǎn)物稱取330mg與15. 8mg咪唑于25mL圓底燒瓶，無 水無氧操作于-5°C加入5mL甲基啦略燒酮，最后加入0.12mL苯硫酸反應(yīng)4.5h。產(chǎn)物干燥 放干，得到淡黃色顆粒狀固體，通過核磁鑒定產(chǎn)物為1，8-二己酰大黃素（圖2)。
[0045] 【實施例2】MTT法檢測大黃素衍生物3-乙酸大黃素和1，8-二己酰大黃素的細(xì)胞 毒性作用
[0046] 將健康獻(xiàn)血者抗凝血與淋巴分離液（OrganonTeknikaCorp,Durham)混合，1500g 離心45min以分離單核細(xì)胞。收集單核細(xì)胞層，用DMEM懸浮，并接種到2%明膠包被的培養(yǎng) 皿中，于37°C孵育45min后，用DMEM洗去未黏附的細(xì)胞。貼壁細(xì)胞經(jīng)EDTA消化后，用完全 DMEM(10%FCS、2mmol/mL谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和非必需氨基酸） 重懸，并按1〇5/孔接種于96孔板中。初步純化后，經(jīng)非特異性酯酶染色和熒光篩選⑶14單 克隆抗體（Leu-M3)及低密度脂蛋白（LDL)證實，孔內(nèi)98. 5%的細(xì)胞為單核細(xì)胞，并經(jīng)培養(yǎng) 7天后，分化為單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞（MDM)。分別加入100μL用DMEM(含2%胎牛血 清，V/V)稀釋成不同濃度（0. 1μΜ，