黃芩素在制備具有抗內(nèi)毒素活性的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及黃芩素的新用途，特別涉及黃芩素在制備具有抗內(nèi)毒素活性的藥物中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細菌產(chǎn)生的各種致病因子中的內(nèi)毒素（Endotoxin，ET)對動物機體的作 用，是造成動物機體產(chǎn)生疾病甚至死亡的主要原因。內(nèi)毒素（Endotoxin)是大腸桿 菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌等革蘭氏陰性（G-)菌的細胞壁外壁層上的特有結(jié)構(gòu)脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)成分。細菌在生活狀態(tài)時不釋放出來，只有當(dāng)細菌死亡自溶或 粘附在其它細胞時，才表現(xiàn)其毒性。
[0003] 內(nèi)毒素進入機體后可引起機體的發(fā)熱反應(yīng)以及血小板的黏附、聚集，觸發(fā)凝血 系統(tǒng)，導(dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC)，還可引起引起全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic Inflammatory responses yndrome, SIRS)或膿毒癥（sepsis)，并導(dǎo)致心肌損害、肺損傷、肝 衰竭、腎衰竭、胃腸道損傷等多器官功能障礙（MODS)等。
[0004] 中醫(yī)認為黃芩有清熱解毒的作用，但對于其對內(nèi)毒素活性作用的研究還屬于空 白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于公開黃芩素的新用途。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：黃芩素在制備具有抗內(nèi)毒素活性的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 所述具有抗內(nèi)毒素活性的藥物為體外能夠起到滅活內(nèi)毒素的作用的藥物。
[0008] 所述體外能夠起到滅活內(nèi)毒素的作用的藥物為能夠起到降解內(nèi)毒素的作用的藥 物。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是：
[0010] 本發(fā)明開辟了黃芩素的新用途，為抗內(nèi)毒素的治療提供了新的藥物。
【具體實施方式】
[0011] 下述實施例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。
[0012] 實施例1 :黃芩素試管凝膠法抗內(nèi)毒素
[0013] Ll黃芩素溶液的準備
[0014] 精密稱取黃芩素 lmg，放入帶鋁蓋無熱原試管，加內(nèi)毒素檢查用水（BET水）（提前 預(yù)熱到30°C )定容至lmL，制成濃度分別為：lmg/mL供試品原液，禍旋5min左右，使其充分 溶解混勻，即得。
[0015] 1. 2細菌內(nèi)毒素工作標準品的稀釋
[0016] 取細菌內(nèi)毒素工作標準品（10EU/支）數(shù)支，每支準確加入BET水lmL，充分渦旋 混合15min，得濃度為lOEU/mL的細菌內(nèi)毒素工作標準品，然后依次稀釋成濃度為5、1、0. 5、 0. lEU/mL的內(nèi)毒素溶液，每稀釋一次渦旋30s。
[0017] 1.3鱟試劑的溶解
[0018] 取鱟試劑干粉數(shù)瓶，每瓶準確加入BET水2. 2ml，緩慢搖動，使其溶解，盡量防止氣 泡產(chǎn)生。配制好的鱟試劑必須在IOmin內(nèi)用完，否則應(yīng)丟棄。
[0019] L 4鱟試劑凝膠法試驗過程
[0020] 分別取上述各稀釋濃度內(nèi)毒素溶液0.1 ml加入已裝有0.1 ml黃芩素標準品溶液的 試管中，封口混勻后置37°C水浴60min，取各混合液0.1 ml加入0.1 ml鱟試劑中，封口混勻 后置37°C水浴60min，觀察內(nèi)毒素與鱟試劑作用后凝膠生成情況，每個樣品均設(shè)2個重復(fù)， 同時設(shè)立內(nèi)毒素陽性、BET水陰性及和各供試品藥物對照。
[0021] 根據(jù)各試管內(nèi)產(chǎn)生凝膠情況，判定供試品對內(nèi)毒素活性的影響：緩慢倒轉(zhuǎn)即流動 判為（-);緩慢倒轉(zhuǎn)180°管內(nèi)仍呈堅實凝膠不流動判為（ + );介于二者之間判為（±)。
[0022] 1. 5鱟試劑顯色基質(zhì)法試驗過程
[0023] 1.6標準曲線的建立
[0024] 取內(nèi)毒素工作標準品一瓶，加入1ml BET水，渦旋15mim，使其濃度為10EU/ml ;并 依次稀釋成濃度為l、〇. 5、0. 25、0. lEU/ml的內(nèi)毒素標準溶液。鱟試劑、顯色基質(zhì)、偶氮化試 劑1、偶氮化試劑2及偶氮化試劑3均按試劑盒說明說進行復(fù)溶。其中溶解的鱟試劑應(yīng)在 IOmin內(nèi)用完，顯色基質(zhì)溶液可在無污染的條件下于4°C貯存8h以內(nèi)，偶氮化試劑溶液可于 4°C貯存1周。
[0025] 實驗操作過程：取5支無熱原試管依次分別加入0.1 ml BET水、0. 1、0. 25、0. 5、 lEU/ml的內(nèi)毒素標準溶液，再分別加入0.1 ml鱟試劑溶液，混勻，37°C孵育lOmin。溫育結(jié) 束后，分別加入0.1 ml顯色基質(zhì)溶液，混勻，37°C孵育6min。溫育結(jié)束后，分別加入0. 5ml偶 氮化試劑1，混勻；再分別加入0. 5ml偶氮化試劑2,混勻；再分別加入0. 5ml偶氮化試劑3， 混勾，靜置5min，吸取混合液至無熱源96孔板內(nèi)，于545nm波長處讀取吸光度值。每個樣品 重復(fù)4孔，求取平均值，將實驗數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。
[0026] 1. 7實驗結(jié)果：
[0027] 實驗結(jié)果顯示：供試品對照組無凝膠產(chǎn)生，表明藥物本身對實驗結(jié)果沒有影響。 黃芩素與濃度為lOEU/mL的內(nèi)毒素溶液孵育后，有凝膠產(chǎn)生；而與濃度為5、1、0. 5、0.1 EU/ mL的內(nèi)毒素溶液孵育后，均無凝膠產(chǎn)生；所以，黃苳素在體外能夠起到滅活內(nèi)毒素的作用； (見表1)。
[0028] 表1黃芩素試管凝膠法抗內(nèi)毒素結(jié)果
[0030] 注：（-)緩慢倒轉(zhuǎn)即流動；（+ )緩慢倒轉(zhuǎn)180°管內(nèi)仍呈堅實凝膠不流動；（±) 介于二者之間。
[0031] 實施例2 :黃芩素對內(nèi)毒素的降解率的影響
[0032] 2· 1實驗方法
[0033] 精密稱取黃芩苷對照品5mg，置于IOOmL容量瓶中，加內(nèi)毒素檢查用水（提前預(yù)熱 到30°C )和Tris-緩沖液溶解并定容至100mL，制成濃度為50 μ g/mL的供試品原液，渦旋 5min左右，使其充分溶解混勻。然后依次稀釋成濃度為25、12. 5、6. 25、3. 125yg/mL的供試 品洛液，每稀釋一次禍旋30s。
[0034] 取8支無熱原試管依次分別加入0. 05ml不同濃度的供試品，分成實驗組和對照 組，每組4管。實驗組每管分別加入0.05ml 0.5EU/ml內(nèi)毒素標準溶液，對照組每管分別加 入等量的BET水，混勻，37°C孵育60min。溫育結(jié)束后，分別加入0.1 ml鱟試劑溶液，混勻， 37°C孵育lOmin。溫育結(jié)束后，分別加入0.1 ml顯色基質(zhì)溶液，混勻，37°C孵育6min。溫育結(jié) 束后，分別加入0. 5ml偶氮化試劑1，混勻；再分別加入0. 5ml偶氮化試劑2,混勻；再分別加 入0. 5ml偶氮化試劑3,混勾，靜置5min，吸取混合液至無熱源96孔板內(nèi)，于545nm波長處讀 取吸光度值。每個樣品重復(fù)4孔，求取△ OD值（△ OD = OD實驗組一 OD對照組），根據(jù)標準 曲線，計算內(nèi)毒素含量。然后利用公式：內(nèi)毒素降解率=(0.5-內(nèi)毒素含量）/0. 5X100%， 計算各含藥血清的內(nèi)毒素降解率。
[0035] 2. 2鱟試劑顯色基質(zhì)法試驗
[0036] 實驗結(jié)果顯示，濃度為12.5 μ g/ml黃芩素的內(nèi)毒素降解率最高為70. 61%。（見 表2)。
[0037] 表2不同濃度黃芩素體外抗內(nèi)毒素的結(jié)果
【主權(quán)項】
1. 黃芩素在制備具有抗內(nèi)毒素活性的藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于：所述的藥物為體外能夠起到滅活內(nèi)毒素的 作用的藥物。3. 如權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于：所述的藥物為能夠起到降解內(nèi)毒素的作用 的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了黃芩素在制備具有抗內(nèi)毒素活性的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明開辟了黃芩素的新用途，為抗內(nèi)毒素的治療提供了新的藥物。
【IPC分類】A61K31/352, A61P31/04
【公開號】CN105326827
【申請?zhí)枴緾N201510788799
【發(fā)明人】穆祥, 段慧琴, 張濤, 董虹, 胡格, 張倩
【申請人】北京農(nóng)學(xué)院
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月17日