專利名稱：：用于α病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的無啟動子盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于制備重組α病毒顆粒的改良構(gòu)建體和制備重組α病毒顆粒的方法。
背景技術(shù)：
：α病毒目前用作研發(fā)傳染病和癌癥疫苗的載體平臺(例如，參見U.S.專利No.5，792，462；6，156，558；5，811，407；6，531，135；6，541，010；6，783，939；6，844，188；6，982，087；7，045，335；5，789，245；6，015，694；5，739，026；Pushko等，Virology239(2)389-401(1997),Frolov等，J.Virol.71(1):248_258(1997)；Smerdou和Liljestrom,J.Virol.73(2)1092-1098(1999))。α病毒包括披膜病毒科中的屬，并且發(fā)現(xiàn)屬中的成員遍布全世界，在脊椎動物和無脊椎動物宿主中都有。其中，得到最多研究的用于載體平臺的α病毒是委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒、西門利克森林病毒(SFV)和辛德畢斯病毒(SV)，該屬的原型成員。一個這樣的載體平臺是α病毒復(fù)制子系統(tǒng)，描述于GarofT等的U.S.專利No.6，190，666，Johnston等的U.S.專利No.5，792，462和6，156，558中，Dubensky等的U.S.專利No.5，814，482,5,843，723,5,789，245,6,015，694,6,105，686和6，376，236；U.S.公開申請No.2002-0015945(Polo等)，U.S.公開申請No.2001-0016199(Johnson等)，F(xiàn)rolov等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11371_11377和Pushko等(1997)Virology239:389-401中。將α病毒復(fù)制子載體工程化，以含有并表達(dá)一個或更多個目標(biāo)核酸，其中目標(biāo)核酸可以編碼，例如，抗原、細(xì)胞因子、核酶或酶。α病毒復(fù)制子可以源自任何α病毒，其中如委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒，辛德畢斯病毒，例如了1339株，南非蟲媒病毒似.86和西門利克森林病毒。然后將載體引入培養(yǎng)物中的細(xì)胞中，使α病毒復(fù)制，并且其中還表達(dá)了α病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，使得通過α病毒結(jié)構(gòu)蛋白將載體包裝成α病毒復(fù)制子顆粒(ARP)。然后從培養(yǎng)物中收集ARP，并傳送至對象，用于各種治療目的。已經(jīng)研發(fā)了各種構(gòu)建體來提高ARP系統(tǒng)在疫苗應(yīng)用中的免疫原性和有效性。還將這些構(gòu)建體中的許多進(jìn)行了設(shè)計(jì)，以降低通過基因組片段的重組形成可復(fù)制(replication-competent)α病毒的可能性。Johnson等(U.S.專利No.5，792，462和6，156，558)認(rèn)識到從單個輔助系統(tǒng)(其中一套完整的α病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因在一個RNA分子上，而非結(jié)構(gòu)蛋白基因和異源目標(biāo)核酸在分開的復(fù)制子RNA上)重組的可能，并因此設(shè)計(jì)了利用兩個輔助RNA來編碼結(jié)構(gòu)蛋白的“雙-輔助”系統(tǒng)。Dubensky等(U.S.專利No.5，789，245)和Polo等(U.S.專利No.6，242，259)描述了使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化至包裝細(xì)胞系中的兩個DNAa病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)盒，以通過將復(fù)制中的α病毒載體引入包裝細(xì)胞的培養(yǎng)物中時產(chǎn)生表達(dá)那些結(jié)構(gòu)蛋白的RNA來包裝α病毒載體。Lijiestrom和同事已經(jīng)提出了證實(shí)“單個輔助系統(tǒng)”將產(chǎn)生野生型α病毒顆粒的數(shù)據(jù)(Berglimd等，Biotechnology11(8):916_920(1993))。Smith等已經(jīng)描述了其他指導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的新輔助RNA(W02004/085660)。通過將病毒編碼序列分布在三個核酸中，其中兩個包括輔助系統(tǒng)，如上所述，形成可復(fù)制病毒(“RCV”)的重組的理論頻率相對于單個輔助系統(tǒng)明顯下降。這些系統(tǒng)包括使用α病毒亞基因組啟動子，通常稱為26S啟動子或病毒連接區(qū)啟動子，以提供用作獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位的構(gòu)建體，和使用α病毒RNA聚合酶識別信號，使得輔助系統(tǒng)可以利用α病毒復(fù)制機(jī)制的存在，用于輔助功能的擴(kuò)增和有效表達(dá)。在現(xiàn)有的系統(tǒng)中，已知包裝信號通常包括在復(fù)制子RNA中并排斥在輔助構(gòu)建體之夕卜。然而，盡管如此，輔助RNA以較低的頻率得到包裝或共同包裝(Lu和Silver，J.VirolMethods,91(1):59-65(2001))，并且具有末端識別信號的輔助構(gòu)建體將在復(fù)制子存在下得到擴(kuò)增和表達(dá)，潛在地與其他輔助分子或復(fù)制子RNA產(chǎn)生重組事件。使用α病毒復(fù)制子顆粒的動物研究已經(jīng)使用了IO5至IO8的劑量，并且107、5Χ107和IO8已經(jīng)有效地用于非人靈長類動物中，這也是用于人類臨床試驗(yàn)中的劑量。此外，較高劑量，如2X108、5XIO8和109，在用于人類的應(yīng)用中也是有用。這樣的劑量需要大規(guī)模的制造程序，并且在這樣的規(guī)模下，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上可能的是使用現(xiàn)有的RNA輔助系統(tǒng)可能產(chǎn)生可復(fù)制α病毒。因此，本領(lǐng)域中仍然存在需要來提供用于制造α病毒復(fù)制子顆粒的改良系統(tǒng)，以進(jìn)一步降低形成可復(fù)制α病毒的預(yù)測頻率，以及優(yōu)化制造策略和成本。本發(fā)明提供了缺乏啟動子序列的編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的α病毒RNA輔助分子，由此顯著降低在輔助分子和復(fù)制子載體之間可能發(fā)生的功能性重組事件的理論數(shù)量，導(dǎo)致重組α病毒顆粒生產(chǎn)過程中可復(fù)制α病毒形成率的理論預(yù)測下降。發(fā)明概述本發(fā)明提供分離的RNA分子，其包含a)α病毒5’復(fù)制識別序列，其中已經(jīng)從所述5’復(fù)制識別序列中除去起始密碼子；b)編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列；和C)α病毒3’復(fù)制識別序列，條件是RNA分子不含有指導(dǎo)(b)的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子，并且其中α病毒5’和3’復(fù)制識別序列在α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的存在下指導(dǎo)整個RNA分子的復(fù)制。在此另外提供的是制備α病毒復(fù)制子顆粒的方法，其包括在由此生產(chǎn)α病毒復(fù)制子顆粒的條件下，將一個或更多個本發(fā)明的RNA分子引入細(xì)胞中，由此RNA分子的組合連同α病毒復(fù)制子RNA—起編碼生產(chǎn)α病毒復(fù)制子顆粒需要的所有α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。此外，提供了制備α病毒復(fù)制子顆粒的方法，其包括在由此生產(chǎn)α病毒復(fù)制子顆粒的條件下，將下列引入細(xì)胞中a)α病毒復(fù)制子RNA;b)—個或更多個本發(fā)明的RNA分子；和c)一個或更多個啟動子輔助α病毒輔助構(gòu)建體，由此(b)的RNA分子的組合和(c)的輔助構(gòu)建體編碼生產(chǎn)α病毒復(fù)制子顆粒需要的所有α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了α病毒復(fù)制子顆粒群，其中該群不含有可檢測的可復(fù)制病毒顆粒，如通過在培養(yǎng)物中的允許(permissive)細(xì)胞上傳代所測定的。在此還提供了α病毒復(fù)制子顆粒群，其中該群不含有可檢測的可復(fù)制病毒顆粒，如通過在培養(yǎng)物中的允許細(xì)胞上傳代所測定的，其中α病毒復(fù)制子顆粒在α病毒結(jié)構(gòu)蛋白或α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白或α病毒結(jié)構(gòu)蛋白和α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白兩者中含有一個或更多個減毒突變。此外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)對象中免疫應(yīng)答的方法，其包括將有效量的本發(fā)明的α病毒復(fù)制子顆粒群給予對象。附圖簡述圖1顯示了全長(FL)無啟動子輔助分子的5’復(fù)制識別序列(RRS)的結(jié)構(gòu)。用輪廓線和黑線表示5’復(fù)制識別序列內(nèi)的衣殼或糖蛋白(GP)起始密碼子的起始密碼子上游的位置。輪廓線表示與衣殼或GP的編碼序列符合閱讀框的起始密碼子。黑線表示與衣殼或GP的編碼序列不符合閱讀框的起始密碼子。垂直線下的數(shù)字表示用于5’復(fù)制識別序列中推定起始密碼子的第一個核苷酸位置，編號從分子的5’端開始。圖2顯示了無啟動子輔助分子中5’復(fù)制識別序列刪除的結(jié)構(gòu)?？虺龅目虮硎久總€構(gòu)建體內(nèi)保留的5’復(fù)制識別序列，而框內(nèi)的數(shù)字是序列以核苷酸的長度。細(xì)黑線表示已經(jīng)從每個構(gòu)建體刪除的5’復(fù)制識別序列。帶有斜線的框表示衣殼或GP的編碼序列的位置。圖3是Northern印跡分析。從Vero細(xì)胞提取總細(xì)胞RNA，這些細(xì)胞已經(jīng)用30μgpERK/342/MS/BoNTA復(fù)制子RNA和30μgdHEl_6Ml(無啟動子El輔助子)或30μg含有26S的GP輔助RNA(13.4.6)電穿孔。將每個樣品的RNA(5μg)在1%乙二醛凝膠上跑膠并轉(zhuǎn)移至BrightStar膜(Ambion;Austin，TX)。使用基因組正義α病毒RNA3’端特異性的探針來檢測輔助子的復(fù)制。泳道1:RNA分子量標(biāo)記，泳道2:dHEl-6Ml輔助子+BoNTA復(fù)制子，泳道3啟動子輔助GP輔助子+BoNTA復(fù)制子。圖4是顯示了泛素單體的C-端氨基酸和核苷酸序列以及用于泛素化(dHcapU和dHgpU)或標(biāo)準(zhǔn)(dHcap和dHgp)構(gòu)建體的α病毒衣殼和糖蛋白編碼序列的N-端殘基的圖。這些序列右端的"MetPhe","ProMetPheProThrMetSer，，禾口‘‘ThrMetSer，，表示在衣殼和GP蛋白的N-端發(fā)現(xiàn)的氨基酸。泛素化構(gòu)建體具有在13.2.2和13.4.6輔助子中未發(fā)現(xiàn)的其他N-端殘基。最右側(cè)的框表示3’RsrII位點(diǎn)和作為初級核苷酸序列編碼結(jié)果的氨基酸。最左側(cè)的框表示對于從VEE結(jié)構(gòu)蛋白切割泛素關(guān)鍵的殘基。圖5顯示了在包裝研究中從電穿孔產(chǎn)生VRP的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞裂解物的Western印跡分析(一個使用衣殼特異性抗體，另一個使用糖蛋白(GP)特異性抗體)(表10)。除了復(fù)制子，將兩個RNA輔助子電穿孔至細(xì)胞中，如下泳道1，dHcap6-mutl和13.4.6(GP)；泳道2，Hcap4和dHgp6-mutl；泳道3，dHcapU和dHgpU；泳道4，dHcap(FL)和dHgp(FL)；泳道5，Hcap4和dHgpU；泳道6，Hcap4和dHgp(FL)；泳道7，dHcapU和13.4.6；泳道8，dHcap(FL)和13.4.6；泳道9，Hcap4和13.4.6；泳道10，分子量標(biāo)記。圖6顯示了在Vero細(xì)胞中產(chǎn)生的衣殼輔助RNA的Northern印跡分析，該Vero細(xì)胞中除了復(fù)制子外，已經(jīng)將兩個RNA輔助子電穿孔至該細(xì)胞中，如下泳道1，dHcap6-mutl禾口13.4.6(GP)；泳道2，Hcap4和dHgp6_mutl；泳道3，dHcapU和dHgpU；泳道4，dHcap(FL)和dHgp(FL)；泳道5，Hcap4和dHgpU；泳道6，Hcap4和dHgp(FL)；泳道7，dHcapU和13.4.6；泳道8，dHcap(FL)和13.4.6。用星號標(biāo)注每個泳道中可翻譯的衣殼RNA分子。圖7顯示了在Vero細(xì)胞中產(chǎn)生的糖蛋白(GP)輔助RNA的Northern印跡分析，該Vero細(xì)胞中除了復(fù)制子外，已經(jīng)兩個RNA輔助子電穿孔至該細(xì)胞中，如下泳道1，dHcap6-mutl禾口13.4.6(GP)；泳道2，Hcap4和dHgp6_mutl；泳道3，dHcapU禾口dHgpU；泳道4，dHcap(FL)和dHgp(FL)；泳道5，Hcap4和dHgpU；泳道6，Hcap4和dHgp(FL)；泳道7，dHcapU和13.4.6；泳道8，dHcap(FL)和13.4.6。用星號標(biāo)注每個泳道中可翻譯的糖蛋白RNA分子。發(fā)明詳述如在此所用的，“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”可以表示一種或更多種，這取決于其中使用它的內(nèi)容。例如，“一(a)”種細(xì)胞可以表示一種細(xì)胞或更多種細(xì)胞。此外，如在此所用的，“和/或”指的是并包括一種或更多種相關(guān)所示項(xiàng)目的任何和所有可能的組合，以及以可替換的方式(“或”)解釋時，組合的缺乏。此外，術(shù)語“約”，如在此所用的，涉及可測量值時，如本發(fā)明的化合物或試劑的含量、劑量、時間、溫度等，表示包括特定含量士20%、士10%、士5%、士1%、士0.5%或甚至士0.的變動。術(shù)語“5’α病毒復(fù)制識別序列”、“3’α病毒復(fù)制識別序列”、“5’復(fù)制識別序列”和“3’復(fù)制識別序列”指的是在α病毒中發(fā)現(xiàn)的RNA序列、從其衍生的序列或基于各種α病毒中保守序列的合成序列，這些序列通過非結(jié)構(gòu)α病毒復(fù)制酶蛋白識別并導(dǎo)致病毒RNA的復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，這些序列是DNA的形式，以促進(jìn)本發(fā)明的構(gòu)建體、質(zhì)粒和核酸的制備、突變和/或操縱，來產(chǎn)生VRP。這些序列也稱為“5’和3’端”，非結(jié)構(gòu)蛋白_介導(dǎo)的擴(kuò)增需要的5’和3’病毒序列，非結(jié)構(gòu)蛋白-介導(dǎo)的擴(kuò)增需要的5’和3’序列，5’或3’保守序列元件(CSE)，5’或3’非編碼區(qū)，5’或3’非編碼區(qū)序列，復(fù)制需要的順式5’或3’病毒序列，啟動α病毒轉(zhuǎn)錄的5’或3’序列和/或α病毒5’和3’序列，5’和3’名稱指的是它們在α病毒基因組中位置。在本發(fā)明的核酸分子中，這些5’和3’端的使用將導(dǎo)致這兩端之間編碼的RNA序列的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)來修飾這些序列(例如，在任一端截短和/或修飾來除去啟動(即，起始)密碼子或增強(qiáng)可翻譯性)，用以進(jìn)一步最小化重組的可能和/或用于引入克隆位點(diǎn)等，附加條件是它們必須仍然能通過α病毒復(fù)制機(jī)制來識別。如在此所用的，術(shù)語“啟動密碼子”或“起始密碼子”指的是RNA中的AUG和DNA中的ATG，其可以或不可以用于功能蛋白的翻譯中。術(shù)語“一個/幾個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白”指的是由α病毒編碼的一種結(jié)構(gòu)蛋白或組合。這些通過野生型病毒作為多聚蛋白來產(chǎn)生并且通常在文獻(xiàn)中描述為C-E3-E2-6k-El。E3和6k作為兩種糖蛋白E2和El的跨膜/轉(zhuǎn)運(yùn)信號。因此，在此術(shù)語El的使用可以指El、E3-El、6k-El或E3_6k_El，而在此術(shù)語E2的使用可以指E2、E3_E2、6k_E2、PE2、p62或E3-6k-E2。術(shù)語“糖蛋白輔助子”或“GP輔助子”在此通常指編碼E2和El糖蛋白的輔助分子；在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，在分開的輔助分子上編碼El和E2。術(shù)語“輔助子”和“輔助分子”可以互換使用并且指的是表達(dá)編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸的核酸分子。術(shù)語“輔助細(xì)胞”和“包裝細(xì)胞”在此可以互換使用并且指的是在其中產(chǎn)生α病毒復(fù)制子顆粒的細(xì)胞。輔助細(xì)胞包含一組如在此所述的編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的輔助分子和/或輔助構(gòu)建體。輔助子可以是RNA或DNA或兩者。輔助細(xì)胞或包裝細(xì)胞可以是α病毒-允許的任何細(xì)胞，即，在引入復(fù)制子RNA時可以產(chǎn)生α病毒顆粒。α病毒-允許的細(xì)胞包括，但不限于，Vero、幼倉鼠腎(BHK)、293、293T/17(ATCC登錄號CRL-11268)、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、UMNSAH/DF-1(ATCC登錄號CRL-12203)和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。如在此所用的“啟動子”是指導(dǎo)RNA分子轉(zhuǎn)錄的核酸序列。如在此所用的“分離的細(xì)胞”是已經(jīng)從細(xì)胞自然產(chǎn)生的環(huán)境中取出的細(xì)胞或細(xì)胞群和/或從細(xì)胞在其自然環(huán)境中的狀態(tài)改變或修飾的細(xì)胞或細(xì)胞群。本發(fā)明的分離細(xì)胞可以是例如在細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞。本發(fā)明的分離細(xì)胞還可以是在動物體內(nèi)的細(xì)胞和/或引入動物中的細(xì)胞，并且其中細(xì)胞已經(jīng)例如通過將本發(fā)明的α病毒顆粒引入細(xì)胞中而得到了改變或修飾。如在此所用的，“α病毒亞基因組啟動子”或“26S啟動子”是最初在野生型α病毒基因組中限定的啟動子，其指導(dǎo)亞基因組信使RNA的轉(zhuǎn)錄，作為α病毒復(fù)制過程的一部分。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中所用的異源核酸(例如，目標(biāo)基因或“G0I”或目標(biāo)核酸或“Ν0Ι”)是不存在于野生型α病毒基因組中的核酸和/或是不以與其存在于本發(fā)明重組核酸中的相同次序存在于野生型α病毒基因組中的核酸。例如，在特定的實(shí)施方案中，將NOI用作感染性、缺陷型α病毒顆粒(例如，α病毒復(fù)制子顆粒)裝配中的輔助核酸或作為用于對抗由特定α病毒引起的疾病的疫苗的免疫原時，NOI編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如，C、PE2/E2、E1、E3、6K)。本發(fā)明是基于令人驚訝和出乎意料的發(fā)現(xiàn)含有編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列以及α病毒5’和3’序列但缺乏啟動子序列(例如，亞基因組α病毒啟動子序列，有時稱為26S或病毒連接區(qū)啟動子)的RNA分子可以復(fù)制，其中已經(jīng)從5’復(fù)制識別序列中去除啟動密碼子，使得全長正鏈RNA可以得到有效地翻譯并產(chǎn)生足量的反式α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，用于在培養(yǎng)的細(xì)胞系中生產(chǎn)α病毒復(fù)制子顆粒。這些“無啟動子”RNA分子，在此有時稱為“Δ26S輔助子”，通過降低輔助分子和復(fù)制子載體之間發(fā)生的功能性重組事件產(chǎn)生的預(yù)測理論頻率提高了α病毒復(fù)制子顆粒群(例如，為用作疫苗或佐劑生產(chǎn)的)的理論安全限度。任何切割輔助系統(tǒng)需要最少兩個獨(dú)立的重組事件來產(chǎn)生可復(fù)制α病毒(RCV)。對于α病毒，認(rèn)為重組主要是通過RNA復(fù)制復(fù)合物的隨機(jī)鏈轉(zhuǎn)換的結(jié)果(Weiss等，1991)，盡管已經(jīng)報(bào)道了同源重組。對于第一個重組事件，例如，復(fù)制復(fù)合物將在文獻(xiàn)中公開的切割輔助子/復(fù)制包裝系統(tǒng)中的RNA輔助分子的3’端開始(例如，Johnson等，U.S.專利No.5，792，462)。如果復(fù)合物通過26S或病毒連接區(qū)持續(xù)該輔助RNA的復(fù)制，然后作為模板在復(fù)制子RNA中轉(zhuǎn)換成外源核苷酸序列，并通過復(fù)制子5’端完成復(fù)制，所得到的“重組復(fù)制子中間產(chǎn)物”將含有編碼所有非結(jié)構(gòu)蛋白的序列，一些或所有含有外源目標(biāo)核酸(NOI)編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄單位和表達(dá)一種α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的新插入的轉(zhuǎn)錄單位。為了形成RCV，必須通過鏈轉(zhuǎn)換事件轉(zhuǎn)換成重組復(fù)制子中間產(chǎn)物(如上所述)的3’復(fù)制識別序列來產(chǎn)生隨后的第二個重組事件，因?yàn)檫@是導(dǎo)致用于全部沒有插入突變的非結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列的功能性轉(zhuǎn)錄單位停留的唯一位置。因?yàn)檩o助RNA分子含有26S啟動子，理論上，兩個這樣的重組事件可以形成RCV。精確的重組點(diǎn)不是關(guān)鍵的，因?yàn)槊總€重組插入片段將是獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位。使用本發(fā)明的無啟動子輔助分子產(chǎn)生RCV也還需要最少兩個獨(dú)立的重組事件，但用于獲得功能性重組的約束條件要比文獻(xiàn)中已知的RNA輔助分子的高得多，并因此產(chǎn)生RCV的理論頻率低得多。這是因?yàn)?，?6S啟動子不存在的情況下，大部分重組事件沒有導(dǎo)致能表達(dá)α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的功能性轉(zhuǎn)錄單位的形成。因此，使用無啟動子輔助分子產(chǎn)生RCV需要產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多聚蛋白開放閱讀框(即，實(shí)質(zhì)上與產(chǎn)生這些輔助子的野生型病毒中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)相似)，并且這依此需要兩個所需的重組事件以特定的次序并在非常特定的核苷酸位置發(fā)生。最初的重組事件必須涉及衣殼輔助編碼序列，因?yàn)槠浔仨毾鄬τ谔堑鞍孜挥谡_的位置(即，5’)，以切割其自身并產(chǎn)生功能性衣殼蛋白。衣殼輔助子必須通過核苷酸-或近-核苷酸_正確重組事件與復(fù)制子載體重組，以實(shí)現(xiàn)其中衣殼蛋白從復(fù)制子26S啟動子表達(dá)的重組。即，只有以下情況的重組是功能性的1)直接在復(fù)制子26S啟動子的下游，2)與異源GOI的任何剩余部分符合閱讀框，和3)i導(dǎo)致GOI/α病毒衣殼融合蛋白的產(chǎn)生(因此產(chǎn)生失活的α病毒衣殼)。第二種重組事件，涉及α病毒糖蛋白輔助子，除了限于在3’復(fù)制識別序列中發(fā)生，處于和第一種情況相同的約束條件下。因此，本發(fā)明使用無啟動子輔助分子生產(chǎn)顆粒的方法在理論上將以比文獻(xiàn)中已知輔助分子低得多的頻率產(chǎn)生RCV，該頻率足夠低，以致用本發(fā)明的方法沒有檢測到這樣的RCV。本發(fā)明的這種令人驚訝的性質(zhì)在于以下的事實(shí)之前用于產(chǎn)生裝配α病毒顆粒的輔助子/復(fù)制子系統(tǒng)的努力依賴于使用強(qiáng)啟動子，最常見的是α病毒26S亞基因組啟動子，以提供足夠的RNA分子，從其翻譯用于裝配的結(jié)構(gòu)蛋白。與現(xiàn)有文獻(xiàn)截然相反，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了他們可以利用直接翻譯成全長分子的RNA輔助分子，而沒有文獻(xiàn)中已知的在野生型α病毒繁殖和輔助RNA系統(tǒng)中從26S啟動子轉(zhuǎn)錄較小的信使RNA和通常伴隨該過程的信使擴(kuò)增。然后通過由細(xì)胞核糖體機(jī)制識別全長RNA5’端的帽來完成本發(fā)明的輔助RNA的直接翻譯。在真核細(xì)胞內(nèi)，從mRNA啟動翻譯涉及一系列密切相關(guān)的事件，這些事件使核糖體亞基募集至mRNA。在帽依賴性翻譯的情況中，存在于mRNA5’端的甲基_7_G(5’)pppN結(jié)構(gòu)，稱為“帽”，由細(xì)胞啟動因子eIF4F來識別，eIF4F由eIF4E、eIF4G和eIF4A組成。(綜述參見Hershey&Merick.基因表達(dá)的番羽譯控制(TranslationalControlofGeneExpression),pp.33-88,ColdSpringHarbor,NY:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,2000)。α病毒是正鏈RNA病毒；當(dāng)病毒RNA進(jìn)入細(xì)胞時，從該RNA產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)α病毒蛋白(nsPl、nsP2、nsP3和nsP4)的翻譯，并且這些蛋白各自產(chǎn)生全長負(fù)鏈RNA模板。然后將負(fù)鏈RNA復(fù)制，以產(chǎn)生全長(“基因組”)正鏈RNA和在26S啟動子啟動的較小(“亞基因組”)正鏈。產(chǎn)生正鏈時，α病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白還給RNA加帽，使其在細(xì)胞質(zhì)是可用的，用于通過核糖體來翻譯?！懊薄敝傅氖翘砑又罵NA5’端的甲基化殘基。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，在體外產(chǎn)生的輔助RNA分子(其是正鏈RNA)沒有加帽。將正鏈輔助RNA引入還含有復(fù)制子RNA的真核細(xì)胞中時，最初主要發(fā)生了負(fù)鏈合成。在α病毒復(fù)制子RNA的存在下，從其合成非結(jié)構(gòu)蛋白，將負(fù)鏈模板(輔助子和復(fù)制子兩者)復(fù)制成然后加帽的正鏈RNA。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域公知的和可購得的試劑，例如，來自Promege(Madison，WI)和Ambion(Austin，TX)，將輔助RNA在體外加帽。帽包括，例如，G帽、C帽、A帽、甲基化G(m7G(5，ppp(5‘)pppG(5)A))；未甲基化的G(G(5’ppp(5，)A))；ARCA(反義帽類似物，3-0-Me-m7G(5，)pppG(5))；三甲基化(m2’2’7G(5，ppp(5，)pppG))，2_way巾冒(m7G(5，ppp(5，)m7G))。在一些實(shí)施方案中，為了ARP的最大產(chǎn)量，用于生產(chǎn)ARP的本發(fā)明的所有輔助子是加帽或未加帽的。使用加帽的輔助RNA記錄了最高產(chǎn)量，但在特定的實(shí)施方案中，未加帽的輔助RNA可以產(chǎn)生足夠高的產(chǎn)量，使得可以避免加帽的成本。還可以的是僅將一個輔助RNA加帽，盡管這有時候也限制了ARP產(chǎn)量。概括而言，發(fā)明人已經(jīng)顯示了可以通過著眼于幾個變量的常規(guī)試驗(yàn)來優(yōu)化ARP產(chǎn)量，如改變加帽的使用，轉(zhuǎn)錄混合物中帽類似物與NTP的比例和用于產(chǎn)生ARP的RNA比例。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的RNA分子，其包括下列、基本上由下列組成和/或由下列組成a)α病毒5’復(fù)制識別序列，其中已經(jīng)除去至少一個啟動密碼子；b)編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列；和c)α病毒3’復(fù)制識別序列，條件是RNA分子不含有指導(dǎo)(b)的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子，并且其中α病毒5’和3’復(fù)制識別序列在α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的存在下指導(dǎo)完整RNA分子的復(fù)制。各種核酸序列可以滿足本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中的5’和3’端功能。例如，序列可以包括α病毒5’復(fù)制識別序列和其他相鄰序列，如以上例舉的，用于VEEa病毒。此外，可以在天然5’α病毒中進(jìn)行刪除，以除去特定的二級結(jié)構(gòu)元件，例如，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。在特定的實(shí)施方案中，可以從本發(fā)明的輔助構(gòu)建體中除去這些莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中的一個或更多個。或者，可以將非α病毒或其他序列用作該元件，同時保持相似的功能性能力，例如，在辛德畢斯病毒的情況中，用于tRNA天冬酰胺的核苷酸10-75(Schlesinger等，US專利No.5，091，309)。在一些實(shí)施方案中，3’α病毒復(fù)制識別序列的長度大約為300個核苷酸，其基本上含有天然α病毒3’復(fù)制識別序列。在α病毒中保守的最小3’復(fù)制識別序列是19個核苷酸的序列(Hill等，JournalofVirology，2693-2704(1997))。此外，對于辛德畢斯病毒，已經(jīng)顯示出就在3’復(fù)制識別序列之后的poly(A)尾必須至少是11-12個殘基長，并且3’復(fù)制識別序列的3’13nt對于有效的負(fù)鏈RNA合成是關(guān)鍵的(Hardy和Rice，JournalofVirology,79=4630-4639(2005))0因此，用于3’端的序列可以包括完整的α病毒3’復(fù)制識別序列，或3’復(fù)制識別序列截短的片段，其仍然保持作為識別序列的功能，或長度是25至325個核苷酸的3’端并就在3’復(fù)制識別序列之后含有poly(A)尾，最小長度為ll_12nt?？梢杂糜谠搩?nèi)容中的其他序列實(shí)例包括，但不限于，維持相似的允許負(fù)鏈RNA合成啟動的功能性能力的非α病毒或其他序列(例如，George等，J.Virol.74:9776_9785(2000)中所述的序列)。本發(fā)明RNA分子中所用的5’和3’復(fù)制識別序列可以源自相同的或不同的任意組合的α病毒，并且它們可以與源自相同或不同α病毒的復(fù)制子載體以任意組合來使用。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，選擇輔助RNA分子的5’和3’序列來最大化輔助子在生產(chǎn)VRP中的性能和最小化產(chǎn)生RCV的理論潛力。特定的實(shí)施方案可以包括5’和3’序列的修飾以及從α病毒刪除原始5’或3’序列的一部分，在此描述了其實(shí)例。存在本發(fā)明中所述5’和3’序列的多種組合，并且不同的組合可以用于各個輔助分子。測試在此教導(dǎo)的各種修飾和刪除的組合來測定它們在VRP生產(chǎn)中的性能是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)的。本發(fā)明的RNA輔助分子依賴于核糖體從5’帽結(jié)構(gòu)掃描通過5’復(fù)制識別序列，以在它們的天然蛋氨酸起始密碼子處啟動α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯。這些區(qū)域中其他啟動密碼子的存在通過允許翻譯以在用于結(jié)構(gòu)蛋白的天然起始密碼子之外的位點(diǎn)啟動而降低了這些輔助子的有效性，因此隨著核糖體沿著mRNA移動至α病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)中產(chǎn)生了融合蛋白，或在核糖體隨后到達(dá)5’復(fù)制識別序列中的終止密碼子時產(chǎn)生了短的非功能性肽。因此，由于該區(qū)域中各種起始和終止密碼子的存在，在這些輔助子中完整5’α病毒非編碼區(qū)(即，從野生型α病毒的5’端直至26S亞基因組啟動子的第一個密碼子的完整序列)的使用不是關(guān)鍵的。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA分子可以從5’復(fù)制識別序列除去一個或更多個啟動密碼子。一個或更多個的意思是根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法除去或滅活的兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、11、12或更多個啟動密碼子(即，起始密碼子)。因此，本發(fā)明提供了本發(fā)明的RNA分子，其中已經(jīng)從5’復(fù)制識別序列除去了一個或更多個啟動密碼子，例如，通過從AUG突變成GUG。在特定的實(shí)施方案中，提供了RNA分子，其中已經(jīng)從5’復(fù)制識別序列除去了所有的啟動密碼子，例如，通過從AUG突變成GUG。例如，在圖1所示的以下位置可以除去任何任意組合的一個或更多個啟動密碼子，例如，突變的:12、45、148、154、160、258、294、299、331、390、411、441和499。除去啟動密碼子的意思是將核苷酸序列進(jìn)行修飾(例如，根據(jù)在此所述的和本領(lǐng)域已知的方法)以刪除或改變啟動密碼子，由此除去或改變該位點(diǎn)的啟動或活性(例如，翻譯活性)。在一些實(shí)施方案中，可以除去大部分的啟動密碼子，但可能在特定輔助構(gòu)建體的5’區(qū)中只有少數(shù)這樣的密碼子在該情況下通常是由核糖體識別的。因此，對于特定的5’序列，在可能的10-12個密碼子中除去2-3個這樣的密碼子，可能導(dǎo)致表達(dá)水平與其中所有10-12個密碼子都除去的構(gòu)建體沒有明顯差異。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，存在各種特定的5’序列，源自野生型α病毒序列，用于本發(fā)明的輔助分子中時，將導(dǎo)致包裝或輔助細(xì)胞內(nèi)的充分表達(dá)，以提供可接受的α病毒復(fù)制子顆粒產(chǎn)量。本發(fā)明的RNA分子可以包含編碼下列的核苷酸序列1)α病毒衣殼蛋白，2)以任意次序的α病毒El和Ε2蛋白，3)以任意次序的α病毒衣殼蛋白和α病毒El蛋白，4)以任意次序的α病毒衣殼蛋白和α病毒Ε2蛋白，5)α病毒Ε2蛋白和/或6)α病毒E1蛋白。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的單個RNA分子可以編碼三個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，即，衣殼蛋白、α病毒El蛋白和α病毒Ε2蛋白，以任意次序。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA分子可以特意排除編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列(例如，可以特意排除編碼衣殼、α病毒El蛋白、α病毒Ε2蛋白或衣殼、El蛋白和Ε2蛋白任意組合的核苷酸序列的分子)。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，RNA分子可以含有來自委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒5’端的序列，其包括5’復(fù)制識別序列。如Pushko等(1997)中所述的，VEE啟動子輔助的輔助子的5’復(fù)制識別序列通常由VEE序列的575個核苷酸(nt)組成。頭519個是連續(xù)的并表示未翻譯區(qū)(UTR)的44個nt和nsPl的頭475個nt(44+475=519)。剩余的56個nt編碼nsP4基因的最后21個nt(包括TAA終止密碼子)，最小26S啟動子的7個nt(該序列部分與nsP4基因重疊)和VEE結(jié)構(gòu)蛋白基因啟動密碼子的28個nt前導(dǎo)序列上游(21+7+28=56)。因此，由Pushko等(1997)描述的用于啟動子輔助的輔助子的完整5’復(fù)制識別序列由VEE序列的575個nt組成。本發(fā)明的無啟動子輔助子編碼上述啟動子輔助的輔助子中發(fā)現(xiàn)的頭514個核苷酸(nt)的全部或一部分。除了上述的514個nt，就在結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列起始位點(diǎn)(DNA中的ATG;RNA中的AUG)的上游還存在編碼RsrII限制酶位點(diǎn)的序列(7個nt)。包含這些nt將用于全長衣殼輔助子的5’復(fù)制識別序列(dHcap(FL))增加至521個nt(不包括啟動密碼子的A殘基)。在無啟動子衣殼輔助子的一些實(shí)例和無啟動子糖蛋白輔助子的所有實(shí)例中，增加了其他修飾，以就在結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列啟動密碼子的上游但在RsrII序列的下游包括近-共有Kozak序列(3個nt(ACC))。由于Kozak修飾，全長糖蛋白輔助子(dHgp(FL))具有524個nt的5’復(fù)制識別序列。為了以下描述的目的，將用于無啟動子衣殼和糖蛋白輔助子的這些核苷酸序列限定為“全長”(“FL”)5’VEE序列，該序列中的刪除形成包括5’復(fù)制識別序列的其他實(shí)施方案。這些實(shí)施方案最小包括VEE核苷酸序列的核苷酸1至141(不包括啟動密碼子的A殘基)。在5’序列的頭200個核苷酸內(nèi)，預(yù)測了RNA中有四個莖-環(huán)(SL)結(jié)構(gòu)?？捎糜诒景l(fā)明的輔助構(gòu)建體中的5’序列的實(shí)施方案可以包括該區(qū)域中的1個、2個、3個或全部SL序列。除去SL2區(qū)但保留SL1、SL3和SL4結(jié)構(gòu)的實(shí)施方案可用于本發(fā)明的輔助構(gòu)建體中。SL結(jié)構(gòu)1和2包含在頭145個核苷酸中；SL3和4存在于核苷酸145至200之間。因此，在一些實(shí)施方案中，5’復(fù)制識別序列包括在長度是524個核苷酸的構(gòu)建體5’非編碼區(qū)中(例如，圖2中的dHgp(FL))，而在其他實(shí)施方案中，5’復(fù)制識別序列可以包括在5’非編碼區(qū)中，任何地方長度從70(例如，含有SLl、SL3和SL4)至524個核苷酸。例如，5，復(fù)制識別序列的長度可以是141、144(dH#8)200,203(dH#7)、248、249(dH#6)、309、312(dH#5)、351、354(dH#4)、412、415(dH#3)450、452(dH#2)、499或502(dH#l)個核苷酸，包括在此沒有特意指出的70至524之間的任何數(shù)字(例如，237、379、444等)。應(yīng)當(dāng)注意到精確的核苷酸數(shù)和長度在不同的α病毒之間和給定的α病毒的不同株之間稍有不同?；谠诖怂龅娜魏桅敛《局械南鄳?yīng)結(jié)構(gòu)和/或功能和/或二級結(jié)構(gòu)，鑒定在此所述的核苷酸的相應(yīng)位置，并形成本發(fā)明的RNA輔助分子以及從任何α病毒的初級核苷酸序列進(jìn)行上述修飾，是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的RNA輔助分子還包括來自α病毒3’端的序列，在特定的實(shí)施方案中，其可以是，但不限于委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒，其包括α病毒3’復(fù)制識別序列。就α病毒中的長度和序列而言，所有α病毒的3’端19個核苷酸是高度保守的，而El糖蛋白的最后一個密碼子和高度保守的19個核苷酸之間的3’序列是不太保守的。3’非編碼區(qū)的長度(包括保守的19個核苷酸，在此為SEQIDNO:52)可以為25至325個核苷酸。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，3’序列在VEE3’端的73至117個核苷酸之間。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的α病毒3’復(fù)制識別序列可以包括以下核苷酸序列，或基本上由以下核苷酸序列組成和/或由以下核苷酸序列組成SEQIDNO55(對于dHcap(FL)至dHcap7；dHcap(FL)mm至dHcap7mm，dHcap(FL)mutl至dHcap7-mutl)，SEQIDNO56(對于Hgp(FL)至dHgp7，dHgp(FL)mm至dHgp7-mm,dHgp(FL)mutl至dHgp7_mutl)，SEQIDNO57(對于dHcap6mutl(w/stop)),SEQIDNO58(對于dHcap7mutl(w/stop)+19nt禾口dHgp7mutl_S+19nt)禾口SEQIDNO59(dHcap6mutl(ff-stop))。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的α病毒5’復(fù)制識別序列可以包括以下核苷酸序列，或基本上由以下核苷酸序列組成和/或由以下核苷酸序列組成SEQIDNO1(dHcap(FL))、SEQIDNO2(dHcap1)、SEQIDNO:3(dHcap2)、SEQIDNO:4(dHcap3)、SEQIDNO:5(dHcap4)、SEQIDNO:6(dHcap5)、SEQIDNO:7(dHcap6)、SEQIDNO:8(dHcap7)、EQIDNO:9(dHcap8)、SEQIDNO:10(dHgp(FL)、SEQIDNO:11(dHgp1)、SEQIDNO:12(dHgp2)、SEQIDNO:13(dHgp3)、SEQIDNO:14(dHgp4)、SEQIDNO:15(dHgp5)、SEQIDNO:16(dHgp6)、SEQIDNO:17(dHgp7)、SEQIDNO:18(dHgp8)、SEQIDNO:19(dHcap(FL)-mm)、SEQIDNO:20(dHcap1-mm)、SEQIDNO:21(dHcap2_mm)、SEQIDNO:22(dHcap3_mm)、SEQIDNO:23(dHcap4-mm)、SEQIDNO:24(dHcap5_mm)、SEQIDNO:25(dHcap6-mm)、SEQIDNO:26(dHcap7-mm)、SEQIDNO:27(dHgp(FL)-mm)、SEQIDNO:28(dHgpl_mm)、SEQIDNO:29(dHgp2-mm)、SEQIDNO30(dHgp3-mm)、SEQIDNO31(dHgp4_mm)、SEQIDNO:32(dHgp5-mm)、SEQIDNO33(dHgp6-mm)、SEQIDNO34(dHgp7-mm)、SEQIDNO35(dHcap(FL)mutl)、SEQIDNO36(dHcap1mutl)、SEQIDNO:37(dHcap2mutl)、SEQIDNO:38(dHcap3mutl)、SEQIDNO:39(dHcap4mutl)、SEQIDNO:40(dHcap5mutl)、SEQIDNO41(dHcap6mutl)、SEQIDNO42(dHcap7mutl)、SEQIDNO43(dHgp(FL)mutl)、SEQIDNO:44(dHgpImut1)、SEQIDNO45(dHgp2mutl)、SEQIDNO:46(dHgp3mutl)、SEQIDNO:47(dHgp4mutl)、SEQIDNO48(dHgp5mutl)、SEQIDNO:49(dHgp6mutl)、SEQIDNO50(dHgp7mutl)、SEQIDNO:51(dHcap6-mutl_dSL2)、SEQIDNO:52(dHgp6-mutl-dSL2(-S))；SEQIDNO:53(dHcapU)和SEQIDNO:54(dHgpU)。括號中給出了為其已經(jīng)合成這些5’序列實(shí)例的特定輔助子。由于使用其他的核苷酸來提供近-最佳Kozak共有序列以增強(qiáng)結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列在一些輔助構(gòu)建體中的翻譯，序列長度可以略有不同。(用于結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列的編碼區(qū)的ATG(RNA中的AUG)不包括在這些5’序列中)。包含上述核苷酸序列的本發(fā)明的RNA分子可以用于本發(fā)明的方法中，以任意組合、任意次序和/或任意數(shù)量用于α病毒復(fù)制顆粒的生產(chǎn)。本發(fā)明另外提供了含有本發(fā)明RNA分子的載體和/或核酸構(gòu)建體。此外還提供了含有本發(fā)明的一個或更多個RNA分子和一個或更多個α病毒復(fù)制子載體的細(xì)胞。一個或更多個的意思是一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個等。本發(fā)明的細(xì)胞是其中可以表達(dá)編碼α病毒蛋白的核酸構(gòu)建體的任何細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞實(shí)例包括，但不限于，Vero、幼倉鼠腎(BHK)、293、293T/17(ATCC登錄號CRL-11268)、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、UMNSAH/DF-1(ATCC登錄號CRL-12203)、PERC6和中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在此還提供了制備α病毒復(fù)制子顆粒的方法，其包括將本發(fā)明的一個或更多個RNA分子引入細(xì)胞中，由此RNA分子的組合連同α病毒復(fù)制子RNA在由此產(chǎn)生α病毒復(fù)制子顆粒的條件下編碼生產(chǎn)α病毒復(fù)制子顆粒需要的所有α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，α病毒顆粒模擬天然α病毒的結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其中用衣殼蛋白覆蓋復(fù)制子RNA，然后用含有α病毒糖蛋白的細(xì)胞膜包被。在這樣的實(shí)施方案中，α病毒結(jié)構(gòu)蛋白全部來自相同的α病毒。在可替換的實(shí)施方案中，α病毒蛋白可以來自不同的α病毒，只要這些不同的蛋白在顆粒裝配過程中彼此“識別”或它們是修飾的(如文獻(xiàn)中所述的)，使得它們能夠彼此識別。在本發(fā)明方法的一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的兩個RNA分子引入本發(fā)明的細(xì)胞中，其中兩個RNA分子以由此在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生生產(chǎn)α病毒復(fù)制子顆粒所需的全部結(jié)構(gòu)蛋白的組合編碼不同的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此，本發(fā)明提供了一種方法，其中將兩個RNA分子引入細(xì)胞中并且其中兩個RNA中的第一個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白但不是全部結(jié)構(gòu)蛋白，而兩個RNA分子中的第二個RNA分子編碼不是由第一個RNA分子編碼的一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。還提供了一種方法，其中將本發(fā)明的三個RNA分子引入細(xì)胞中，其中三個RNA分子以由此在細(xì)胞中產(chǎn)生生產(chǎn)α病毒復(fù)制子顆粒所需的全部結(jié)構(gòu)蛋白的組合各自編碼不同的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此，提供了一種方法，其中將本發(fā)明的三個RNA分子引入細(xì)胞中，其中三個RNA分子中的第一個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白但不是全部結(jié)構(gòu)蛋白，而三個RNA分子中的第二個RNA分子編碼一個或更多個不同于由第一個RNA分子編碼的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并且三個RNA分子中的第三個RNA分子編碼一個或更多個不同于由第一個RNA分子和第二個RNA分子編碼的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。例如，在一個實(shí)施方案中，第一個RNA分子可以編碼α病毒衣殼蛋白，第二個RNA分子可以編碼α病毒糖蛋白El和第三個RNA分子可以編碼α病毒糖蛋白Ε2。在一些實(shí)施方案中，通過由α病毒結(jié)構(gòu)蛋白包裝的復(fù)制子RNA編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的一個或更多個，但不是全部。例如，在此要求的α病毒復(fù)制子顆粒制備方法中所用的重組RNA可以包括作為目標(biāo)核酸和/或除了目標(biāo)核酸以外的編碼一個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白或超過一個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。因此，在特定的實(shí)施方案中，復(fù)制子RNA編碼一個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白或超過一個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白?？梢詫⒃搹?fù)制子RNA和本發(fā)明的一個或更多個RNA輔助分子一起引入細(xì)胞群中，使得復(fù)制子RNA和RNA輔助分子產(chǎn)生全部的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并且在所述細(xì)胞中將RNA復(fù)制子包裝至顆粒中。在更多的實(shí)施方案中，提供了制備α病毒復(fù)制子顆粒的方法，其包括將下列引入細(xì)胞中a)α病毒復(fù)制子RNA；b)本發(fā)明的一個或更多個RNA分子；和c)一個或更多個啟動子輔助的α病毒輔助構(gòu)建體，由此(b)的RNA分子和(c)的輔助構(gòu)建體的組合在由此產(chǎn)生α病毒復(fù)制子顆粒的條件下編碼生產(chǎn)α病毒復(fù)制子顆粒需要的全部α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此，在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，“啟動子輔助的輔助構(gòu)建體”，即，在啟動子例如26S啟動子的指導(dǎo)下表達(dá)一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組DNA或RNA分子，結(jié)合本發(fā)明的輔助分子來使用。在一組RNA分子的實(shí)施方案中，“啟動子輔助的輔助構(gòu)建體”包括第一個核酸序列，其編碼(i)5’α病毒復(fù)制識別序列，(ii)轉(zhuǎn)錄啟動子，(iii)編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列和(iv)3’α病毒復(fù)制識別序列。在另一組RNA分子的實(shí)施方案中，“啟動子輔助的輔助構(gòu)建體”是重組輔助核酸，如W02004/085660中所述的(2004年10月7日公開，在此引入作為參考)，其包括編碼5，α病毒復(fù)制識別序列的核酸序列，就在IRES元件上游的α病毒亞基因組啟動子，至少一個編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和編碼3’α病毒復(fù)制識別序列的核酸。在更多的實(shí)施方案中，這些啟動子輔助的輔助構(gòu)建體可以包含位于就在亞基因組啟動子的下游和就在IRES元件上游的間隔核酸。間隔核酸可以包含任何隨機(jī)或特定的非編碼核酸序列或由任何隨機(jī)或特定的非編碼核酸序列組成，該序列足夠長以防止至少一些從信使RNA的5’帽的翻譯，并且在一些實(shí)施方案中，防止全部翻譯，使得結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯然后直接受IRES的指導(dǎo)，部分或全部?；蛘?，間隔核酸可以是給予核酸足夠的二級結(jié)構(gòu)以防止至少一些和可能全部的從信使RNA的5’帽的翻譯活性的長度和序列結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中所用的啟動子輔助的輔助構(gòu)建體還可以是DNA分子，其可以穩(wěn)定地整合至輔助細(xì)胞的基因組中，或從沒有明顯整合的游離基因(例如，質(zhì)粒)瞬時表達(dá)。本發(fā)明的DNA分子可以是任何DNA載體，包括但不限于，非整合DNA載體，如質(zhì)粒，或病毒載體。在本發(fā)明使用如在此所述的“輔助細(xì)胞”或“包裝細(xì)胞”并包括本發(fā)明的無啟動子RNA分子的實(shí)施方案中，輔助細(xì)胞可以進(jìn)一步包括任意組合的啟動子輔助的輔助構(gòu)建體(RNA和/或DNA)，使得輔助細(xì)胞包括足以產(chǎn)生本發(fā)明α病毒復(fù)制子顆粒的編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的組合。在特定的實(shí)施方案中，El和Ε2糖蛋白由第一個輔助構(gòu)建體編碼，而衣殼蛋白由第二個輔助構(gòu)建體編碼。在另一個實(shí)施方案中，El糖蛋白、Ε2糖蛋白和衣殼蛋白各自由分開的輔助構(gòu)建體編碼(例如，第一個、第二個和第三個)。在其他實(shí)施方案中，衣殼蛋白和糖蛋白El或Ε2由第一個輔助構(gòu)建體編碼，而剩余的未包括在第一個輔助構(gòu)建體中的糖蛋白El或Ε2由第二個具有或不具有衣殼編碼序列的輔助構(gòu)建體編碼。在其他實(shí)施方案中，α病毒糖蛋白El和Ε2以及衣殼蛋白可以全部在一個輔助構(gòu)建體上編碼，以任何次序和/或任何數(shù)量。在本發(fā)明包括的實(shí)施方案中，還可能的是通過超過一個的輔助構(gòu)建體來表達(dá)給定的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白?？梢詫⒈景l(fā)明的無啟動子RNA輔助子，任選結(jié)合在此所述的其他已知輔助子，以任意組合、任何次序和/或任何數(shù)量引入α病毒允許細(xì)胞中。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中(例如，用于編碼無啟動子RNA分子的DNA構(gòu)建體或啟動子輔助的RNA輔助構(gòu)建體)，使用指導(dǎo)從DNA轉(zhuǎn)錄RNA的啟動子，即，DNA依賴性RNA聚合酶，在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中合成RNA，并且適于該用途的特定啟動子包括，但不限于，SP6、Τ7和T3RNA聚合酶啟動子。在本發(fā)明的所有實(shí)施方案中，考慮了至少一個α病毒結(jié)構(gòu)和/或非結(jié)構(gòu)蛋白由無啟動子輔助分子和/或啟動子輔助的輔助構(gòu)建體和/或復(fù)制子載體來編碼，以及復(fù)制子核酸的非翻譯區(qū)可以含有一個或更多個減毒突變，如在此所述的，以任意組合。本發(fā)明進(jìn)一步提供了α病毒復(fù)制子顆粒群，其中該群在每IO8個α病毒復(fù)制顆粒中含有少于一個可復(fù)制α病毒顆粒。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該群在每ΙΛΙΟΟ11、IO12或IO13個α病毒復(fù)制子顆粒中含有少于一個可復(fù)制α病毒顆粒。本發(fā)明另外提供了α病毒復(fù)制子顆粒群，其中該群不含有可檢測的可復(fù)制病毒顆粒，如通過根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法在培養(yǎng)物中的允許細(xì)胞上的傳代所測定。在此還提供了一組α病毒復(fù)制顆粒，其中該群在每108、109、IOiqUOiiUO12或IO13個α病毒復(fù)制子顆粒中不含有可檢測的或含有少于一個的可復(fù)制α病毒顆粒，如通過在培養(yǎng)物中的允許細(xì)胞上的傳代所測定，其中α病毒復(fù)制子顆粒在α病毒結(jié)構(gòu)蛋白或α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白或α病毒結(jié)構(gòu)蛋白和α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白兩者中含有一個或更多個減毒突變。此外，提供了α病毒復(fù)制子顆粒群，其中該群不含有可檢測的可復(fù)制病毒顆粒，如通過在培養(yǎng)物中的允許細(xì)胞上的傳代所測定，其中α病毒復(fù)制子顆粒在α病毒結(jié)構(gòu)蛋白或α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白或α病毒結(jié)構(gòu)蛋白和α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白兩者中含有一個或更多個減毒突變。發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)了盡管缺少可識別的“包裝信號”，本發(fā)明的輔助RNA以及文獻(xiàn)中描述的輔助RNA在培養(yǎng)的細(xì)胞中通過α病毒結(jié)構(gòu)蛋白得到包裝，有時候以明顯高于文獻(xiàn)中報(bào)道的頻率。因此，通過該群中顆粒子集的存在，將本發(fā)明的α病毒復(fù)制子顆粒群與文獻(xiàn)中描述的那些顆粒區(qū)分開來，該群中包裝了本發(fā)明的新輔助分子。術(shù)語“α病毒復(fù)制子顆?！?、“ARP”、“病毒復(fù)制子顆粒”或“重組α病毒顆?！痹诖丝苫Q使用，意思是引入了表達(dá)一個或更多個異源RNA序列的α病毒復(fù)制子RNA的病毒粒子樣結(jié)構(gòu)復(fù)合物。通常，病毒粒子樣結(jié)構(gòu)復(fù)合物包括一個或更多個包埋在脂質(zhì)包膜中的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，脂質(zhì)包膜包裹核殼，其依次包裹RNA。脂質(zhì)包膜通常源自產(chǎn)生顆粒的細(xì)胞的質(zhì)膜。在特定的實(shí)施方案中，α病毒復(fù)制子顆粒由核殼結(jié)構(gòu)圍繞，核殼結(jié)構(gòu)由α病毒衣殼蛋白組成，并且α病毒糖蛋白包埋在細(xì)胞衍生的脂質(zhì)包膜中。結(jié)構(gòu)蛋白和復(fù)制子RNA可以源自相同或不同的α病毒。在特定的實(shí)施方案中，復(fù)制子RNA源自VEE，而結(jié)構(gòu)蛋白源自辛德畢斯病毒(參見，例如，Dubensky等，U.S.專利No.6，376，236)。α病毒復(fù)制子顆粒是傳染性的，但是傳播缺陷的，即，在編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的輔助核酸不存在的情況下，復(fù)制子RNA不能在顆粒最初感染的細(xì)胞外傳代。術(shù)語“α病毒RNA復(fù)制子”、“α病毒復(fù)制子RNA”、“α病毒RNA載體復(fù)制子”和“載體復(fù)制子RNA”可互換使用，其指的是表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白基因的RNA分子，使得其可以指導(dǎo)其自身的復(fù)制(擴(kuò)增)，并最少包括5’和3’α病毒復(fù)制識別序列(其可以是最小的序列，如上所述，但或者可以是來自α病毒的完整區(qū)域)，α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的編碼序列和多腺苷酸化通道。其可以另外含有啟動子和/或IRES。還可以將其工程化來表達(dá)α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。Johnson等和Polo等描述了各種用于這樣的α病毒RNA復(fù)制子的構(gòu)建體，并且在此將這樣的構(gòu)建體引入作為參考。在α病毒復(fù)制子RNA的一個實(shí)施方案中，將α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白分成兩個分開的翻譯單位，如U.S.專利公開2003-0119182-Α1中所述的，在此引入作為參考。沒有異源序列的α病毒復(fù)制子RNA，S卩，空復(fù)制子，可以用于α病毒復(fù)制子顆粒中來生產(chǎn)佐劑組合物。或者，α病毒復(fù)制子RNA可以表達(dá)編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和/或其他異源核酸序列，后一種情況可以選自各種源自病毒、原核生物和/或真核生物的序列。異源序列種類的實(shí)例包括，但不限于，免疫原(包括天然的、修飾的或合成的抗原蛋白、肽、免疫原性片段或抗原決定部位)、細(xì)胞因子、毒素、治療蛋白、酶、反義序列和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。如果合適并且是特定應(yīng)用所需，然后將轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯，S卩，合成蛋白質(zhì)或產(chǎn)生功能性RNA。這些mRNA在真核細(xì)胞內(nèi)“加帽”，S卩，在mRNA的5’端存在甲基-7-鳥苷(5’)pppN結(jié)構(gòu)(“帽”或“5’帽”)，并且該帽通過從mRNA合成蛋白的翻譯啟動因子來識別。因此，26S啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，而“帽”提供了用于翻譯的啟動信號。在一些實(shí)施方案中，復(fù)制子RNA可以缺乏編碼任何α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸。在其他實(shí)施方案中，α病毒復(fù)制RNA可以包含編碼一個或兩個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，但是復(fù)制子RNA不含有編碼全部α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸。因此，本發(fā)明所得到的α病毒復(fù)制子顆粒是傳播缺陷的，因?yàn)閺?fù)制子RNA沒有編碼包被復(fù)制子RNA和裝配傳染性病毒粒子所需的全部結(jié)構(gòu)蛋白。所要求的本發(fā)明中所用的α病毒RNA復(fù)制子的特定實(shí)施方案可以含有一個或更多個減毒突變，如在此詳細(xì)描述的。減弱核苷酸置換的實(shí)例包括在此所述的在VEE5’端中的核苷酸3處的突變以及α病毒S.A.AR86中的nsPl氨基酸位置，nsP2氨基酸位置96或nsP2氨基酸位置372處的突變。本發(fā)明的α病毒復(fù)制子顆粒可以含有來自任何α病毒的復(fù)制子RNA。此外，本發(fā)明的α病毒復(fù)制子顆?？梢院衼碜员景l(fā)明任一種α病毒的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此，復(fù)制子顆?？梢杂蓙碜韵嗤摩敛《净騺碜圆煌敛《镜膹?fù)制子RNA和結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，后一種情況將是嵌合α病毒復(fù)制子顆粒(例如，包含基于VEE病毒的復(fù)制子RNA和辛德畢斯病毒結(jié)構(gòu)蛋白的顆粒)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以是辛德畢斯病毒結(jié)構(gòu)蛋白、SFV結(jié)構(gòu)蛋白、VEE結(jié)構(gòu)蛋白、羅斯河病毒結(jié)構(gòu)蛋白、EEE結(jié)構(gòu)蛋白和/或TOE結(jié)構(gòu)蛋白。這些可以彼此任意組合并可以結(jié)合非結(jié)構(gòu)蛋白和其他α病毒序列而存在，其他序列如5’α病毒復(fù)制識別序列，α病毒亞基因組啟動子和3’α病毒復(fù)制識別序列，來自這些或其他α病毒中的任何一種，以生產(chǎn)本發(fā)明的嵌合重組α病毒復(fù)制子顆粒和/或嵌合重組核酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以包括含有一個或更多個減毒突變的α病毒核酸、α病毒蛋白、α病毒復(fù)制子RNA和/或α病毒復(fù)制子顆粒，減毒突變限定為一個或更多個核苷酸的核苷酸刪除、添加和/或置換，或包含重排或嵌合構(gòu)建的突變，其導(dǎo)致與合適的野生型α病毒相比，含有突變的活病毒失去了毒力。合適的減毒突變將取決于所用的α病毒，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。示例性減毒突變包括，但不限于，公開于Johnson等的U.S.專利No.5，505，947，Johnson等的U.S.專利No.5，185，440，Davis等的U.S.專利No.5，643，576，Johnson等的U.S.專利No.5，792，462；6,156，558和5，639，650中所述的那些，在此將每一篇的公開內(nèi)容全部引入作為參考。用于VEEEl糖蛋白的特定減毒突變可以包括在El氨基酸位置81、272或253任一處的減毒突變。從VEE-3042突變體制得的α病毒復(fù)制子顆粒在Ε1-81處含有異亮氨酸置換，而從VEE-3040突變體制得的病毒復(fù)制子顆粒在Ε1-253處含有減毒突變。用于VEEΕ2糖蛋白的特定減毒突變可以包括在Ε2氨基酸位置76、120或209任一處的減毒突變。從VEE-3014突變體制得的α病毒復(fù)制子顆粒在Ε1-272和Ε2-209處含有減毒突變(參見U.S.專利No.5，792，492)。用于VEEΕ3糖蛋白的特定減毒突變包括由Ε3氨基酸56-59的刪除構(gòu)成的減毒突變。從VEE-3526突變體制得的病毒復(fù)制子顆粒在Ε3中含有該刪除(aa56-59)以及在E1-253處的第二個減毒突變。用于S.A.AR86E2糖蛋白的特定減毒突變包括在E2氨基酸位置304、314、372或376任一處的減毒突變?；蛘?，減毒突變可以是E2糖蛋白中的氨基酸的置換、刪除或插入，例如，在以下氨基酸位置的任一處或更多處，任意組合158、159、160、161和162(參見Polo等，PCT公開No.W000/61772)?；蛘撸景l(fā)明的RNA分子可以源自TC83，VEE的疫苗株(參見W02005/113782，在此將其引入作為參考)。本發(fā)明的另一種減毒突變可以是在VEE基因組RNA的核苷酸3處的減毒突變，即，5’甲基化帽之后的第三個核苷酸(參見，例如，U.S.專利No.5，643，576，描述了在nt3的G—C突變)。該突變，位于病毒或復(fù)制子的非編碼序列中，在一些實(shí)施方案中，可以是G—A或G—U突變。當(dāng)α病毒結(jié)構(gòu)和/或非結(jié)構(gòu)蛋白來自S.A.AR86時，文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白中的示例性減毒突變(參見，例如，U.S.專利No.5，639，650和U.S.專利No.6，982，987，在此將其公開內(nèi)容全部引入作為參考)。本發(fā)明的α病毒可以是辛德畢斯病毒株(例如，TR339)、VEE(例如，在甲基化帽或TC83后的基因組RNA的核苷酸3處具有突變)、S.A.AR86病毒、GirdwoodS.Α.病毒、Ockelbo病毒和/或其嵌合病毒。對于各種α病毒的完整基因組序列以及各種結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的序列在文獻(xiàn)中可獲得，并包括辛德畢斯病毒基因組序列(GenBank登錄號No.J02363、NCBI登錄號No.NC_001547)、S.A.AR86基因組序列(GenBank登錄號No.U38305)、VEE基因組序列(GenBank登錄號No.L04653、NCBI登錄號No.NC_001449)、VEE的TC-83疫苗株(KinneyRM等(1989)，Virology17019-30；結(jié)合關(guān)注RM等(1993)，J.Virol.67(3)1269-1277)；GirdwoodS.A基因組序列(GenBank登錄號No.U38304)，西門利克森林病毒基因組序列(GenBank登錄號No.X04129,NCBI登錄號No.NC_003215)和TR339基因組序列(Klimstra等，(1988)，J.Virol.727357；McKnight等，(1996)J.Virol.701981)。根據(jù)在此公開的方法并結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來制備α病毒復(fù)制子顆粒。這些方法包括首先將選定的輔助子和α病毒復(fù)制子RNA引入α病毒允許細(xì)胞群中，然后在本領(lǐng)域公知的允許產(chǎn)生α病毒復(fù)制子顆粒的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。將輔助子和α病毒復(fù)制子RNA引入輔助細(xì)胞群的步驟可以通過任何方式來進(jìn)行，如在此公開的和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。根據(jù)例如U.S.專利No.7，078，218中所述的方法從輔助或包裝細(xì)胞中收集α病毒復(fù)制子顆粒制劑，在此將該專利內(nèi)容全部引入作為參考?；蛘?，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他技術(shù)(例如，U.S.專利No.5，492，462和6，156，558)從包裝細(xì)胞收集它們。根據(jù)在此所述的和文獻(xiàn)中已知的方法來評價這些制劑中可復(fù)制病毒(RCV)的存在。本發(fā)明的制劑不含有可檢測的RCV，如通過在培養(yǎng)物中的α病毒允許細(xì)胞上的傳代所測定的。在一些實(shí)施方案中，可以使用本發(fā)明在對象中包裝編碼免疫多肽的α病毒RNA復(fù)制子(例如，用于疫苗接種)，用于免疫治療(例如，治療患有癌癥或腫瘤的對象)或免疫調(diào)節(jié)因子(例如，用于輔佐ARP或其他疫苗形態(tài))。本發(fā)明提供了引發(fā)或增強(qiáng)對象中免疫應(yīng)答的方法，包括將有效量的通過本發(fā)明的輔助構(gòu)建體包裝至顆粒中的核酸給予對象。如在此所用的，“引發(fā)免疫應(yīng)答”和“使對象免疫”包括在對象中產(chǎn)生對本發(fā)明的蛋白和/或多肽(例如，免疫原、抗原、免疫性肽和/或一個或更多個抗原決定部位)的體液免疫和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答?！绑w液”免疫應(yīng)答，因?yàn)樵撔g(shù)語是本領(lǐng)域公知的，指的是包括抗體的免疫應(yīng)答，而“細(xì)胞”免疫應(yīng)答，因?yàn)樵撔g(shù)語是本領(lǐng)域公知的，指的是包括T-淋巴細(xì)胞和其他白血球的免疫應(yīng)答，尤其是由HLA-限制的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(即，“CTL”)引起的免疫原特異性應(yīng)答。還考慮了本發(fā)明的核酸、顆粒、制劑和藥物組合物可以用于將目標(biāo)NOI傳送至細(xì)胞的方法中，該細(xì)胞可以是對象中的細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了將異源核酸傳送至細(xì)胞的方法，其包括將有效量的用本發(fā)明的輔助構(gòu)建體包裝的顆粒、制劑和/或組合物引入細(xì)胞中。還提供了將異源核酸引入對象中細(xì)胞中的方法，其包括將有效量的用本發(fā)明的輔助構(gòu)建體包裝的顆粒、制劑和/或組合物引入細(xì)胞中。細(xì)胞可以是能夠吸收并表達(dá)外源核酸的任何細(xì)胞。在由此表達(dá)異源核酸來產(chǎn)生由異源核酸編碼的蛋白、肽或其他編碼序列產(chǎn)物(例如，功能性RNA序列)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。可以根據(jù)公知的用于免疫和/或基因治療的方案，將這樣的方法用來將治療作用給予本發(fā)明的細(xì)胞和/或?qū)ο?。本發(fā)明的“對象”包括，但不限于，溫血動物，例如，人、非人靈長類動物、馬、奶牛、貓、狗、豬、大鼠和小數(shù)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在藥物學(xué)上可接受的載體中含有本發(fā)明的顆粒和/或制劑的組合物(例如，藥物組合物)?！八幬飳W(xué)上可接受的”意思是在生物學(xué)上或其他不是不利的材料，即，可以與選定的顆粒和/或其制劑一起為對象給藥的材料，而沒有引起實(shí)質(zhì)性的有害生物作用或以有害方式影響組合物中含有的任何其他成分。藥物學(xué)上可接受的載體適于給藥或傳送至人和本發(fā)明的其他對象。自然選擇載體以最小化活性成分的任何降解和最小化對象中的任何副作用，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見，例如，Remington'sPharmaceuticalScience；最近的一版)。本發(fā)明的藥物制劑，如疫苗或其他免疫原性組合物，含有致免疫量的使用本發(fā)明的輔助構(gòu)建體產(chǎn)生的感染性的、傳播缺陷的a病毒復(fù)制子顆粒，結(jié)合藥物學(xué)上可接受的載體。示例性藥物學(xué)上可接受的載體包括，但不限于，無菌無熱原水和無菌無熱原生理鹽水溶液?！爸旅庖吡俊笔潜景l(fā)明制劑中足以在給予或傳送了顆粒制劑的對象中引起免疫應(yīng)答的感染性a病毒顆粒的含量。認(rèn)為約104至約109，尤其是106至108傳染單位或“IU”/劑是合適的，如通過在此所述的測試所測定的，該含量取決于待治療對象的年齡和物種?？梢酝ㄟ^任何合適的方式來給藥，如腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)(例如，通過基因槍)、直腸內(nèi)和/或皮下?？梢酝ㄟ^皮膚多次劃破法和/或通過貼劑或液體經(jīng)皮來給藥在此的組合物?？梢砸栽谝欢螘r間內(nèi)釋放組合物的生物可降解材料的形式在皮下來傳送組合物。如在此所用的，“有效量”指的是本發(fā)明的群體或組合物或制劑足以產(chǎn)生所需效果的含量，該效果可以是治療效果。有效量將隨著對象的年齡、一般狀況、待治療病癥的嚴(yán)重程度、給藥的特定藥劑、治療的持續(xù)時間、任何同時進(jìn)行的治療的性質(zhì)、所用的藥物學(xué)上可接受的載體以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知識和專長范圍內(nèi)的類似因素而改變。按照需要，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員參考有關(guān)書本和文獻(xiàn)和/或通過使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定任何個體病例中的“有效量(參見，例如，Remington,TheScienceAndPracticeofPharmacy(第20版，2000))?；蛘撸景l(fā)明的藥物制劑適于為對象給藥的粘膜(例如，通過鼻內(nèi)給藥、口腔給藥和/或吸入)。可以將制劑方便地制成單位劑型并可以通過本領(lǐng)域公知的任一種方法來制備。此外，本發(fā)明的組合物可以用于感染或轉(zhuǎn)染至樹突細(xì)胞中，該細(xì)胞是根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法從對象的細(xì)胞分離或生長得到的，或轉(zhuǎn)染至來自對象的分散的外周血單核細(xì)胞(PBMC)或其各種細(xì)胞亞級分上。如果使用exvivo方法，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案，將細(xì)胞或組織取出并在體外維持，同時將本發(fā)明的組合物引入細(xì)胞或組織中?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方式來配制含有一組本發(fā)明顆粒(將組合物給藥于人或動物時，其指導(dǎo)目標(biāo)核酸序列的表達(dá))的致免疫組合物。通常將這樣的組合物，尤其是疫苗，制成可注射的，如液體溶液或懸浮液。也可以制備在注射之前適于溶解于或懸浮于液體中的固體形式。凍干制劑也是合適的。通常將活性致免疫成分(例如，a病毒復(fù)制子顆粒)與藥物學(xué)上可接受的和/或與活性成分相容的賦形劑和/或載體混合。合適的賦形劑包括但不限于無菌水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合，以及穩(wěn)定劑，例如，HAS或其他合適的蛋白質(zhì)和還原糖。此外，如果需要，疫苗可以含有少量輔助物質(zhì)，如濕潤劑和/或乳化劑，pH緩沖劑和/或提高疫苗功效的佐劑。有效佐劑的實(shí)例包括但不限于QS-21、弗氏佐劑(完全的和不完全的)，鋁鹽(明礬)，磷酸鋁，氫氧化鋁；N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637，稱為nor_MDP)；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1，-2，-二棕櫚酰-sn-丙三氧基-3-羥基磷?；?-乙胺(CGP19835A，稱為MTP-PE)；和RIBI，其在2%角鯊烯/吐溫80乳液中含有從細(xì)菌提取的三種成分，單磷酰基脂A，海藻糖二梅菌酸酯和細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐劑的其他實(shí)例包括，但不限于，水包油型乳液制劑，免疫調(diào)節(jié)劑，如細(xì)菌細(xì)胞壁成分或合成的分子，或寡核苷酸(例如，CpG)和核酸聚合物(雙鏈和單鏈的RNA和DNA)，其可以結(jié)合可選擇的主鏈部分，例如，聚乙烯聚合物?？梢酝ㄟ^測量針對a病毒復(fù)制子顆粒的致免疫產(chǎn)物的抗體或細(xì)胞毒性T_細(xì)胞的含量來測定佐劑的功效，該致免疫產(chǎn)物是由給予還含有佐劑或佐劑組合物的疫苗制劑中的含顆粒組合物引起的。還可以使用本領(lǐng)域已知的其他制劑和給藥方式?？梢詫⒆魟┙Y(jié)合本發(fā)明的組合物或結(jié)合可以結(jié)合本發(fā)明的組合物使用的其他疫苗制劑。本發(fā)明的組合物還可以包括其他藥劑、藥物、載體和稀釋劑。可以將本發(fā)明的組合物優(yōu)化并結(jié)合其他疫苗接種方案來提供最寬的(即，覆蓋免疫應(yīng)答的所有特征，包括以上所述的那些特征)可能的細(xì)胞和體液應(yīng)答。在特定的實(shí)施方案中，這可以包括使用異源初免-加強(qiáng)免疫(prime-boost)策略，其中將本發(fā)明的組合物結(jié)合含有一種或更多種下列的組合物來使用源自病原體或腫瘤的免疫原，重組免疫原，裸露核酸，用含脂質(zhì)部分配制的核酸，非a病毒載體(包括但不限于痘病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，皰疹病毒載體，水泡性口膜炎病毒載體，副粘病毒載體，細(xì)小病毒載體，乳頭狀病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體)和其他a病毒載體。示例性a病毒載體可以是含有復(fù)制子的顆粒，基于DNA的含復(fù)制子載體(有時候稱為“ELVIS”系統(tǒng)，參見，例如，U.S.專利No.5，814，482)和/或裸露RNA載體。以與劑型相容的方式并且以預(yù)防和/或治療有效的含量來給藥本發(fā)明的含致免疫(或另外生物學(xué)活性的)a病毒顆粒的制劑和組合物。待給藥的含量，在一個劑量中通常為約104至約109感染單位/mL，這取決于待治療的對象，給藥或傳送顆粒的途徑，表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性，所需的效應(yīng)免疫應(yīng)答的類型和所需的保護(hù)程度。在一些實(shí)施方案中，約106、107和108I.U.的劑量在人對象中特別有效。所需的待給藥或傳送的活性成分的有效量可以取決于醫(yī)師、獸醫(yī)或其他健康從業(yè)者的判斷，并且對于給定的對象是特定的，但這樣的決定在這樣的從業(yè)者的技術(shù)范圍內(nèi)?？梢砸詥蝿┝炕蚨鄤┝窟M(jìn)度表來給予本發(fā)明的組合物和制劑。多劑量進(jìn)度表是如下的一種情況其中給藥的主要過程可以包括1至10或更多的分開劑量，接著按照維持和或加強(qiáng)所需效果(例如，免疫應(yīng)答)的需要在隨后的時間間隔下給藥其他劑量，例如，每周或1至4個月給藥第二個劑量，并且如果需要，幾個月(例如，4或6個月)/年后給予隨后的劑量?？梢愿鶕?jù)公知的實(shí)驗(yàn)方案來測定本發(fā)明治療方法的功效，用于測定本發(fā)明病癥治療的成果。治療功效的測定，包括但不限于，全部存活，無疾病存活，癥狀、進(jìn)展時間和/或生活質(zhì)量的改善等，如本領(lǐng)域公知的?！霸谥委煛被颉爸委熤小被颉爸委煛敝傅氖墙o予患有失調(diào)、疾病或病癥的對象調(diào)節(jié)效果的任何類型的作用，其例如可以是有益的效果，包括對象病癥的改善(例如，一個或更多個癥狀)，病癥進(jìn)展的延遲或減輕，失調(diào)、疾病或病癥發(fā)作的防止或延遲，和/或失調(diào)、疾病或病癥的任一個臨床參數(shù)的變化等，如本領(lǐng)域公知的?？梢岳斫庵皇峭ㄟ^說明給出了之前的詳述，并且可以在其中進(jìn)行改變和變化而沒有脫離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例實(shí)施例1:dHcap和dHgp輔助子的構(gòu)建設(shè)計(jì)了引物(衣殼F(SEQIDNO98),GPF(SEQIDNO:60)禾口13-101.pr4(SEQIDN0:6)(表1)，用以從VEE輔助質(zhì)粒(對于衣殼輔助子，稱為“13.2.2”，對于糖蛋白輔助子，稱為“13.4.6”)擴(kuò)增衣殼和糖蛋白(GP)基因，這描述于U.S.專利No.5，792，462，Pushko等，1997(Virology239389-401)和PCT公開W002/03917(Olmsted等)中。這些引物各自提供了RsrII限制位點(diǎn)，并且還結(jié)合衣殼或糖蛋白編碼序列的起點(diǎn)。以上引用的參考文獻(xiàn)中所述的DNA質(zhì)粒是獲得結(jié)構(gòu)蛋白編碼片段的方便來源，例如，通過PCR擴(kuò)增。或者，可以從VEE或其減毒變體的全長克隆獲得這些編碼片段(參見，U.S.專利No.5，185，440；U.S.專利5，505，947)。使用這些引物的擴(kuò)增形成具有以下元件的片段，從PCR產(chǎn)物的5’至3’端列出5，-RsrII限制位點(diǎn)，VEE結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列0RF，3，UTR,SphI限制位點(diǎn)_3，。然后用RsrII和SphI限制酶消化PCR產(chǎn)物并連接空VEE復(fù)制子載體，如U.S.專利No.5，792，462，Pushko等，1997(Virology239:389-401)和PCT公開W002/03917(Olmsted等)中所述的。該復(fù)制子RNA含有VEE非結(jié)構(gòu)基因和26S亞基因組RNA啟動子的單個拷貝，接著是多克隆位點(diǎn)(MCS)。在疫苗構(gòu)建體中，將一個或更多個編碼免疫原的序列插入該克隆位點(diǎn)。用RsrII和SphI(除去大部分nsPl和全部nSPS2-4)消化該載體，并在連接時，產(chǎn)生了包括完整a病毒5，和3，端的輔助子，即，“全長”端。因此，將這兩個輔助子稱為dHcap(FL)和dHgp(FL)，并且它們具有SEQIDNO1和SEQIDNO10各自的5，序列以及SEQIDNO55和SEQIDNO:56各自的3，序列(圖1)。隨后，在存在于dHcap(FL)和dHgp(FL)輔助子中的522nt5，端中制得八個大約每個50nt的連續(xù)刪除(圖2)。以兩個步驟來進(jìn)行該程序。首先，設(shè)計(jì)八個與13.2.2和13.4.6輔助子(如上所述)的5，端直至位置502互補(bǔ)的反向引物(dHelpl-8R，SEQIDNO:63_70)，并且將每個工程化來另外含有RsrII限制位點(diǎn)(表1)。設(shè)計(jì)了正向引物(3-16.1.1(SEQIDNO:62)，表1)，然后將其與任一個反向引物混合，擴(kuò)增具有以下元件的片段(5’至3’列出)5’-Xbal限制位點(diǎn)，T7啟動子，5’截短端，RsrII限制位點(diǎn)_3’。其次，將擴(kuò)增的5’截短端片段克隆至用Xbal和RsrII線性化的dHcap(FL)和dHgp(FL)輔助子中。這產(chǎn)生了八組5，截短端輔助子構(gòu)建體，稱為dHcapl-8和dHgpl-8，其各自具有SEQIDN0:2_9和SEQIDNO11-18的5，序列。在此作為SEQIDNO55提供了dHcap系列每個成員的3，序列和在此作為SEQIDNO56提供了dHgp系列每個成員的3，序列。實(shí)施例2.無啟動子輔助表達(dá)盒的表達(dá)分析方法為了測定在此所述的A26S輔助構(gòu)造表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白有多好，將每個輔助子連同上述的VEE復(fù)制子載體一起電穿孔至Vero細(xì)胞中。為了證明本發(fā)明新的無啟動子結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)盒的能力，通過將GFP或肉毒桿菌神經(jīng)毒素編碼序列插入VEE復(fù)制子載體的克隆位點(diǎn)中。使用在此所述的無啟動子結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)盒的各種組合進(jìn)行的從顆粒表達(dá)這些編碼序列證明了這些盒的實(shí)用性和新穎性。根據(jù)制造商的程序使用RiboMAXT7Express轉(zhuǎn)錄試劑盒(PromegaCorporation,Madison,WI)通過失控轉(zhuǎn)錄從每個輔助子和復(fù)制子載體轉(zhuǎn)錄RNA。在電穿孔之前，通過硅基色譜分離來純化輔助子和復(fù)制子RNA?；旌先⒖?30yg)的每種輔助子和復(fù)制子RNA，并電穿孔至3-5X107個Vero細(xì)胞中。將電穿孔的細(xì)胞在培養(yǎng)基中稀釋并接種于25cm2燒瓶或96孔平板中。然后將電穿孔的細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)16_24hr。A.IFA分析用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)將接種于96孔平板中的電穿孔細(xì)胞洗滌一次，然后用丙酮甲醇(11)在室溫下固定五分鐘。然后使用結(jié)構(gòu)蛋白特異性鼠抗體來分析細(xì)胞的VEE衣殼或GP蛋白的表達(dá)。將一抗稀釋于PBSFBS(11)中，并將100yl加入每個孔中。將平板在37°C下培養(yǎng)30min，用150ylPBS洗滌三次，然后用AlexaFluor488山羊抗鼠二抗(Invitrogen，Carlsbad,CA)在37°C下培養(yǎng)30min。培養(yǎng)后，如上所述再次將細(xì)胞洗滌，并在通過紫外線熒光顯微鏡(NikonEclipseTE300)觀察之前，將100yl終體積的PBS加入每個孔中。B.Northern分析用PBS洗滌接種于25cm2燒瓶中的電穿孔細(xì)胞，然后按照制造商建議的實(shí)驗(yàn)方案使用RNAwizRNA分離試劑(Ambion，Austin,TX)提取總細(xì)胞RNA。通過分光光度測定法來測定RNA濃度。將五微克(5iig)的每種樣品通過乙二醛瓊脂糖凝膠來電泳，RNA被動轉(zhuǎn)移至BrightStarpius(Ambion)膜。按照制造商建議的實(shí)驗(yàn)方案使用BrightStarBioDeteCt試劑盒(Ambion)，用VEE3’復(fù)制識別序列正鏈的特異性生物素化DNA寡聚物來進(jìn)行Northern分析。通過將處理過的膜暴露于膠片來檢測化學(xué)發(fā)光。C.dHcap(FL)和dHgp(FL)表達(dá)的分析為了證明全長A26S輔助子(dHcap(FL)和dHgp(FL))能夠復(fù)制并表達(dá)蛋白，將這些輔助RNA連同復(fù)制子載體一起電穿孔至細(xì)胞中，需要復(fù)制子載體來提供促進(jìn)輔助RNA復(fù)制的a病毒非結(jié)構(gòu)蛋白。用30或60iig的dHcap(FL)和dHgp(FL)輔助RNA結(jié)合30yg的復(fù)制子RNA將Vero細(xì)胞電穿孔。如上所述，將電穿孔的細(xì)胞進(jìn)行處理，用于IFA、WeStern印跡和Northern分析。實(shí)施例3全長的和截短的A26S輔助子的表達(dá)分析dHcap(FL)和dHgp(FL)輔助子表達(dá)了蛋白，如通過IFA和Western印跡所測定的，并且得到了有效地復(fù)制，如通過Northern印跡所證明的。分析用于衣殼和GP的完整組的截短A26S復(fù)制子(刪除1_8)，通過IFA分析蛋白表達(dá)，通過Northern印跡測定各自的表達(dá)和復(fù)制有多好。將每個dHcap輔助RNA結(jié)合VEE復(fù)制子RNA和13.4.6糖蛋白輔助RNA，并將三個RNA電穿孔至Vero細(xì)胞中。如上所述進(jìn)行Northern分析和IFA。使用衣殼特異性抗體的IFA的結(jié)果顯示于表2中。所有dHcap輔助子對于通過IFA測定的衣殼表達(dá)都是陽性的，盡管dHcapS輔助子只是弱陽性的。從電穿孔細(xì)胞提取的RNA的Northern分析表明所有截短的衣殼A26S輔助子復(fù)制良好，除了dHcap8。以相似的方式檢測dHgp輔助子，除了該實(shí)驗(yàn)中不包括13.2.2衣殼輔助子。將每個dHgp輔助子結(jié)合VEE復(fù)制子RNA，電穿孔至細(xì)胞中，并如上所述產(chǎn)生用于IFA和Northern分析的樣品?？?GPIFA的結(jié)果顯示于表3中。與dHcap輔助子相似，所有dHgp輔助子是陽性的，除了dHgp8。所有dHgp輔助子輔助良好，除了dHgp8。實(shí)施例4改良的無啟動子輔助構(gòu)建體發(fā)明人注意到dHcap(FL)和dHgp(FL)表達(dá)了融合蛋白，如通過Western印跡顯示的。這樣的融合蛋白可能是在用于A26S輔助子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上的衣殼或GP的起始密碼子的框內(nèi)起始密碼子上游處翻譯啟動的結(jié)果。一種這樣的上游密碼子是用于VEEnsPl的天然起始密碼子(位于VEE病毒基因組中的核苷酸45處)，其存在于dHcap和dHgp輔助子的5’端，在偏好的情況中，用于翻譯的啟動(例如，Kozak共有序列)?？赡苁强梢酝ㄟ^核糖體從這些輔助子的加帽5’端的掃描來使用有利的Kozak環(huán)境中的起始密碼子，由此產(chǎn)生非功能性的融合蛋白并降低從位于更下游的合適起始密碼子產(chǎn)生功能性衣殼和糖蛋白多肽。使用兩種方法來降低所產(chǎn)生的這種融合蛋白的含量并提高全長衣殼和糖蛋白的蛋白表達(dá)。首先，將上述的偏好起始密碼子突變成TAG終止密碼子，而剩余的起始密碼子未改變。采用這種方法使5’端序列盡可能地保持與天然VEE基因組中存在的序列相接近，以維持這些輔助子依賴的復(fù)制元件。其次，nt3的起始密碼子下游(包括nsP1(偏好)起始密碼子)和衣殼或糖蛋白編碼序列開放閱讀框(0RF)全部從AUG變成GUG(存在總的12個變化)。采用這種方法來測定較低偏好的ATG密碼子(RNA中的AUG)是否也對全長衣殼的產(chǎn)生或糖蛋白表達(dá)具有不利影響。A.dHcap-mutl和dHgp-mutl輔助子的構(gòu)建為了形成偏好nsPl起始密碼子已經(jīng)變成TAG終止密碼子的dHcap和dHgp輔助子，對每個dHcap和dHgp輔助子進(jìn)行定點(diǎn)誘變，產(chǎn)生完整組(FL和截短1-7)的突變輔助子，稱為dHcap-mutl和dHgp-mutl輔助子，其各自具有在此如SEQIDNO35-42和43-50提供的5’序列。根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)方案使用QuikchangeXL定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，使用表4中的正向(SEQIDN071)和反向(SEQIDNO72)引物。B.dHcap-mm和dHgp-mm輔助子的構(gòu)建為了產(chǎn)生帶有不具有nt3的任何起始密碼子下游和衣殼或GP0RF起始密碼子的5’端的dHcap和dHgp輔助子，進(jìn)行了定點(diǎn)誘變，將所有干涉atg(rna中的aug)密碼子變成gtg(rna中的gug)密碼子。將dHgp(fl)構(gòu)建體用作定點(diǎn)誘變的模板。使用Quikchange多定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene)來引入密碼子改變，使用制造商的實(shí)驗(yàn)方案。用于引入密碼子改變的引物顯示于表5中(seqIDno:73-82)。將含有所有密碼子變化的dHgp(el)構(gòu)建體稱為dHgp(fl)-mm(具有在此作為seqIDno:19提供的5，序列)。證實(shí)序列存在所有密碼子變化后，將該dna用于產(chǎn)生dHcap(fl)-mm構(gòu)建體，通過用來自dHgp(fl)-mm的5，復(fù)制識別序列替換dHcap(fl)5，復(fù)制識別序列。通過用RsrII和NotI酶消化dna來完成這。然后將dHcap(fl)-mmRsrII/NotI5，復(fù)制識別序列片段連接線性化的dHcap(fl)DNA，產(chǎn)生dHcap(fl)-mm(具有在此作為seqIDNO27提供的5，序列)。此外，將dHgp(fl)-mmDNA用作模板來產(chǎn)生用于衣殼和GP輔助子的5’截短端組，使用以上對于dHcapl-7和dHgpl_7所述的方法和引物。將新的輔助子稱為dHcaplmm-dHcap7mm(具有在此作為seqIDNO:20-26提供的5，序列)和dHgpImm-dHgp7mm(具有在此作為seqIDNO28-34提供的5，序列)。C.mutl和mm無啟動子輔助子的表達(dá)分析分析了從上述A26S輔助子的各種mutl和mm形式的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。在該實(shí)驗(yàn)中，通過Western印跡分析了dHcap6_mutl(具有在此作為SEQIDNO41提供的5，序列)、dHcap6-mm(具有在此作為SEQIDNO25提供的5，序列)、dHcap7-mm(具有在此作為SEQIDNO26提供的5，序列)和dHgp-7mm(具有在此作為SEQIDNO27提供的5，序列)以及13.2.2和13.4.6輔助子。含有mm突變的A26S輔助子主要表達(dá)了全長衣殼或GP蛋白，幾乎沒有可檢測的融合蛋白。Mutl輔助子表達(dá)了大量全長結(jié)構(gòu)蛋白，但它們還持續(xù)表達(dá)一些融合蛋白。對相同的樣品進(jìn)行了Northern分析來分析mutl和mmA26S輔助子的復(fù)制特征。結(jié)果表明dHcap6-mutl輔助子和13.2.2衣殼輔助子復(fù)制一樣好。相反，dHcap6-mm,dHcap7-mm和dHgp7-mm輔助子似乎復(fù)制的程度低于13.2.2或mutl輔助子。實(shí)施例5使用A26S輔助子產(chǎn)生VEE復(fù)制子顆粒表6中列出的是結(jié)合不同的無啟動子衣殼和GP輔助子與VEE復(fù)制子RNA來產(chǎn)生VEE復(fù)制子顆粒(VRP)的各種實(shí)驗(yàn)。此外，在一些實(shí)驗(yàn)中，引入細(xì)胞中的各個輔助子RNA的含量也是不同的。通過用所示含量的輔助RNA以及30iig復(fù)制子RNA電穿孔5X107至lX108Vero細(xì)胞來產(chǎn)生VRP。通常，對于其中產(chǎn)生顆粒的所有實(shí)驗(yàn)，將電穿孔的細(xì)胞接種于含有無血清培養(yǎng)基的300cm2燒瓶中并在收集VRP之前培養(yǎng)16-24hr。通過以下方法來測定VRP滴定度用十倍連續(xù)稀釋的樣品感染生長于96孔平板中的Vero細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)16-18hr，固定細(xì)胞并使用VEEnsP2蛋白特異性抗體或目標(biāo)核酸產(chǎn)物進(jìn)行IFA。將VRP產(chǎn)量報(bào)道為來自實(shí)驗(yàn)的總產(chǎn)量(即，表6)或基于每ml的來自20ml制劑的總產(chǎn)量(表7，9-13，15和16)。還通過細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)試驗(yàn)測試了這些制劑中可復(fù)制病毒(RCV)的存在。CPE試驗(yàn)由細(xì)胞培養(yǎng)物中的兩次盲目傳代組成，以篩選RCV的存在。對于傳代1，用Vero細(xì)胞單層將來自VRP制劑的樣品在37°C下培養(yǎng)lhr，然后除去樣品流體并用新鮮培養(yǎng)基替換，將培養(yǎng)物培養(yǎng)24hr，以允許可能存在的任何RCV擴(kuò)增。對于傳代2，在傳代1結(jié)束時將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液加入新鮮Vero細(xì)胞單層中并在37°C下培養(yǎng)72hr。在傳代2結(jié)束時，使用倒置光學(xué)顯微鏡檢查培養(yǎng)物的CPE。已經(jīng)將該試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化，并對于在大量VRP存在下檢測活病毒的靈敏度進(jìn)行了評價。在該試驗(yàn)中使用V3014或TC-83，摻加示蹤劑研究表明了在1X108VRP的背景基礎(chǔ)上3-8PFU較低的檢測極限。已經(jīng)對使用本發(fā)明的無啟動子輔助子產(chǎn)生的超過1013的VRP進(jìn)行了該試驗(yàn)，尚未檢測到RCV。盡管該試驗(yàn)的檢測極限，使用該檢測極限，對于產(chǎn)生RCV的可能重組頻率的理論計(jì)算低得多，S卩，101QVRP中1個，10"VRP中1個，1012VRP中1個或1013VRP中1個。實(shí)施例6.“切割糖蛋白”無啟動子輔助子A.分開的E2和E1無啟動子輔助子的構(gòu)建通過將E2和E1糖蛋白盒分開克隆至dHgp6-mutl輔助子的主鏈中來構(gòu)建其中E2和E1編碼序列置于分開的輔助子上的糖蛋白無啟動子輔助子的構(gòu)建。設(shè)計(jì)引物來通過PCR從pHCMV-Vsp擴(kuò)增VEE結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的衣殼-E3-E2區(qū)(參見，U.S.專利No.7，045，335，在此引入作為參考)。將擴(kuò)增的片段克隆至pCR-BlimtIITQPO載體中(Invitrogen)，產(chǎn)生PCR-CE3E2。將CE3E2測序來確保在PCR擴(kuò)增過程中沒有引入錯誤。為了產(chǎn)生含有CE3E2結(jié)構(gòu)區(qū)的啟動子輔助的輔助子，用Spel限制酶來消化pCR-CE3E2DNA來釋放E3E2片段。然后將E3E2(SpeI)片段連接用Spel酶線性化的衣殼輔助子(13.2.2)來產(chǎn)生pHCE3E2。通過消化來自PHCE3E2的E3-E2編碼區(qū)來制備無啟動子E2輔助子(稱為dHE2_6Ml)。首先用AscI限制酶將pHCE3E2DNA質(zhì)粒線性化，然后用T4DNA聚合酶處理來形成平端。相似地，用SphI限制酶將dHgp6-mutlDNA質(zhì)粒線性化并用T4DNA聚合酶處理來形成平端。然后用Spel限制酶消化兩個線性化的、T4-聚合酶處理過的DNA，并將所得到的3.6kbdHgp6_mutl載體片段和1.4kbE3-E2片段各自凝膠純化。然后使用T4DNA連接酶將兩個純化的片段連接在一起，以產(chǎn)生dHE2-6Ml無啟動子輔助子。以幾個步驟來完成無啟動子E1輔助子的產(chǎn)生。設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增兩個結(jié)構(gòu)蛋白編碼片段1)衣殼-E3(CE3)，和2)6K-E1(6KE1)。將PCR產(chǎn)物克隆至pCR-BluntTOPO載體(Invitrogen)中，產(chǎn)生pCR_CE3和pCR_6KEl。將克隆測序以確保在擴(kuò)增過程中沒有引入錯誤。為了產(chǎn)生含有E1糖蛋白的E3和6K前導(dǎo)序列上游的盒，產(chǎn)生了另一個中間構(gòu)建體。通過用BamHI酶消化PCR_6KE1DNA并純化6KE1片段來完成這。然后將6KE1(BamHI)片段連接用BamHI酶線性化的pCR_CE3DNA，產(chǎn)生pCR_CE36KEl。為了產(chǎn)生含有CE36KE1盒的啟動子輔助的輔助子，用Spel和SphI酶消化PCR-CE36KE1DNA，釋放結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列盒。然后將CE36KE1(Spel/SphI)片段連接用Spel和SphI線性化的衣殼輔助子(13.2.2)來產(chǎn)生PHCE36KE1。通過從pHCE36KEl質(zhì)粒消化E3-6K-E1編碼區(qū)來完成無啟動子E1輔助子(稱為dHEl-6Ml)的產(chǎn)生。用Spel和SphI限制酶消化pHCE36KEl和dHgp6_mutl，并將得到的3.6kbdHgp6-mutl載體片段和1.7kbE3-6K-E1片段凝膠純化。然后使用T4DNA連接酶將兩個純化的片段連接在一起，以產(chǎn)生dHEl-6Ml無啟動子輔助子。B.切割糖蛋白無啟動子輔助子的分析將單個的糖蛋白輔助子在體外轉(zhuǎn)錄，并在連同VEE復(fù)制子RNA電穿孔至Vero細(xì)胞中之前，將RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化。通過Northern印跡分析輔助子復(fù)制，并使用E1和E2糖蛋白特異性抗體通過IFA分析蛋白表達(dá)。Northern結(jié)果表明dHEl_6Ml和dHE2_6Ml輔助子都有效復(fù)制了。代表性的Northern印跡顯示于圖3中。為了測定兩個單獨(dú)的糖蛋白-表達(dá)無啟動子輔助子是否可以結(jié)合A26S衣殼輔助子來包裝復(fù)制子RNA，以產(chǎn)生VRP。將三個輔助子結(jié)合表達(dá)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A片段的VEE復(fù)制子RNA并電穿孔至Vero細(xì)胞中。來自一個試驗(yàn)的VRP產(chǎn)量顯示于表7中。實(shí)施例7.修飾的5’和3’端無啟動子輔助盒A.修飾的5’端輔助盒的構(gòu)建在大部分a病毒的RNA的5’端(頭250nt)的預(yù)測二級結(jié)構(gòu)含有四個莖環(huán)(SL)結(jié)構(gòu)(SL1、SL2、SL3和SL4)。Frolov等(RNA,71638-1651(2001))證明了從辛德畢斯病毒輔助RNA除去編碼SL2的核苷酸序列提高了該輔助子的復(fù)制。如下通過PCR從dHcap6-mutl除去VEE5，端的SL2區(qū)(基于M-折疊程序)，nt46至ntll6，包括端點(diǎn)。從dHcap6-mutlDNA擴(kuò)增兩個片段。使用引物13-82.1.9[SEQIDNO.83]和dLS2(EcoRV)R[SEQIDN0.84](表8)來擴(kuò)增含有dHcap6_mutl5，端的45個核苷酸和編碼主鏈質(zhì)粒序列的核苷酸的大約1千堿基對(kb)的5’片段。使用引物dSL2(EcoRV)F[SEQIDNO.85]和3_8.pr4[SEQIDNO.86]來擴(kuò)增含有開始于核苷酸117的VEE5’端部分和編碼直至VEE3’端的完整衣殼序列的核苷酸的大約1.5kb的3’片段。用XhoI和EcoRV限制酶消化5，IkbPCR片段。用EcoRV和NotI限制酶消化3，1.5kbPCR片段。通過用XhoI和NotI消化將質(zhì)粒dHgp6-mutl線性化，并純化所得到的2.5Kb載體主鏈。為了產(chǎn)生其中刪除了SL2區(qū)的新輔助子，在此稱為“dHcap6-mut1(dSL2)”，將5，(XhoI/EcoRV)片段，3，(ECoRV/NotI)片段和XhoI/NotI線性化載體連接在一起。將具有在此作為SEQIDNO.51提供的5，端序列的dHCap6-mutl(dSL2)輔助子完整測序，以確保在PCR擴(kuò)增過程中沒有引入錯誤。為了產(chǎn)生相匹配的dHgp6-mutl(dSL2)輔助子，用XhoI和RsrII限制酶消化dHgp6-mutlDNA,并純化5.4kb片段。通過用XhoI和RsrII消化該DNA并純化1.Ikb片段來收集來自dHcap6-mutl(dSL2)的修飾5，端。將這兩個片段連接在一起來產(chǎn)生dHgp6-mutl(dSL2)，其具有和dHcap6_mutl(dSL2)相同的5，端[SEQIDN0.51]。B.縮短的3’端無啟動子輔助盒的構(gòu)建在這些實(shí)施例中，對于衣殼輔助構(gòu)建體dHcap(FL)，dHcapl至dHcap7，dHcap(FL)mm,dHcaplmmMdHcap7mm,dHcap(FL)mut1禾口dHcapImutl至dHcap7mutl,在此作為SEQIDNO.55提供了3’端序列。盡管本發(fā)明的VEE衣殼蛋白缺乏完整的糖蛋白編碼區(qū)，但在衣殼輔助子上保留了小部分的E3蛋白，以允許在包裝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生胰凝乳蛋白酶樣切割，來產(chǎn)生成熟的衣殼蛋白。對于糖蛋白輔助構(gòu)建體dHgp(FL)，dHgpl至dHgp7，dHgp(FL)mm,dHgplmm至dHgp7mm，dHgp(FL)mut1和dHgpImutl至dHgp7mutl，3，端序列是較短的序列，因?yàn)樵谔堑鞍纵o助構(gòu)建體中不需要用于產(chǎn)生成熟衣殼蛋白所需的含有切割位點(diǎn)的序列。在此作為SEQIDNO.56提供了這些實(shí)施例中用于這些糖蛋白構(gòu)建體的3’序列。此外，構(gòu)建了具有較短3’端長度的無啟動子RNA輔助子。通過降低α病毒3’端序列的含量，進(jìn)一步降低了產(chǎn)生可復(fù)制VEE病毒所需的第二次重組事件的理論可能性。最初，在以下兩個步驟中產(chǎn)生了具有功能性26S啟動子的糖蛋白的輔助子，該啟動子只含有包括α病毒高度保守的3’序列[SEQIDNO.52]的19個核苷酸。首先，產(chǎn)生了含有糖蛋白(GP)編碼序列盒的質(zhì)粒，該盒具有獨(dú)特的5’盒3’限制位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增具有獨(dú)特的SphI位點(diǎn)(“GP(SphI)R”，SEQIDNO.87，表8)和5，端的現(xiàn)有內(nèi)部SpeI位點(diǎn)(“3-16.1.3”，SEQIDNO.88，表8)的VEEGP，SphI位點(diǎn)就在3，端的El終止密碼子之后。擴(kuò)增的片段是克隆至pCR2.IDNA中的TA(Invitrogen,Carlsbad,CA)，產(chǎn)生pCR2.l/GP19nt5，。其次，設(shè)計(jì)正向引物來引入SphI位點(diǎn)，就在VEE3’端的19個核苷酸保守序列的上游(3’trunk(SphI)F，SEQIDNO.89，表8)。設(shè)計(jì)質(zhì)粒主鏈序列特異性的反向引物來擴(kuò)增將含有3’端獨(dú)特AflII限制位點(diǎn)的片段(3，trunc(AflIII)R,SEQIDNO.90，表8)。用SphI和AflII消化使用這些引物擴(kuò)增得到的片段，并連接成13.4.6糖蛋白輔助子(實(shí)施例1中所述的)，已經(jīng)用SphI和AflI限制酶將其線性化，因此導(dǎo)致pGP輔助子-intl的構(gòu)建。pGP輔助子-intl構(gòu)建體在GP終止密碼子和輔助子的3’端(包括19nt保守序列)之間具有72個核苷酸區(qū)。為了產(chǎn)生只具有19個核苷酸3，端的GP輔助子，用SpeI和SphI消化pCR2.1/GP19nt5'DNA，并將GP編碼序列連接至用SpeI和SphI限制酶消化的pGP輔助子-intl中。將所得到的構(gòu)建體命名為PGP輔助子19nt。然后將pGP輔助子19nt用于產(chǎn)生具有不同長度的3’復(fù)制識別序列的Δ26S輔助子。用NcoI和NotI限制酶消化pGP輔助子19nt構(gòu)建體，并將含有糖蛋白編碼序列的2515個堿基對片段進(jìn)行凝膠純化，該編碼序列具有19nt3’端片段。然后將該2515個堿基對(NcoI/NotI)片段連接至用NcoI和NotI限制酶消化的dHgp構(gòu)建體中，產(chǎn)生各種dHgp19nt構(gòu)建體。C.表達(dá)α病毒衣殼蛋白的修飾無啟動子輔助盒的構(gòu)建在VEE病毒感染的細(xì)胞中，VEE衣殼蛋白從結(jié)構(gòu)糖蛋白切割自身，結(jié)構(gòu)糖蛋白是從26S亞基因組mRNA翻譯的。盡管本發(fā)明的VEE衣殼輔助子缺乏完整的糖蛋白編碼區(qū)，但在衣殼輔助子上保留了一小部分Ε3蛋白，以允許在包裝細(xì)胞內(nèi)發(fā)生胰凝乳蛋白酶樣切割，來產(chǎn)生成熟的衣殼蛋白。在衣殼的3’端引入終止密碼子，替代胰凝乳蛋白酶樣切割位點(diǎn)，將提高使用糖蛋白輔助子產(chǎn)生功能性重組體的難度。即，對于使用本發(fā)明的dHgp輔助子來產(chǎn)生的功能性重組(即，產(chǎn)生可復(fù)制病毒)，重組事件必須是核苷酸完美的，以替代衣殼編碼序列中的工程化終止密碼子并維持活性衣殼切割位點(diǎn)。產(chǎn)生了兩種形式的在3’端結(jié)合了終止密碼子的dHcap輔助子。一種形式，dHcap6-mutl-dSL2(終止)，其具有在此作為SEQIDN0:57提供的3’序列，替代了具有終止密碼子的天然衣殼蛋白的C-端色氨酸殘基；另一種形式保留了C-端色氨酸殘基(dHcape-mutl(W-終止)，其具有在此作為SEQDINO59提供的3’序列)并就在色氨酸殘基的下游插入了終止密碼子。使用引物來擴(kuò)增衣殼編碼序列，設(shè)計(jì)該引物，以在5’端工程化獨(dú)特的RsrII位點(diǎn)(衣殼(RsrII-Kozak)F,SEQIDN0:91，表8)和3，端獨(dú)特的SphI位點(diǎn)(衣殼(終止)SphIR，SEQIDNO:92或衣殼(W-終止)SphIR,SEQIDN0:93，表8)。還將正向引物工程化，以在近-最佳Kozak共有序列中放置衣殼起始密碼子(Kozak，Cell,44(2):283_292(1986))，以增強(qiáng)衣殼mRNA翻譯的核糖體啟動。用RsrII和SphI限制酶消化擴(kuò)增的衣殼編碼序列，并連接至用RsrII和SphI線性化的Δ26S輔助質(zhì)粒中，以產(chǎn)生dHcap6-mutl-dSL2(終止)和dHcap6_mutl(W-終止)構(gòu)建體。D.表達(dá)α病毒糖蛋白的修飾啟動子輔助盒的構(gòu)建VEE衣殼蛋白是在衣殼C-端色氨酸殘基之后切割的胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶?；谝饶榈鞍酌傅那懈钐禺愋?，預(yù)期可以容許就在色氨酸下游位置中的所有氨基酸殘基，除了甲硫氨酸和脯氨酸。預(yù)期就在色氨酸下游的這些氨基酸在很大程度上降低胰凝乳蛋白酶切割活性。在天然VEE病毒中，存在包括VEEΕ3信號序列的18個氨基酸。設(shè)計(jì)構(gòu)建體來減少Ε3信號序列中的氨基酸數(shù)量，同時維持Ε3序列的信號功能。因?yàn)轭A(yù)期可以在衣殼C-端色氨酸的下游位置中容許包含Ε3序列的18個氨基酸中的16個，如果在重建VEE結(jié)構(gòu)糖蛋白編碼序列的核苷酸完美重組事件發(fā)生時，將它們就放置在C-端色氨酸的下游，降低Ε3信號序列中的氨基酸數(shù)量將降低作為切割位點(diǎn)功能性的位點(diǎn)數(shù)量。作為這種方法的實(shí)例，通過PCR除去正常存在于Ε3信號序列中的N-端絲氨酸殘基，留下亮氨酸殘基作為N-端殘基，并且構(gòu)建dHgp無啟動子輔助子來確定這樣的修飾gp輔助子是否能起作用來包裝VRP。設(shè)計(jì)正向PCR引物(Gp(RsrII-Ser)F，SEQIDNO94)來除去E3的N-端絲氨酸殘基并維持獨(dú)特的RsrII限制位點(diǎn)(表8)。設(shè)計(jì)反向引物(3-16.2.14，SEQIDNO:95)來擴(kuò)增將含有獨(dú)特的SnaBI限制位點(diǎn)的gp片段(表8)。用RsrII和SnaBI消化所得到的gpPCR片段并連接質(zhì)RsrII和SnaBI消化的dHgp6_mutlDNA中，產(chǎn)生dHgp6_mutl(-S)。Ε.使用5，和3，修飾的Δ26S啟動子進(jìn)行VRP產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)還制備了含有上述修飾組合的輔助子。在VRP產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)中分析dHcap和dHgp無啟動子輔助子的不同組合和RNA濃度，以測定它們怎樣有效地包裝VEE復(fù)制子RNA(表達(dá)肉毒桿菌神經(jīng)毒素片段A或流感HA的)。此外，對輔助子組合的子集分析了A26S輔助子加帽對VRP產(chǎn)量的作用。使用Δ26S輔助子不同組合的VRP產(chǎn)量的代表性實(shí)例顯示于表9-13中。通過連續(xù)稀釋VRP并用Vero細(xì)胞在37°C和5%CO2下培養(yǎng)過夜，在48-孔平板中在Vero細(xì)胞單層培養(yǎng)物中進(jìn)行了定量VRP感染性和產(chǎn)量的效能測定。過夜培養(yǎng)后(18-20小時)，將細(xì)胞洗滌，固定，并用抗原特異性一抗接著FITC綴合的二抗將固定的單層染色。通過紫外線熒光顯微鏡(NikonEclipseTE300)檢測含有FITC標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞。將單個的抗原陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)并從已知的稀釋和接種體積來計(jì)算表示為IU/mL的滴定度。實(shí)施例8.結(jié)合泛素單體的無啟動子輔助子A.含有泛素單體的Δ26S輔助子的構(gòu)建在真核細(xì)胞中，通過細(xì)胞泛素羧基端水解酶(UCH)就在其C-端甘氨酸之后切割用泛素融合或標(biāo)記的蛋白質(zhì)(Pickart和Rose,J.Biol.Chem260:7903_7910(1985))。就在衣殼和糖蛋白編碼序列上游符合閱讀框地放置泛素編碼序列的單體將消除使用本發(fā)明的特定無啟動子輔助構(gòu)建體產(chǎn)生的融合蛋白(這樣的融合體是由用于每個結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列的ATG上游多個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)引起的)。消除發(fā)生是因?yàn)樗锌騼?nèi)融合蛋白將包括泛素單體，并因此它們可以通過UCH來切割，由此釋放沒有任何上游、外源蛋白序列的全長VEE結(jié)構(gòu)蛋白。設(shè)計(jì)引物泛素F(SEQIDNO96)和泛素R(SEQIDNO97)(表14)，以在擴(kuò)增的泛素單體編碼序列的5’和3’端引入RsrII位點(diǎn)，同時保持泛素單體通過UCH切割需要的Arg-Gly-Gly序列(圖4)。這些特定的構(gòu)建體在切割后在每個所得到的結(jié)構(gòu)蛋白上形成了天然結(jié)構(gòu)蛋白上不存在的其他N-端氨基酸殘基(S卩，對于衣殼輔助子，為額外的脯氨酸；對于糖蛋白輔助子，為額外的脯氨酸和蘇氨酸)(圖4)。使用PfuTaq聚合酶(Stratagene)將泛素編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并克隆至dHcap(FL)和dHgp(FL)獨(dú)特的RsrII位點(diǎn)中。篩選轉(zhuǎn)化體以測定泛素插入片段的方向。分離各自稱為dHcapU和dHgpU的用于衣殼和糖蛋白的陽性泛素克隆(各自具有在此作為SEQIDNO.53和54提供的5’端序列)，并測序來證實(shí)沒有將錯誤引入擴(kuò)增的泛素編碼序列中。在分開的反應(yīng)中使用RiboMaxExpressRNA試劑盒從dHcapU、dHgpU、dHcap(FL)、dHgp(FL)、Hcap4和13.4.6質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄用于電穿孔的RNA并用氯化鋰沉淀。B.使用泛素修飾的Δ26S輔助子的VRP產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)用表達(dá)HIV分化體C糖蛋白的VEE復(fù)制子RAN(“DU151gpl60”)將Vero細(xì)胞電穿孔并在所示RNA含量下選擇無啟動子衣殼和GP輔助子的組合。在一些實(shí)施方案中，使用了“Hcap4”衣殼輔助子。這是具有截短5’端(對應(yīng)于上述的dHcap4截短)但保留26S亞基因組啟動子序列的輔助子，并且在U.S.專利No.7，045，335中有充分描述，在此將其引入作為參考。在大約0.8ml的體積中，在0.4cm比色皿中，在500V、25μF、4個脈沖下進(jìn)行電穿孔。將每個電穿孔接種于含有IOOmlOptipro(Gibco，Carlsbad,CA)的l_850cm2轉(zhuǎn)瓶中。在18hr時在0.2μm濾器上收集VRP，使用25ml的0.5MNaCl洗滌。用1400的抗-gpl20山羊抗體(其識別HIVgpl60蛋白)滴定VRP鹽洗物質(zhì)。包裝實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于表15中。隨后進(jìn)行電穿孔來比較用衣殼輔助子dHcapU或dHCap6-mutl(W-終止)結(jié)合dHgp6-mutl包裝的各種核酸的滴定度。使用VEEnsP2特異性多克隆抗體來滴定VRP(表16)。C.通過Western分析電穿孔細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)從表16中概括的包裝研究中用于產(chǎn)生VRP的細(xì)胞制得細(xì)胞裂解物。在半干轉(zhuǎn)移至PVDF(PVDF在IX轉(zhuǎn)移緩沖液中400mA下40min)之前，將來自每個樣品的細(xì)胞裂解物在200V、400mA下在IXMPOS中在4-12%Bis-TrisNovex凝膠中電穿孔45min。將膜在IXBMB阻斷/TBS中阻斷過夜。一抗為1A4A抗-VEEGP的1500稀釋和抗-VEE衣殼的11500稀釋，稀釋于IXBMB阻斷/TBS中。Western印跡結(jié)構(gòu)顯示于圖5中。將從dHgpU表達(dá)的糖蛋白加工成TE2和E2GP形式，比從dHgp(FL)表達(dá)的糖蛋白更完整。這通過沒有使用存在于dHgp(FL)中的泛素看到的融合蛋白模式的差別得到了證明(圖5，使用GP抗體在Western印跡上比較了泳道3和4)。將泛素置于dHcapU輔助子中的衣殼蛋白的N-端導(dǎo)致衣殼融合蛋白消失(圖5)和使用13.4.6糖蛋白輔助子包裝時gpl60滴定度高于2個對數(shù)的增加(表15)。D.通過Northern分析電穿孔細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白RNA表達(dá)從表15中概括的包裝研究中用于產(chǎn)生VRP的細(xì)胞提取總細(xì)胞RNA。用RNAwiz試劑(Ambion，Inc.,Austin，TX)裂解細(xì)胞，用氯仿提取，沉淀并接受使用衣殼和GP特異性探針的Northern分析(各自為圖6和圖7)。所有RNA物質(zhì)與從各種構(gòu)建體預(yù)期的大小一致。實(shí)施例9.使用加帽和未加帽的Δ26S輔助構(gòu)建體的VRP產(chǎn)生Α.表達(dá)各種α病毒的糖蛋白的VRP使用表達(dá)作為目標(biāo)核酸(NOI)的VEE(3022)、東方馬腦炎病毒(EEE)(4200)或西方馬腦炎病毒(WEE)(2100)的糖蛋白編碼序列的VEE復(fù)制子來產(chǎn)生VRP，其中已經(jīng)刪除了每個furin切割位點(diǎn)。用NotI將編碼用于產(chǎn)生VRP的輔助子的DNA質(zhì)粒線性化，并按照制造商的說明使用T7RiboMax試劑盒(Pr0mega，MadiS0n，WI)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，并且按照其中所示的，補(bǔ)充7.5mMCAP類似物(Promega)。在表17中，將使用帽類似物產(chǎn)生的輔助子表示為“+帽”，沒有使用帽類似物的那些表示為“_帽”。按照以上實(shí)施例5中所述的，用復(fù)制子、衣殼輔助子和GP輔助子RNA的組合將Vero細(xì)胞電穿孔并產(chǎn)生VRP。三個分開實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于表17-19中。B.表達(dá)流感株Wisconsin的HA編碼序列的VRP在該實(shí)驗(yàn)中，在用于產(chǎn)生編碼VEE衣殼或VEE糖蛋白的Δ26S輔助子RNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，Cap類似物與GTP的摩爾比是不同的。如下裝配轉(zhuǎn)錄反應(yīng)Promega5X轉(zhuǎn)錄緩沖液；rNTP混合物(6mMUTP、CTP、ATP)；GTP(0-6mM,如表中所示)；(PromegaCorporationWoodsHollowRd.，MadisionWI,目錄#Ρ1300)和Ribom7GCap類似物(6mM)(PromegaCorporationWoodsHolloffRd.，MadisionWI，目錄#P1712)。使用Promega的5X緩沖液和7.5mMrNTP進(jìn)行其他反應(yīng)，使用或未使用7.5mRibom7GCap類似物來模擬制造商指定的T7RiboMAXExpressRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒條件(PromegaCorporationWoodsHolloffRd.，MadisionWI,目錄#P1320)，其通常使用試劑盒中提供的2X緩沖液來運(yùn)行。該實(shí)驗(yàn)中包裝的VEE復(fù)制子編碼流感HA(A/WI/05)蛋白。將30μg復(fù)制子RNA；10μgΔ26S衣殼輔助子RNA和60μgA26S糖蛋白輔助子RNA用于每次電穿孔。將Vero細(xì)胞擴(kuò)大，然后洗滌并重懸浮于蔗糖緩沖液中至1.2XIO8細(xì)胞/mL。將這些細(xì)胞與RNA混合，然后用設(shè)定為500伏特、25μFd和四個脈沖的BioRadGenePulseII裝置電穿孔。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有l(wèi)OOmLOptiPlO的轉(zhuǎn)瓶中，并在37°C下培養(yǎng)。電穿孔后二十四小時，收集VRP。在Vero的48-孔平板上滴定VRP，結(jié)果顯示于表25中。實(shí)施例10.使用由A26S輔助構(gòu)建體制得的VRP對抗小鼠中肉毒桿菌神經(jīng)毒素的保護(hù)將表達(dá)肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A或B的重鏈的非毒性C-端片段的VEE復(fù)制子載體(各自為BoNTA或BoNTB)包裝至VRP中，使用(i)30yg未加帽的13.2.2和13.4.6輔助子或(ii)20yg加帽衣殼Δ26S輔助子和60μg加帽糖蛋白Δ26S輔助子，如實(shí)施例5中所述的。在第O天和第28天，使用IXIO7IU劑量的這些VRP來接種Swiss小鼠。在第二次免疫后一個月，用殺滅50%動物需要的BoNTA或BoNTB神經(jīng)毒素劑量1000倍的劑量(IOOOLD50)來激發(fā)小鼠。激發(fā)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果概括于表20中。實(shí)施例11.使用表達(dá)來自天花病毒的抗原的VRP的免疫原性和保護(hù)研究A.使用Δ26S輔助構(gòu)建體產(chǎn)生的VRP在小鼠和靈長類動物中的免疫原性使用Kamrud等所述的方法(Virology360(2):376_87(2007))，構(gòu)建優(yōu)化來表達(dá)四個牛痘病毒(VACV)基因(L1R、B5R、A27L和A33R)的VEE復(fù)制子載體。將這四個VACV基因總稱為“4ρ0χ”。將4pox基因克隆至兩個不同的VEE復(fù)制子載體系統(tǒng)中，一個基于VEE的3014株，而另一個基于TC-83疫苗株。使用每個優(yōu)化的VACV編碼序列-表達(dá)復(fù)制子載體來產(chǎn)生VRP，通過將30μg復(fù)制子、20μgΔ26S衣殼輔助RNA和60μgΔ26SGP輔助RNA混合，并將它們電穿孔至Vero細(xì)胞中。按照實(shí)施例5中所述的產(chǎn)生顆粒并收集。然后將單獨(dú)的VACVVRP混合，產(chǎn)生用于免疫BALB/c小鼠或獼猴的4poxVRP混合物，并通過VACV抗原特異性ELISA分析來測量體液應(yīng)答。接種小鼠中檢測的VACV-特異性ELISA應(yīng)答顯示于表21中，而接種獼猴中檢測的VACV-特異性ELISA應(yīng)答顯示于表22中。B.小鼠中和非人靈長類動物中使用4poxVRP的保護(hù)1.小鼠通過鼻內(nèi)途徑使用2XIO6PFU牛痘病毒(IHD-J株)來激發(fā)小鼠，并且將結(jié)果呈現(xiàn)于表23中。2.非人靈長類動物通過靜脈內(nèi)途徑使用5XIO6PFU的猴痘病毒來激發(fā)非人靈長類動物。使用世衛(wèi)組織的損傷數(shù)量評分系統(tǒng)來確定疾病嚴(yán)重程度，并且將結(jié)果呈現(xiàn)于表24中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，對于所要求發(fā)明的每個方面存在幾個實(shí)施方案和要素，并且在此將不同要素的所有組合結(jié)合為本發(fā)明的實(shí)施方案，因此沒有將在此例舉的特定組合解釋為所要求的本發(fā)明范圍的限制。如果將特定的要素在組合中可用要素組中除去或添加進(jìn)去，那么認(rèn)為該要素組已經(jīng)結(jié)合了這樣的變化。在此引用的參考文獻(xiàn)，包括非專利出版物，專利申請和專利，在此將其全部引入作為參考，至如同在此單獨(dú)和特意指出引入作為參考并全部重現(xiàn)的程度。表1.產(chǎn)生A26S輔助子的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表2.dHcapl-8輔助子的IFA分析<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表4.產(chǎn)生mutl輔助子的定點(diǎn)誘變引物<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>BoNTA復(fù)制子<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表7.使用Δ26S衣殼、El和Ε2輔助子產(chǎn)生的VRP產(chǎn)量pERK/342/MS/BoNTA[30yg]<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表8.用于設(shè)計(jì)Δ26S輔助子的5’和3’區(qū)修飾的PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表9.復(fù)制子包裝的pERK/342/MS/BoNTΑ[30μgRNA]<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表10.復(fù)制子包裝的pERK/342/MS/BoNTA[30μgRNA]<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表IL復(fù)制子包裝的pERK/342/MS/BoNTA[30μgRNA]衣殼復(fù)制子[RNA]GP復(fù)制子[RNA]VRP滴定度IFU/mldHcap7-mutl[20yg]dHgp7_mutl[90μg]4.9XIO7dHcap7-mutll9nt[30yg]dHgP7_mutl[90μg]2.2XIO7表12.復(fù)制子包裝的pERK/342/MS/BoNTA[30μgRNA]<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表13pERK/383/MS/HA(AWyoming)[30μgRNA]<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表14<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表19.<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表20.接種使用Δ26S輔助子產(chǎn)生的VRP的小鼠的激發(fā)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>NA不適用1在復(fù)制子中含有表達(dá)無關(guān)蛋白的編碼序列表21.<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表22.<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表23.小鼠中的保護(hù)研究<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表24.獼猴中的保護(hù)研究<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>INTC=太多以致難以計(jì)數(shù)表25.A26S輔助子的加帽對編碼來自流感Wisconsin株的HA編碼序列的a病毒輔助子載體的包裝的作用的研究<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>權(quán)利要求分離的RNA分子，其包括a)α病毒5’復(fù)制識別序列，其中從所述5’復(fù)制識別序列中去除了至少一個起始密碼子；b)編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列；和c)α病毒3’復(fù)制識別序列，條件是所述RNA分子不含有指導(dǎo)(b)的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子，并且其中(a)和(c)的α病毒5’和3’復(fù)制識別序列指導(dǎo)整個RNA分子在α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的存在下復(fù)制。2.權(quán)利要求1的RNA分子，其中編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列選自編碼下列的核苷酸序列1)α病毒衣殼蛋白，2)以任意次序的α病毒El和Ε2蛋白，3)以任意次序的α病毒衣殼蛋白和α病毒El蛋白，5)以任意次序的α病毒衣殼蛋白和α病毒Ε2蛋白，6)α病毒Ε2蛋白和7)α病毒El蛋白。3.權(quán)利要求1的RNA分子，其中α病毒5’復(fù)制識別序列是委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的5’復(fù)制識別序列。4.權(quán)利要求3的RNA分子，其中5’復(fù)制識別序列的長度是70至524個核苷酸。5.權(quán)利要求1或權(quán)利要求3的RNA分子，其中α病毒3’復(fù)制識別序列是委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的3’復(fù)制識別序列。6.權(quán)利要求1的RNA分子，其中3’復(fù)制識別序列的長度是19至325個核苷酸。7.權(quán)利要求1的RNA分子，其中至少一個起始密碼子是用于非結(jié)構(gòu)蛋白l(nspl)的起始密碼子。8.權(quán)利要求1的RNA分子，其中從5’復(fù)制識別序列中除去了所有起始密碼子。9.權(quán)利要求1的RNA分子，其中將RNA在5’端加帽。10.制備α病毒復(fù)制子顆粒的方法，其包括將一個或更多個權(quán)利要求1的RNA分子引入細(xì)胞中，由此RNA分子的組合連同α病毒復(fù)制子RNA—起，在由此產(chǎn)生α病毒復(fù)制子顆粒的條件下，編碼產(chǎn)生α病毒復(fù)制子顆粒需要的所有α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。11.權(quán)利要求10的方法，其中將兩個RNA分子引入細(xì)胞中，其中兩個RNA中的第一個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，兩個RNA分子中的第二個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，其中至少一個不同于由第一個RNA分子編碼的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。12.權(quán)利要求10的方法，其中將三個RNA分子引入細(xì)胞中，其中三個RNA分子中的第一個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，三個RNA分子中的第二個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，其中至少一個不同于由第一個RNA分子編碼的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并且第三個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，其中至少一個不同于由第一個RNA分子和第二個RNA分子編碼的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。13.權(quán)利要求10的方法，其中將一個或更多個RNA分子中的至少一個在5’端加帽。14.制備α病毒復(fù)制子顆粒的方法，其包括將下列引入細(xì)胞中a)α病毒復(fù)制子RNA；b)一個或更多個權(quán)利要求1的RNA分子；和c)一個或更多個啟動子輔助的α病毒輔助構(gòu)建體，由此(b)的RNA分子和(c)的輔助構(gòu)建體的組合在由此產(chǎn)生α病毒復(fù)制子顆粒的條件下編碼產(chǎn)生α病毒復(fù)制子顆粒需要的所有α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。15.權(quán)利要求14的方法，其中將一個或更多個RNA分子中的至少一個在5’端加帽。16.α病毒復(fù)制子顆粒群，其包括含有權(quán)利要求1的RNA分子的顆粒子集，其中該群在每IO8個α病毒復(fù)制子顆粒中不含有可檢測的可復(fù)制α病毒病毒顆粒，如通過在培養(yǎng)物中的允許細(xì)胞上的傳代所測定的。17.α病毒復(fù)制子顆粒群，其包括含有權(quán)利要求1的RNA分子的顆粒子集，其中該群在每IO8個α病毒復(fù)制子顆粒中不含有可檢測的可復(fù)制α病毒病毒顆粒，如通過在培養(yǎng)物中的允許細(xì)胞上的傳代所測定的，其中α病毒復(fù)制子顆粒在α病毒結(jié)構(gòu)蛋白或α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白或α病毒結(jié)構(gòu)蛋白和α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白兩者中包含一個或更多個減毒突變。18.組合物，其在藥物學(xué)上可接受的載體中含有權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的群。19.誘導(dǎo)對象中免疫應(yīng)答的方法，其包括為對象給藥有效量的權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的群。20.細(xì)胞，其含有權(quán)利要求1的RNA分子。21.載體，其含有權(quán)利要求1的RNA分子。22.核酸構(gòu)建體，其含有權(quán)利要求1的RNA分子。23.細(xì)胞，其含有權(quán)利要求21的載體。24.細(xì)胞，其含有權(quán)利要求22的核酸構(gòu)建體。全文摘要本發(fā)明提供了一種分離的RNA分子，其包括a)α病毒5’復(fù)制識別序列，其中從5’復(fù)制識別序列中去除了至少一個起始密碼子；b)編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列；和c)α病毒3’復(fù)制識別序列，條件是RNA分子不含有指導(dǎo)(b)的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子，并且其中(a)和(c)的α病毒5’和3’復(fù)制識別序列指導(dǎo)整個RNA分子在α病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的存在下復(fù)制。文檔編號C07K14/705GK101802199SQ200880103660公開日2010年8月11日申請日期2008年6月20日優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日發(fā)明者J·F·史密斯,K·I·卡姆魯?shù)?M·莫漢申請人:阿爾法瓦克斯公司