專利名稱：Sars冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)rf3及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的結(jié)構(gòu)蛋白及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及一種新的SARS病毒結(jié)構(gòu)蛋白ORF3及其片段，以及抗ORF3蛋白或其片段的抗體。
背景技術(shù)：
WHO于2003年3月12日向全球發(fā)出了近10年來的首次傳染病預(yù)警，該曾一度被稱為非典型肺炎(atypical pneumonia)的傳染病自2002年11月中旬首次在中國廣東境內(nèi)發(fā)現(xiàn)，它起病急，傳染力強(qiáng)，抗生素治療無效，截至5月10日18時，全世界已有33個國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病，累計患病人數(shù)7296人，死亡人數(shù)526人，死亡率達(dá)3-6％。
2003年4月16日世界衛(wèi)生組織正式確認(rèn)引起嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，以下簡稱SARS)的病原體為一種新型冠狀病毒-SARS冠狀病毒(以下簡稱SARS-CoV)。它是一種正鏈、單鏈RNA病毒(ssRNA positive-strand viruses，no DNA stage)，屬套病毒目(orderNidovirales)、冠狀病毒科(family Coronaviridae)、冠狀病毒屬(genusCoronavirus)、SARS冠狀病毒(SARS coronavirus)。
電鏡下，冠狀病毒顆粒呈不規(guī)則形，直徑約為60-220nm，有包膜，包膜上具有糖蛋白，其中一種長的包膜糖蛋白突起長度約為20nm，包膜內(nèi)含有核衣殼。通常將包裝到病毒顆粒中的病毒表達(dá)蛋白稱為結(jié)構(gòu)蛋白，但是有些非結(jié)構(gòu)蛋白也能夠插到病毒包膜中。一般認(rèn)為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)與病毒顆粒的形成與釋放、以及宿主細(xì)胞的識別、宿主的感染和致病有關(guān)(S.G..Siddell，Ed.，TheCoronaviridae Plenum Press New York，1995)。序列分析表明SARS-CoV與已知冠狀病毒一樣同樣存在結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)制酶(replicase)、S蛋白(spikeprotein)、E蛋白(envelope protein)、M蛋白(membrane protein)、N蛋白(nucleocapsid protein)，這些結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列在結(jié)構(gòu)和功能上與已知冠狀病毒相似。其中SARS-CoV的E、M、N蛋白所包含的保守基因序列同樣存在于其他冠狀病毒中；S蛋白是冠狀病毒的糖蛋白，位于病毒表面，負(fù)責(zé)參與受體細(xì)胞的受體結(jié)合以及膜融合，S蛋白的羧基末端由跨膜域和富含半胱氨酸殘基的胞質(zhì)尾區(qū)組成。S蛋白上還包含了重要的病毒中和表位，但是，由于SARS-CoY的S蛋白與其他冠狀病毒S蛋白間的氨基酸序列差異，目前還不能夠從中推知SARS-CoV的S蛋白的受體結(jié)合特異性或抗原表位的結(jié)構(gòu)特征(Paul A.Rota et al’Characterization of a Novel CoronavirusAssociated with Severe Acute Respeiratory Syndrome’Sciencexpress/1May 2003)。由于S基因的變異，其宿主范圍、組織趨向及毒力都可能發(fā)生改變，因此，對于S蛋白及其共價復(fù)合物的研究將有助于理解S蛋白如何影響SARS的發(fā)病機(jī)制以及相關(guān)藥物的開發(fā)研制。
加拿大多倫多基因組科學(xué)中心的研究小組于4月12日在網(wǎng)上發(fā)布了病毒全序列，SARS-CoV全基因組序列長約30kb，具有5’帽結(jié)構(gòu)和3’polyA尾(Marco A.Marra et al’The Genome Sequence of the SARS-AssociatedCoronavirus’Sciencexpress/1May 2003)，來自加拿大的SARS-CoV分離株預(yù)測有14個開放閱讀框(Rota PA，Oberste MS，The Genome sequence of theSARS-associated coronavirus.Science.2003 May 30；300(5624)1399-404.)。已知的結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)制酶、S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白的編碼序列分別位于ORF1a和ORF1b、ORF2、ORF5、ORF6、ORF12(Rota PA，Oberste MS，The Genomesequence of the SARS-associated coronavirus.Science.2003 May30；300(5624)1399-404.)。一般說來，RNA病毒具有高遺傳突變率的特征，這既是進(jìn)化的需要也是RNA病毒用于逃避宿主防御的有效機(jī)制(Yijun Ruan etal)?；蛐蛄蟹治霰砻鱏ARS-CoV的基因組序列與已知的三種冠狀病毒亞群序列截然不同，極有可能是獨(dú)立進(jìn)化而來，所以將其歸為冠狀病毒的一個新的分支。取自不同來源的14株SARS-CoV基因組序列比較結(jié)果顯示總共有127個單核苷酸變異，其中94個改變了氨基酸殘基(Yi jun Ruan et al)，但是這些差異對于SARS-CoV本身進(jìn)化的意義以及對于不同株型是否在被感染的宿主個體間存在的各種差異上起到關(guān)鍵性的作用，目前還不可知。
現(xiàn)有SARS檢測手段有3種，包括采用抗體檢測的方法ELISA(IGM/IGA)方法可以可靠地檢出出現(xiàn)臨床癥狀20天后SARS病人血清中的病毒抗體。某些病人在14-21天時，已經(jīng)可以檢測到抗體；采用免疫熒光法檢測可以檢測出病毒感染VERO細(xì)胞10天后產(chǎn)生的M免疫球蛋白；采用分子檢測方法已經(jīng)發(fā)展了7對引物使用于檢測過程中，檢測中的陽性對照RNA可以從Bernhard-NochtInstitute in Hamburg，Germany免費(fèi)獲得。檢測樣品包括血液、糞便、呼吸道分泌物。PCR結(jié)果可以輔助臨床診斷評價，但是不能肯定或排除疾病的可能；細(xì)胞培養(yǎng)方法利用VERO細(xì)胞來檢測SARS病人的呼吸道分泌物和血液樣品，陽性結(jié)果表示SARS病人感染了冠狀病毒，陰性結(jié)果不表明病人不是SARS。但是這些檢測手段還不能及時有效的作為檢測診斷SARS的有效方法，一般都還需要結(jié)合臨床癥狀等輔助手段綜合判斷。
目前，有效控制乃至消滅SARS對于人類生命的危害已經(jīng)成為擺在全球科學(xué)家面前的重要課題。人們從發(fā)現(xiàn)病源到病原體的確認(rèn)到基因組測序、序列分析也只有短短幾個月的時間，盡管已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但目前人們對SARS冠狀病毒知之甚少。為了獲取更多有價值的線索，人們逐漸把更多的目光投向?qū)Σ《镜鞍椎姆蛛x、病毒蛋白的功能分析及其應(yīng)用的研究上，人們迫切需要通過更多的途徑尋找到更多的、有價值的SARS-CoV表達(dá)蛋白，進(jìn)一步了解它們在病毒復(fù)制、發(fā)病機(jī)理方面的作用，提供有效的SARS冠狀病毒的檢測方法和試劑，促進(jìn)SARS疫苗的研制和SARS新藥的開發(fā)。目前，除了結(jié)構(gòu)蛋白S、E、M、N被確認(rèn)之外，目前，除了上述開放閱讀框被確認(rèn)編碼SARS-CoV結(jié)構(gòu)基因之外，還沒有明確確認(rèn)其他SARS-CoV結(jié)構(gòu)基因并證實(shí)該結(jié)構(gòu)基因的功能和活性特征的報道，尤其是定位在病毒表面的其他蛋白。
由于臨床缺少有效SARS的治療藥物，所以現(xiàn)階段將感染病人迅速隔離治療是最有效的防治手段。為了開發(fā)SARS檢測方法和治療方法，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的SARS結(jié)構(gòu)蛋白以及相關(guān)的診斷方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的就是提供一種新的SARS結(jié)構(gòu)蛋白及其應(yīng)用。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO1氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且定位在SARS病毒顆粒上具有免疫原性，可與S蛋白形成了鏈間二硫鍵共價復(fù)合物的由(a)衍生的多肽。
在在另一優(yōu)選例中，該蛋白的分子量為31KD-34KD，它能夠在非還原膠上與S蛋白形成鏈間二硫鍵共價復(fù)合物。
較佳地，所述蛋白含有SEQ ID NO1的氨基酸序列。更佳地所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗體，所述的抗體特異性地與本發(fā)明上述的結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合。更佳地，所述的抗體是單克隆抗體。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種抗原性多肽，它具有SEQ ID NO1中連續(xù)的25-100氨基酸，且與本發(fā)明上述的特異性抗體特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選例中，所述多肽具有SEQ ID NO9的氨基酸序列。還提供了所述抗原性多肽的偶聯(lián)物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測試劑盒，它含有本發(fā)明上述的結(jié)構(gòu)蛋白、上述的抗體、上述的多肽、或其組合。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種體外檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體的方法，包括步驟(a)將樣品與選自下組的物質(zhì)接觸本發(fā)明上述的結(jié)構(gòu)蛋白、上述的抗體、上述的多肽、或其組合；(b)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表示樣品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的樣品為血清或痰液。
在另一優(yōu)選例中，所述的物質(zhì)是氨基酸序列為SEQ ID NO1的蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的物質(zhì)是權(quán)利要求2所述的抗體，且所述抗體是單克隆抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種組合物，含有本發(fā)明上述的結(jié)構(gòu)蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。


圖1感染病毒24小時的細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)電泳圖譜，第1泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為175kD，83kD，66kD，43kD，33kD，25kD，14kD和7kD。第2泳道為感染病毒24小時的細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)。
圖2ORF3蛋白質(zhì)N端7-19位肽段FFTLGSITAQPVK(SEQ ID NO3)的質(zhì)譜碎片圖。
圖3ORF3蛋白質(zhì)180-193位肽段LKEDYQIGGYSEDR(SEQ ID NO4)的質(zhì)譜碎片圖。
圖4ORF3蛋白質(zhì)C端236-274位肽段LVKDPPNVQIHTIDGSSGVANPAMDPIYDEPTTTTSVPL(SEQ ID NO5)的質(zhì)譜碎片圖。
圖5蛋白質(zhì)C端236-274位肽段LVKDPPNVQIHTIDGSSGVANPAM#DPIYDEPTTTTSVPL(SEQ ID NO6)的質(zhì)譜碎片圖。
其中M#為氧化的甲硫氨酸。
圖6A為ORF3蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，在病毒感染的細(xì)胞(第2道)和分泌到細(xì)胞外的病毒(第3道)中都檢測到ORF3蛋白，第1道以未感染病毒的細(xì)胞作為對照。B為S蛋白和ORF3蛋白的免疫印跡實(shí)驗(yàn)。左圖為S蛋白的免疫印跡實(shí)驗(yàn)，在還原膠上(第1道)，可在180KD檢測到S蛋白，而在非還原膠上(第2道)，可在180KD和210KD處同時檢測到S蛋白。右圖為ORF3蛋白的免疫印跡實(shí)驗(yàn)，在非還原膠210KD處也檢測到了ORF3蛋白(第2道)，說明ORF3蛋白與S蛋白確實(shí)形成了鏈間二硫鍵共價復(fù)合物。
圖7ORF3蛋白質(zhì)金標(biāo)免疫電鏡觀察和凝集反應(yīng)，ORF3蛋白質(zhì)在冠狀病毒表面呈陽性反應(yīng)，從而確認(rèn)ORF3蛋白質(zhì)定位在病毒表面，是一個結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。
圖8ORF3蛋白質(zhì)抗體在病人血清中的檢測，通過ELISA實(shí)驗(yàn)在病人血清中也檢測到ORF3蛋白質(zhì)抗體呈陽性反應(yīng)。A圖中采用SBP1多肽為檢測探針；B圖中采用SBP2多肽為檢測探針；C圖中采用S1多肽為檢測探針；D圖表示SBP2多肽和S1多肽對病人血清檢測反應(yīng)的相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過質(zhì)譜分析SARS病毒的天然蛋白質(zhì)，首次發(fā)現(xiàn)并分離了一種新的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。這個蛋白質(zhì)屬于ORF3(位于SARS冠狀病毒基因組S基因和E基因之間)的基因產(chǎn)物。ORF3蛋白質(zhì)也定位在病毒顆粒上，屬于一種結(jié)構(gòu)蛋白，它可能與識別宿主細(xì)胞和感染有關(guān)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種新的SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的分子量為31KD-34KD，它能夠在非還原膠上與S蛋白形成鏈間二硫鍵共價復(fù)合物。所述結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是指，包裝到病毒顆粒中的病毒表達(dá)蛋白，特別是指ORF3的基因產(chǎn)物，它具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列，該序列可以是通過基因工程技術(shù)而來也可以是人工合成而來。ORF3基因產(chǎn)物的分子量為31KD-34KD，暗示ORF3基因產(chǎn)物具有翻譯后的修飾或不同形式的亞型(詳見實(shí)施例3)。
由本發(fā)明所獲得的ORF3基因產(chǎn)物通過液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜鑒定，并由質(zhì)譜測序證實(shí)了該蛋白質(zhì)氨基酸序列(由SEQ ID NO1所示)。ORF3位于S和E基因之間，結(jié)構(gòu)分析表明，ORF3蛋白具有三個跨膜區(qū)，蛋白的N端1-22位在膜外，C端160個氨基酸在膜內(nèi)。C端209-264位還存在一個潛在的ATP酶活性位點(diǎn)。ORF3蛋白含有8個半胱氨酸，都位于C端的胞內(nèi)區(qū)。該蛋白的N端22位有一個潛在的糖基化位點(diǎn)。在該蛋白中N端11位在不同株中有突變，本實(shí)驗(yàn)也證明第11位氨基酸由R變?yōu)镚(詳見實(shí)施例2)。
通過進(jìn)一步抗體制備和免疫印跡實(shí)驗(yàn)、免疫電鏡實(shí)驗(yàn)、臨床血清ELISA實(shí)驗(yàn)(詳見實(shí)施例3、4、5)證實(shí)本發(fā)明ORF基因產(chǎn)物定位于病毒顆粒表面，是一個結(jié)構(gòu)蛋白，它能夠與S蛋白形成二硫鍵復(fù)合物，并且ORF3基因產(chǎn)物與S蛋白在功能上密切相關(guān)，從而可以與S蛋白共同介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)而完成對宿主的攻擊。
如本文所用，“結(jié)構(gòu)蛋白ORF3”或“ORF3蛋白”指具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽。該術(shù)語還包括將SEQ ID NO1氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且同樣定位在SARS病毒顆粒上具有免疫原性，或可與S蛋白形成鏈間二硫鍵共價復(fù)合物的由(a)衍生的多肽。
本發(fā)明還包括具有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列75％、85％、90％、95％同源性的且具有相同功能活性的序列，可使用歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)提供的Clustal計算機(jī)程序測定序列同源性。
本發(fā)明還包括SARS的ORF3蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然SARS的ORF3蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
本發(fā)明進(jìn)一步提供SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的抗原性部分或區(qū)段。所述“抗原性部分或區(qū)段”是指具有一定分子結(jié)構(gòu)的ORF3基因產(chǎn)物的片段，特別是具有SEQ ID NO9所示的抗原性部分或區(qū)段，當(dāng)該分子結(jié)構(gòu)以適當(dāng)形式存在時，它能在患病生物體內(nèi)對所屬的ORF3基因產(chǎn)物誘發(fā)免疫應(yīng)答。用于在已知氨基酸順序中測試這種有用的抗原表位的各種方法是已知的，根據(jù)這些序列，可以用實(shí)驗(yàn)方法測定這些表位，例如借助于WO8606487中的篩選技術(shù)。這些抗原性部分或區(qū)段同樣會誘導(dǎo)對SARS冠狀病毒的保護(hù)作用。因此，這些抗原的部分或區(qū)段也同樣都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“SARS的ORF3多肽”指具有SARS的ORF3蛋白活性的SEQ ID NO.1序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與SARS的ORF3蛋白相同功能的、SEQ ID NO1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括SARS的ORF3蛋白的活性片段和活性衍生物。
在本發(fā)明中，“ORF3蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO1的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表 1


本發(fā)明還涉及編碼ORF3的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO1的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO2所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
本發(fā)明的ORF3核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。所述載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒及其他載體形式。表達(dá)載體中的多核苷酸序列可以可操作地和表達(dá)控制序列連接，還包含用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)選的包含一個或多個選擇性標(biāo)記。所述宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌如大腸桿菌，真菌如酵母，昆蟲細(xì)胞如Sf9，動物細(xì)胞如CHO、COS等。通過本文的闡述，適當(dāng)?shù)妮d體、宿主細(xì)胞的選擇都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
本發(fā)明也涉及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是ORF3基因產(chǎn)物的方法?？梢杂帽绢I(lǐng)域熟知的方法將多核苷酸序列插入到載體中，載體可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染等方式進(jìn)入宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞經(jīng)過本領(lǐng)域所熟知的方法培養(yǎng)一段時間，用常規(guī)方法如物理或化學(xué)方法破碎宿主細(xì)胞，回收并純化培養(yǎng)物。
此外，本發(fā)明還提供了另一種分離并純化本發(fā)明的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是ORF3基因產(chǎn)物的方法。該方法包括培養(yǎng)SARS冠狀病毒，分離病毒蛋白并采用梯度分離膠分離病毒蛋白，切下31KD-34KD的條帶，進(jìn)行膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜鑒定。
本發(fā)明結(jié)構(gòu)蛋白ORF3或其片段可以直接用于檢測抗SARS的抗體，也可用于與BSA等分子量的蛋白偶聯(lián)，從而形成多肽偶聯(lián)物。通常，所述的偶聯(lián)物由ORF蛋白或片段、交聯(lián)劑、和BSA構(gòu)成，其中所述的交聯(lián)劑優(yōu)選戊二醛(當(dāng)與ORF3的N-端偶聯(lián)時)、EDAC(當(dāng)與ORF3的C-端偶聯(lián)時)。
本發(fā)明的ORF3蛋白或其偶聯(lián)物可用于免疫兔、鼠等動物，從而獲得抗本發(fā)明結(jié)構(gòu)蛋白ORF3的抗體(“本發(fā)明抗體”)。本發(fā)明抗體包括特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于SARS病毒、基因產(chǎn)物或片段。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段(如Fab’或(Fab)2片段)、抗體重鏈、抗體輕鏈、嵌合抗體、人源化抗體等。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的本發(fā)明結(jié)構(gòu)蛋白ORF3或偶聯(lián)物，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。對于單克隆抗體，可利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerl ing等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本發(fā)明的ORF3蛋白、免疫原性片段(短肽)、偶聯(lián)物和抗體都可用檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體，從而作為早期檢測SARS的有效指標(biāo)之一。
本發(fā)明還提供一種檢測試劑盒，它含有本發(fā)明的ORF3基因產(chǎn)物、免疫原性片段(短肽)、偶聯(lián)物和抗體，該檢測試劑盒可用于檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體，從而作為早期檢測SARS的有效指標(biāo)之一。
本發(fā)明還提供一種體外檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體的方法，包括(a)將樣品與本發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)蛋白特別是ORF3基因產(chǎn)物以及與本發(fā)明所述抗原性部分或區(qū)段、相應(yīng)抗體、包括多克隆抗體、單克隆抗體、以及多肽接觸；(b)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表示樣品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體，所述的樣品可以是血清或痰液。
本發(fā)明的ORF3蛋白、免疫原性片段和偶聯(lián)物還可用于制備治療性的藥物組合物或預(yù)防性的疫苗組合物。
因此，本發(fā)明還提供一種組合物，它含有本發(fā)明所述(a)安全有效量的本發(fā)明結(jié)構(gòu)蛋白ORF3、ORF3的免疫原性片段、偶聯(lián)物或其組合；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。本發(fā)明的組合物可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。以結(jié)構(gòu)蛋白ORF3計，其用量例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。此外，載體和配制方法的例子可以參見《Remington藥物科學(xué)》(Remington’sPhamaceutical Science)。
此外，本發(fā)明的ORF3基因產(chǎn)物可以用于開發(fā)ORF3基因產(chǎn)物的抑制劑和促進(jìn)劑以及抑制或促進(jìn)S蛋白在介導(dǎo)與受體細(xì)胞的受體結(jié)合以及膜融合方面作用的抑制劑和促進(jìn)劑。比如膜融合抑制劑能夠阻止病毒穿入宿主細(xì)胞。
本發(fā)明首次確認(rèn)并獲得ORF3基因產(chǎn)物與S蛋白結(jié)合的鏈間二硫鍵共價復(fù)合物；首次在病人血清中獲得ORF3的抗體，并與S蛋白質(zhì)抗體呈強(qiáng)相關(guān)性；首次通過基因工程技術(shù)獲得大規(guī)模的ORF3基因表達(dá)產(chǎn)物；首次通過蛋白分離純化方法獲得ORF3基因產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)蛋白ORF3的確定，以及功能的鑒定，功能和抗原決定簇蛋白的確定將有助于進(jìn)一步理解基因組序列的差別與病毒發(fā)病機(jī)理之間的關(guān)系以及有助于SARS檢測手段的改進(jìn)，新型疫苗、藥物的開發(fā)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 分離ORF3蛋白1、細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)提取非洲綠猴腎細(xì)胞株Vero-E6(購自ATCC)在添加了10％胎牛血清(FBS)，100U/ml青霉素(penicillin)，50μg/ml鏈霉素(streptomycin)的DMEM培養(yǎng)液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)中，于37攝氏度和5％CO2條件下培養(yǎng)。所有細(xì)胞培養(yǎng)用試劑購自GIBCO BRL公司。將含有SARS冠狀病毒株BJ-01(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)的原液(病毒的滴度為TCID50 106)用DMEM培養(yǎng)液(含2％胎牛血清)稀釋10倍，每1ml稀釋液感染107 Vero-E6細(xì)胞；感染1小時后除去病毒稀釋液，然后加入DMEM培養(yǎng)液(含2％胎牛血清)，于37攝氏度和5％CO2條件下培養(yǎng)。
將病毒液或感染病毒的細(xì)胞收集后，用100mM Tris，0.5％NP-40溶解收集細(xì)胞質(zhì)，煮沸10分鐘后保存。(以上工作均在生物安全3級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行)2、SDS-PAGE電泳膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解采用7.5-17％的梯度分離膠分離病毒蛋白。圖1為感染病毒24小時的細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)電泳圖譜。第1泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為175kD，83kD，66kD，43kD，33kD，25kD，14kD和7kD。第二泳道為從感染病毒24小時的細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)。第2泳道中的蛋白質(zhì)條帶經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，發(fā)現(xiàn)有SARS病毒的N蛋白存在，同時，在1，2和3條帶中，均發(fā)現(xiàn)有ORF3蛋白質(zhì)(見實(shí)施例2)。
將圖1中條帶1和條帶2切下，置于50％H2O-40％MeOH-10％HAc中漂洗脫色后，凍干。依次加入5mM二硫蘇糖醇和點(diǎn)20mM碘代乙酰胺還原和封閉半胱氨酸。膠條搗碎置于100mM NH4HCO3(pH 8.3)，加入TPCK-胰蛋白酶，37℃保溫24小時。酶解后，凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)經(jīng)0.1％TFA-60％ACN抽提2-3次后，凍干濃縮。
實(shí)施例2 液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)測定在Finnigan MAT LCQ離子阱質(zhì)譜儀上進(jìn)行，毛細(xì)管溫度，200℃；噴霧電壓，4.25kV；鞘氣流速，50；聯(lián)用的HPLC為Survey型，反相C18柱(Keystone公司產(chǎn)品)，50×1.0.18I.D.mm，流速2ul/min；洗脫液，A液，0.1％FA-H2O；B液，0.1％FA-ACN。MS/MS能量為35％。數(shù)據(jù)庫檢索采用Sequest自動檢索軟件進(jìn)行，檢索數(shù)據(jù)庫SARS病毒基因組數(shù)據(jù)庫。將條帶1，2，3分別用質(zhì)譜進(jìn)行酶解肽譜分析。圖2，3，4，5為肽段的質(zhì)譜圖。
根據(jù)檢測結(jié)果，并經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)條帶1，2，3中出現(xiàn)ORF3的基因產(chǎn)物，ORF3蛋白質(zhì)的氨基酸序列列于SEQ ID NO1。質(zhì)譜鑒定出的肽段為FFTLGSITAQPVK(SEQ ID NO3)、L KEDYQIGGYSEDR(SEQ ID NO4)、LVKDPPNVQIHTIDGSSGVANPAMD PIYDEPTTTT SVPL(SEQ ID NO5)，這些肽段的氨基酸覆蓋率占總蛋白質(zhì)的24.08％，并由質(zhì)譜測序確證了該蛋白質(zhì)的序列(SEQ ID NO1)是可靠的。
ORF3蛋白質(zhì)的氨基酸序列列于SEQ ID NO1。
MDLFMRFFTLGSITAQPVKI DNASPASTVHATATIPLQASLPFGWLVIGV50AFLAVFQSATKIIALNKRWQ LALYKGFQFICNLLLLFVTIYSHLLLVAAG100MEAQFLYLYALIYFLQCINA CRIIMRCWLCWKCKSKNPLLYDANYFVCWH150THNYDYCIPYNSVTDTIVVT EGDGISTPKLKEDYQIGGYSEDRHSGVKDY 200VVVHGYFTEVYYQLESTQIT TDTGIENATFFIFNKLVKDPPNVQIHTIDG250SSGVANPAMDPIYDEPTTTTSVPL274(SEQ ID NO1)ORF3編碼序列參見SEQ ID NO2。
實(shí)施例3抗體制備和免疫印跡實(shí)驗(yàn)在多肽合成儀上，通過人工合成了S蛋白質(zhì)的抗原肽S1(332-351位，TKFPSVYAWERKKISNCVAD，SEQ ID NO7)和S2(758-780位，RNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFG，SEQ ID NO8)以及ORF3蛋白質(zhì)的抗原肽SBP1(176-199位，STPKLKEDYQIFFYSEDRHSGVKD，SEQ ID NO9)，對兔子免疫后制備獲得多克隆抗體。
N蛋白抗體采用全長N蛋白(實(shí)施例1)免疫獲得。
分別采用S2和SBP1抗體與轉(zhuǎn)膜后的蛋白質(zhì)反應(yīng)，用ECL顯色。分別用ORF3蛋白質(zhì)的抗體(抗SBP1)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，在病毒感染的細(xì)胞和分泌到細(xì)胞外的病毒中都檢測到ORF3蛋白質(zhì)(圖6A)。檢測的蛋白質(zhì)分子量在31KD-34KD左右，與SDS-PAGE的結(jié)果相符，并暗示ORF3蛋白質(zhì)可能有翻譯后修飾或不同形式的亞型。
用S蛋白的抗體(抗S2)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，在還原膠上，可在180KD處檢測到S蛋白，而在非還原膠上，可在180KD和210KD處同時檢測到S蛋白，說明S蛋白與其他蛋白質(zhì)形成了鏈間二硫鍵復(fù)合物，復(fù)合物的分子量在210KD。再用ORF3蛋白的抗體(抗SBP1)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，在非還原膠210KD處也發(fā)現(xiàn)了ORF3蛋白。這說明ORF3蛋白與S蛋白確實(shí)形成了鏈間二硫鍵共價復(fù)合物。結(jié)果見圖6B。
實(shí)施例4 免疫電鏡實(shí)驗(yàn)首先是把ORF3蛋白抗體(抗SBP1)與SARS冠狀病毒顆?；旌虾鬁卦。缓笥媒饦?biāo)(Protein A-Gold)進(jìn)行標(biāo)記號并在透射電子顯微鏡下觀察。結(jié)果表明ORF3蛋白存在于病毒顆粒上(圖7A)。
隨后又進(jìn)行了免疫凝集實(shí)驗(yàn)。把ORF3蛋白抗體(抗SBP1)與SARS冠狀病毒顆?；旌虾鬁卦。缓笤谕干潆娮语@微鏡下觀察，同時用抗S2和抗N蛋白的抗體作為陽性對照。結(jié)果表明，在抗SBP1抗體存在的情況下出現(xiàn)了病毒顆粒的凝集(圖7B)。實(shí)驗(yàn)確認(rèn)ORF3蛋白定位在病毒顆粒，是一個結(jié)構(gòu)蛋白。
ORF3蛋白抗體(抗SBP1)金標(biāo)免疫電鏡觀察和凝集反應(yīng)結(jié)果如圖7所示。圖7A為ORF3蛋白抗體(抗SBP1)存在下的SARS冠狀病毒顆粒的金標(biāo)免疫電鏡圖。圖7B為ORF3蛋白抗體(抗SBP1)、抗S2和抗N蛋白的抗體存在下的SARS冠狀病毒顆粒的免疫凝集電鏡圖。
實(shí)施例5臨床血清ELISA實(shí)驗(yàn)選用了56個SARS病人和36個正常人的血清，分別與ORF3的抗原肽SBP1和SBP2進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，以S1抗原肽作為陽性對照。
結(jié)果見圖8。SARS病人中一部分人的血清均與有SBP1和SBP2有顯著反應(yīng)，另一部分則低于正常人的反應(yīng)。此外，與SBP2有顯著反應(yīng)的病人血清在檢測S1抗原肽的反應(yīng)時出現(xiàn)類似的反應(yīng)。統(tǒng)計分析表明它們有顯著的相關(guān)性(圖8D)，這表明，ORF3蛋白和S蛋白在功能上密切相關(guān)。
實(shí)施例6抗原多肽的與載體的連接(偶聯(lián)物的制備)對于實(shí)施例3合成的ORF3蛋白質(zhì)的抗原肽SBP1(SEQ ID NO9)，先用PBS溶解(對某些不溶的多肽，可以先用半量PBS溶解，若不溶則用1M NaOH調(diào)節(jié)PH使之全溶)，取0.5ml多肽(濃度分別為0.5mg/ml、1mg/ml)與15mgBSA(1.5ml)混勻，然后加入交聯(lián)劑(針對交聯(lián)方向的不同，選擇不同的交聯(lián)劑，N-端交聯(lián)加入戊二醛，C-端加入EDAC)，混合后于室溫反應(yīng)5小時，避光不斷搖晃；交聯(lián)結(jié)束后，放入透析袋中，對PBS 4℃透析過夜；量體積，以BSA計算濃度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例7抗原多肽免疫動物制備抗體取實(shí)施例6制備的偶聯(lián)物約0.5ml(偶聯(lián)物含量分別為0.1mg、0.5mg)，加入PBS 1.5ml后與CFA(完全弗氏佐劑)混合，在三通管中反復(fù)推打，直至感覺費(fèi)力，放置3-5分鐘后，無兩相分離即可。
將經(jīng)過佐劑乳化處理的抗原免疫兔子和小鼠；每只兔子注射抗原3ml左右，小鼠則注射0.8ml/只。分別皮下注射動物兩足墊、頸部、背部多點(diǎn)注射(每點(diǎn)0.2ml)。
初次免疫三周后，取同樣劑量多肽抗原、PBS，混合2ml IFA(不完全弗氏佐劑)，乳化后對動物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，注射劑量不變。
三周后對動物取血，收集抗血清。使用BSA包被的層析柱，清除針對BSA的抗體。挑選抗體滴度較高的抗原多肽，制得單克隆抗體。
實(shí)施例8檢測應(yīng)用(1)抗原多肽檢測病人血清樣品使用經(jīng)過處理的實(shí)施例3制備的抗原多肽(SEQ ID NO9)包被，與病人血清混合反應(yīng)，結(jié)果本發(fā)明的抗原肽段可以識別病人血清中早期針對SARS的特異性抗體，并與之結(jié)合，洗滌后加入HRP酶連二抗反應(yīng)；最后加入顯色底物，進(jìn)行檢測。
結(jié)果表明，本發(fā)明的ORF免疫原性肽可特異性地與抗SARS病毒的抗體結(jié)合。
(2)抗體(單抗與多抗)檢測病原體對于實(shí)施例7獲得的抗體(多抗和單抗)，用ELISA法與病人血清反應(yīng)，檢測病人組織液、血液中的病毒結(jié)合，對病原體進(jìn)行檢測。
結(jié)果表明，本發(fā)明的多抗和單抗可特異性地與SARS病毒結(jié)合。
實(shí)施例9 SARS冠狀病毒ORF3蛋白原核表達(dá)及純化在本實(shí)施例中，用對應(yīng)于SARS冠狀病毒ORF3蛋白的全長基因克隆(SEQID NO2)兩端序列20bp的引物，通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到ORF3的全長序列，然后插入原核表達(dá)載體pQE30中(Qiagen公司)的多克隆位點(diǎn)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。挑單克隆在相應(yīng)的抗性培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜后，以1∶10比例接種至相同抗性的培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。重組的ORF3蛋白按照操作手冊經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后，SDS-PAGE檢測。分子量約為34KD，與預(yù)測值相符。
Western印跡純化后的ORF3蛋白經(jīng)12％SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用封閉液(3％Gelatin)封閉后，加入免疫后兔抗血清(1/1000稀釋)，37℃孵育1小時，洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔的IgG(H+L)，37℃孵育1小時，充分洗滌后ECL顯色。
結(jié)果，重組表達(dá)的ORF3在約34kDa處有一顯色條帶，與預(yù)測相符。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白ORF3及其應(yīng)用<130>035182<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>274<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>1Met Asp Leu Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gln1 5 10 15Pro Val Lys Ile Asp Asn Ala Ser Pro Ala Ser Thr Val His Ala Thr20 25 30Ala Thr Ile Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Val Ile35 40 45Gly Val Ala Phe Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Thr Lys Ile Ile Ala50 55 60Leu Asn Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Tyr Lys Gly Phe Gln Phe Ile65 70 75 80Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Ile Tyr Ser His Leu Leu Leu85 90 95Val Ala Ala Gly Met Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Ile100 105 110Tyr Phe Leu Gln Cys Ils Asn Ala Cys Arg Ile Ile Met Arg Cys Trp115 120 125Leu Cys Trp Lys Cys Lys Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn130 135 140Tyr Phe Val Cys Trp His Thr His Asn Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr145 150 155 160Asn Ser Val Thr Asp Thr Ile Val Val Thr Glu Gly Asp Gly Ile Ser165 170 175Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Ser Glu Asp180 185 190Arg His Ser Gly Val Lys Asp Tyr Val Val Val His Gly Tyr Phe Thr195 200 205Glu Val Tyr Tyr Gln Leu Glu Ser Thr Gln Ile Thr Thr Asp Thr Gly210 215 220Ile Glu Ash Ala Thr Phe Phe Ile Phe Asn Lys Leu Val Lys Asp Pro225 230 235 240Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Ala Asn
245 250 255Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser Val260 265 270Pro Leu<210>2<211>825<212>DNA<213>SARS病毒(SARS virus)<400>2atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt 60gacaatgctt ctcctgcaag tactgttcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca 120ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc 180aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt 240tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt 300atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca 360tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatcccagaa cccattactt 420tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat 480aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc 540aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat 600gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact 660acagacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca 720ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat 780cccatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaa 825<210>3<211>13<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>3Phe Phe Thr Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gln Pro Val Lys1 5 10<210>4<211>14<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>4Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Ser Glu Asp Arg1 5 10<210>5<211>39<212>PRT
<213>SARS病毒(SARS virus)<400>5Leu Val Lys Asp Pro Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser1 5 10 15Ser Gly Val Ala Asn Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr20 25 30Thr Thr Thr Ser Val Pro Leu35<210>6<211>39<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<220>
<221>misc feature<222>(23)..(23)<223>Met為氧化的甲硫氨酸<400>6Leu Val Lys Asp Pro Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser15 10 15Ser Gly Val Ala Asn Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr20 25 30Thr Thr Thr Ser Val Pro Leu35<210>7<211>20<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>7Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn1 5 10 15Cys Val Ala Asp20<210>8<211>23<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>8Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr
1 5 10 15Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly20<210>9<211>24<212>PRT<213>SARS病毒(SARS virus)<400>9Ser Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Phe Phe Tyr Ser Glu1 5 10 15Asp Arg His Ser Gly Val Lys Asp20
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)蛋白，其特征在于，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO1氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO1氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且定位在SARS病毒顆粒上具有免疫原性，可與S蛋白形成了鏈間二硫鍵共價復(fù)合物的由(a)衍生的多肽。
2.一種抗體，其特征在于，所述的抗體特異性地與權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合。
3.如權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于，所述的抗體是單克隆抗體。
4.一種多肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO1中連續(xù)的25-100氨基酸，且與權(quán)利要求2所述的抗體特異性結(jié)合。
5.一種檢測試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)蛋白、權(quán)利要求2所述的抗體、權(quán)利要求4所述的多肽、或其組合。
6.一種體外檢測樣品中是否存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體的方法，其特征在于，包括步驟(a)將樣品與選自下組的物質(zhì)接觸權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)蛋白、權(quán)利要求2所述的抗體、權(quán)利要求4所述的多肽、或其組合；(b)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表示樣品中存在SARS病毒或抗SARS病毒抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的樣品為血清或痰液。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的物質(zhì)是氨基酸序列為SEQ ID NO1的蛋白。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的物質(zhì)是權(quán)利要求2所述的抗體，且所述抗體是單克隆抗體。
10.一種組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其應(yīng)用。這個蛋白質(zhì)屬于ORF3(位于SARS冠狀病毒基因組S基因和E基因之間)的基因產(chǎn)物。ORF3蛋白質(zhì)被定位在病毒顆粒上，與識別宿主細(xì)胞和感染有關(guān)。ORF3蛋白或其免疫原性片段可作為抗原，用于生產(chǎn)抗體以及開發(fā)檢測和治療SARS的制劑。
文檔編號G01N33/53GK1616485SQ20031010860
公開日2005年5月18日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月14日
發(fā)明者吳家睿, 曾嶸, 孫兵, 楊瑞馥, 施木德 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院