專利名稱：：用于原發(fā)性肝癌基因治療的腺病毒載體及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及腫瘤的基因治療及病毒治療領(lǐng)域，具體涉及到，通過腫瘤特異性啟動子調(diào)控腺病毒載體在特定條件下進行病毒復制和外源插入基因表達的技術(shù)，即利用甲胎蛋白啟動子調(diào)控腺病毒載體，在表達甲胎蛋白的原發(fā)肝癌細胞中特異性地進行病毒復制和外源插入基因表達，從而在表達甲胎蛋白的肝癌細胞中，因受甲胎蛋白啟動子控制而特異性地進行病毒復制和外源插入基因表達，從而殺死肝癌細胞的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，是僅次于心血管疾病的人類第二號“殺手”，傳統(tǒng)的腫瘤治療方法有相當?shù)木窒扌?，例如，放、化療殺死腫瘤細胞的同時，對腫瘤患者身體的毒副作用極強。近年來分子生物學以及其它學科的發(fā)展，人們對各種基因的功能及其與疾病之間的關(guān)系逐漸了解，腫瘤的生物治療迅速發(fā)展，其中主要包括腫瘤免疫治療和基因治療等方面，前者包括抗癌效應細胞的激活、細胞因子的誘發(fā)、抗癌抗體(即導向治療)的篩選、新型疫苗的研制等方法，后者包括病毒載體和非病毒載體的治療等方法。以病毒為載體的惡性腫瘤的基因治療，載體可以高效地、特異性地進入腫瘤細胞，并表達所攜帶的治療用外源基因，或特異性地在腫瘤細胞中復制、繁殖，進而殺死腫瘤細胞。目前常見的基因治療病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體，其中研究的最多的是腺病毒載體。人的腺病毒根據(jù)顆粒表面表位的不同分為50個血清型，分別歸A-F6個亞屬。每個亞屬的成員之間可相互交換遺傳物質(zhì)，但在不同的亞屬之間不能相互重組。人5型腺病毒屬人腺病毒C亞屬。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，其基因組長度約為36kb，分早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(E區(qū))和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)(L區(qū))，早期轉(zhuǎn)錄區(qū)詳細可分為6個獨立的區(qū)域E1A、E1B、E2(E2A和E2B)、E3、E4。刪除了E1區(qū)和E3區(qū)的腺病毒載體，通常被稱為第一代腺病毒載體，這種載體可插入并表達長度不超過8kb的外源基因，這種腺病毒載體本身不能復制產(chǎn)生子代病毒，并具有下列特點可感染多種類型細胞，包括靜止期不分裂的細胞；基因組不與宿主細胞的基因組發(fā)生隨機整合，較為安全；易于大規(guī)模生產(chǎn)，可獲得較高滴度的病毒。無論何種基因治療載體，如何改進并提高其在腫瘤細胞中的特異性，是該載體能否安全應用于臨床的關(guān)鍵。為達到此目的，人們通過基因工程方法，不斷改造腺病毒載體或者使改造后的病毒能在腫瘤細胞中特異性復制增殖，而在正常細胞內(nèi)不能復制增殖，成為一種所謂溶瘤性病毒，如Onyx公司的Onyx-015病毒，特異殺傷p53基因突變的腫瘤細胞；或者，通過改造腺病毒基因組本身(LieberAetal.)，通過腺病毒纖毛結(jié)構(gòu)的修飾(CurielD、etal.)，以及通過使用外源腫瘤特異性啟動子控制重組腺病毒的復制(YuDCetal.)，實現(xiàn)腫瘤特異性載體的目的，如Calydon公司的CN706病毒，通過前列腺腫瘤特異性啟動子SPA的作用，特異殺傷前列腺癌細胞。原發(fā)肝癌細胞與正常肝癌細胞的一個重要區(qū)別是，超過70％的原發(fā)肝癌細胞表達甲胎蛋白，而正常肝細胞則不表達，只有胚胎肝細胞中有甲胎蛋白的表達，這是癌細胞幼稚化的一種體現(xiàn)，在臨床診斷中，甲胎蛋白的檢測是原發(fā)肝癌診斷的重要手段之一。我們將腺病毒載體基因組中自身啟動子基因刪除，替換成甲胎蛋白啟動子，使重組后的受控于甲胎蛋白啟動子的腺病毒載體，只能在表達甲胎蛋白的情況下，因啟動子被激活而進行復制和表達，在正常的肝細胞中，因沒有甲胎蛋白的存在，腺病毒載體不能復制和表達，由此達到了對肝細胞選擇性殺傷的目的。應用甲胎蛋白啟動子控制腺病毒產(chǎn)生肝癌組織特異性，是常見的抗肝癌腫瘤基因治療研究方法。但由于甲胎蛋白啟動子結(jié)構(gòu)復雜，不同部位作用不同，具有不同功能，使得人們對甲胎蛋白啟動子的肝癌特異性產(chǎn)生很大置疑。我們對常用的甲胎蛋白啟動子進行了改進，使用一種具有特殊結(jié)構(gòu)的甲胎蛋白啟動子，它含有增強子(Enhancer)、沉默子(Silencer)及啟動子核心區(qū)(Corepromoter)等全部功能元件。此外，為了增強該啟動子的特異性，我們在重組腺病毒載體的基因組中甲胎蛋白啟動子基因序列的上游插入了特殊的基因調(diào)控元件——隔離子(Insulator)，使其達到了很高的特異性。作為腫瘤基因治療的載體，一方面要求具有腫瘤特異性；另一方面，應具有抗腫瘤特性，即在腫瘤特異性啟動子控制條件下，將所攜帶的相關(guān)的抗腫瘤基因，在腫瘤細胞內(nèi)特異性表達，從而有效地殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞沒有殺傷作用。在此，我們將Ad5型腺病毒的E1a基因和腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TNF-relatedapoptosis-inducingligand，簡稱TRAIL)基因通過基因工程手段，與腺病毒基因組進行基因重組，可以實現(xiàn)上述目標。人類腺病毒5型E1a基因，位于腺病毒線性雙鏈DNA基因組的左端，具有84％的保守性。該基因產(chǎn)生兩種主要的mRNA，大小分別為13S和12S，分別編碼289和243個氨基酸的兩個蛋白，這兩個蛋白通過激活病毒基因的表達，促使病毒的復制(ShenkT，1996)。這兩個蛋白是腺病毒最初表達的蛋白，具有激活腺病毒其它基因，特別是E2區(qū)和E4區(qū)基因的功能，是腺病毒復制的關(guān)鍵。E1a基因編碼的蛋白有3個轉(zhuǎn)化必須的區(qū)域非保守氨基酸末端(aa2-24)；保守區(qū)1(CR1；aa40-80)；保守區(qū)2(CR2；aa120-140)。E1a基因編碼的蛋白的不同功能區(qū)域與細胞內(nèi)的兩類蛋白結(jié)合，從而使E1a編碼的蛋白活化，發(fā)揮其功能轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活劑p300/CBP家族，與E1a基因的蛋白N末端和CR1結(jié)合，Rb家族與CR1和CR2結(jié)合，這些反應從功能上影響不同的生長調(diào)節(jié)途徑，從而促進分化。雖然細胞實驗表明，E1a在E1b和ras基因產(chǎn)物的協(xié)同作用下，可以使正常的胚胎成纖維細胞系惡性轉(zhuǎn)化，接種于裸鼠時成瘤(YuD&HungMC，1998)，但E1a基因本身不能使細胞系惡性轉(zhuǎn)化(ChangJYetal.，1996)，迄今為止，沒有證據(jù)表明E1a基因是致癌基因，相反，近年來發(fā)現(xiàn)E1a是具有抑癌作用的基因，它可以通過多種途徑抑制腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移。E1a基因?qū)δ[瘤的抑制是通過以下幾個方面實現(xiàn)的1.通過依賴p53的機制抑制腫瘤。當細胞DNA損傷時，p53基因可誘導細胞進入G1期，抑制細胞增殖直到DNA損傷得到修復，如果損傷的DNA得不到修復，p53能活化誘導細胞凋亡的基因使細胞發(fā)生凋亡。而E1a基因可以維持p53野生型構(gòu)象，使p53蛋白處于較高的水平。這可能是E1a基因蛋白與細胞內(nèi)P300蛋白結(jié)合的結(jié)果。2.通過非依賴p53的機制抑制腫瘤，可能與細胞內(nèi)一些基因的激活或失活有關(guān)，從而促進細胞的凋亡，目前機制尚不清楚(RicardoSPetal.，1996)。3.E1a基因通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的免疫反應抑制腫瘤。E1a基因能明顯增加NIH3T3細胞對TNF細胞毒性的敏感性，通過NK細胞和激活巨噬細胞影響靶細胞對非依賴TNF溶細胞機制的易感性(ChenMJetal.，1987)。4.E1a基因可通過將腫瘤細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ぜ毎硇?，抑制不同人類腫瘤細胞的惡性行為(YuD&HungMC，1998)。5.E1a基因通過抑制蛋白酶基因表達抑制腫瘤侵襲，如IV型膠原酶、纖溶酶原激活劑、間質(zhì)膠原酶、尿激酶及溶基質(zhì)素等(YuD&HungMC，1998，RicardoSPetal.，1996)。6.E1a基因可通過增強轉(zhuǎn)移抑制基因nm23的表達抑制轉(zhuǎn)移(SteegPSetal.，1988)。此外，E1a基因可使腫瘤細胞對放射治療和化學治療的敏感性增加。其作用途徑1.通過阻斷NB-的活性。轉(zhuǎn)錄因子NB-與腫瘤細胞對放射治療和化學治療的抗拒性有關(guān)，射線和一些化學治療藥物能激活NF-κB的活性，使腫瘤細胞對放射治療和化學治療產(chǎn)生抗拒性，而E1a基因可以阻斷NF-κB的活性，從而提高腫瘤細胞對放射治療和化學治療的敏感性(ShaoRPetal.，1997)。2.通過改變細胞內(nèi)某些基因的活性。如erbB2基因的表達下降，野生型p53水平增加。Ricardo等(RicardoSPetal.，1996)研究表明E1a基因提高腫瘤細胞對放射治療和化學治療的敏感性，不依賴p53的狀態(tài)、H-ras和其他腫瘤基因的改變，甚至在HPV-E6基因高表達的癌細胞中，E1a基因的表達可使腫瘤細胞對DNA損傷類藥物和放射線的敏感性提高4～10倍。因此，人們開始廣泛研究E1a基因?qū)δ[瘤的抑制作用在用人類卵巢癌細胞株建立的裸鼠瘤模型中，通過局部注射脂質(zhì)體介導的E1a基因，腫瘤的生長和播散較對照組明顯受到抑制(YuDetal.，1995)；人類氣管內(nèi)肺癌裸鼠模型中，通過尾靜脈注射脂質(zhì)體介導的E1a基因，取得了較好的生物治療效果(ChangJYetal.，1996)；脂質(zhì)體介導E1a基因治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌、上皮性卵巢癌表明腫瘤生長受到抑制(UenoNTetal.，1998)；E1a基因的對頭頸腫瘤的治療于1996年獲FDA批準用于臨床研究，用E1a基因治療7例不可切除和復發(fā)的頭頸癌患者，以四組不同的劑量(15、30、60和120μgDNA/cm3腫瘤)進行瘤體注射，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性作用；評估的6例患者中，4例腫瘤得到控制，1例部分縮小，1例有較小的改變(YooGHetal.，1998)。E1a不僅靜脈注射在動物模型中取得了較好的治療效果，未見明顯的毒副作用，臨床研究也表現(xiàn)出肯定的療效，通過多種途徑，作用于不同基因，E1a在腫瘤治療中應該具有光明前景。本發(fā)明中，我們選用了具有抑制腫瘤作用的E1a基因作為外源治療用插入基因之一的同時，選用了近來較為引人注目的細胞凋亡相關(guān)基因作為另外一個外源治療用插入基因，二者有機結(jié)合的目的在于，提高腫瘤治療效果。凋亡是細胞自殺的過程，它使多細胞生物在組織中控制一定細胞數(shù)并消除個別威脅生物生存的細胞。細胞在嚴重DNA損傷后凋亡啟動失敗而導致惡性腫瘤的發(fā)生(EvanGetal.，1998)。某些細胞表面具獨特傳感器，被稱為死亡受體，它能探測細胞外的死亡信號(凋亡激活因子)，并能迅速啟動細胞的內(nèi)在凋亡過程(AshkenaziAetDixitVM，1998)，近期研究發(fā)現(xiàn)了一種凋亡激活因子-TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligand)蛋白，是一II型膜蛋白。真核表達的全長膜蛋白TRAIL和pmol可溶性TRAIL能迅速誘導多種腫瘤細胞凋亡(WileySRetal.，1995；PittiRMetal.，1996)。TRAIL在許多組織有表達，其受體均不與其他細胞毒配體如TNF-α結(jié)合(AshkenaziAetDixitVM，1998)。正常和腫瘤組織均表達TRAIL的DR5、DR4受體，并介導TRAIL的凋亡作用(PanGetal.，1997)，而TRAIL的DcR1和DcR2受體，在正常組織(含肝組織)中高表達，在胚胎(含胎肝)及腫瘤組織中低表達。尤為重要的是，DcR1和DcR2受體不能傳遞死亡信號，為具保護性作用的“誘餌”受體，使得正常細胞免于被殺傷。轉(zhuǎn)染實驗已證實這一保護性作用(SheridanJPetal.，1997；PanGetal.，1997)。根據(jù)TRAIL及其多種受體的表達推測，正常組織對其誘導凋亡作用不敏感(LarsEFetal.，2000)，同時，TRAIL殺傷瘤細胞與其家族其它因子一樣不依賴于p53，這樣可以更有效地殺傷一些p53發(fā)生突變了的細胞(RohnTAetal.，2001)。腫瘤的基因治療，關(guān)鍵問題在于對腫瘤細胞的選擇特異性和殺傷有效性兩個方面。本發(fā)明通過使用甲胎蛋白啟動子插入病毒載體，控制外源插入基因的表達，具有特異性殺傷肝癌細胞的特征，同時，外源插入的治療用基因，選用已經(jīng)進入臨床研究的E1a基因和具有凋亡激活作用的TRAIL基因，通過內(nèi)部核糖體進入位點IRES基因的調(diào)控作用，同時分別表達這兩種基因編碼的蛋白，增強了對腫瘤細胞殺傷作用的有效性。即，將5型腺病毒的E1區(qū)啟動子刪除，代之以甲胎蛋白啟動子，研究甲胎蛋白啟動子及隔離子的腫瘤特異性，并在它們基因序列的下游連接E1a和TRAIL，得到Ad.HS4.AFP.E1a/TRAIL重組腺病毒載體構(gòu)建。研究表明，該重組腺病毒載體，具有在原發(fā)肝癌細胞中因甲胎蛋白的表達而特異性調(diào)控了甲胎蛋白啟動子進行腺病毒復制的特點，使得該啟動子控制下的兩種不同治療用基因得以表達，有效增強了特定條件下，即原發(fā)肝癌細胞中，該病毒載體對腫瘤細胞的殺傷作用。本發(fā)明還提供了含有此腫瘤特異性的病毒載體及可用藥用載體共同使用。本發(fā)明還提供了此腫瘤特異性的病毒載體在用于腫瘤治療的藥物組合治療用途。本發(fā)明還提供了類似的腫瘤特異性的病毒載體在用于腫瘤治療中的用途。本發(fā)明還提供了類似的腫瘤特異性的病毒載體在用于腫瘤治療中與其它藥物和/或可用藥用載體的組合治療用途。圖1.重組腺病毒Ad.HS4.AFP.E1a/TRAIL結(jié)構(gòu)示意圖。其中，HS4為雞的β-球蛋白隔離子基因，AFP為甲胎蛋白啟動子基因，分別由2個增強子、6-8個沉默子及啟動子核心區(qū)基因構(gòu)成，E1a是5型腺病毒早期基因E1a區(qū)基因，IRES為內(nèi)部核糖體進入位點基因，TRAIL為腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體，ΔE3表示5型腺病毒早期基因E3區(qū)基因刪除。圖2.通過活細胞比色檢測試驗研究感染系數(shù)MOI為100(TCID50)時，AFP陰性/陽性細胞中細胞毒特異性。HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404分別為肝癌細胞系，L-02為人的正常肝細胞，LS174T為人結(jié)腸癌細胞，Hek293為人胚腎細胞。上述細胞在96孔板中培養(yǎng)至每孔104個細胞時，分別加入AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520，或培養(yǎng)液作為對照，6天后，進行MTS法檢測490nm吸光值，結(jié)果為三次不同試驗重復的結(jié)果均值。圖3.不同TCID50感染系數(shù)MOI條件下重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL對不同肝癌細胞系的劑量依賴細胞毒性作用。Hep3B，HepG2是AFP高表達細胞系，BEL-7404，SMMC-7721是AFP低表達細胞系，上述細胞在96孔板中培養(yǎng)至每孔104個細胞時，分別用MOI1000，100，10，1的AdHS4.AFP.E1A/TRAIL進行感染，感染后連續(xù)6天進行MTS法檢測490nm吸光值，結(jié)果為三次不同試驗重復的結(jié)果均值。圖4.E1A，TRAIL和Caspase-3表達的RT-PCR分析。BEL-7404，HepG2和L02細胞經(jīng)MOI為100TCID50的Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL(如圖所示)感染或不感染(作為對照)48h，E1A、TRAIL和Caspase-3轉(zhuǎn)錄的定量分析，以β-actin為內(nèi)部對照。圖5.通過Caspase-3酶活性的比色檢測研究TRAIL的凋亡作用。HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404分別為肝癌細胞系，上述細胞在6孔板中培養(yǎng)至每孔2×106個細胞時，通過低營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)和蚜腸霉素的阻礙，使得細胞生長趨于同步，然后更換細胞培養(yǎng)液，同時分別進行MOI為100的AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520感染和培養(yǎng)液對照，感染30小時后，收集細胞，裂解細胞，用CaspaceTM檢測比色試劑盒檢測Caspase的活性，經(jīng)405nm吸光值檢測得到結(jié)果，凋亡作用通過縱坐標單位為pmol/mg/min的自由pNA物來表示，結(jié)果為二次不同試驗重復的結(jié)果均值。圖6.重組腺病毒Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL在BEL-7404移植瘤中的復制能力以及Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL和dl1520E1A表達量的比較。對荷BEL-7404瘤的無胸腺裸小鼠的移植瘤分別進行Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL(1.0×107TCID50/mm3，C和F)，dl1520(1.0×107TCID50/mm3，B和E)，或者PBS(A和D，作為背景對照)注射，連續(xù)注射5天。荷瘤鼠在最后一次注射給藥后第7天時被處死進行組織病理分析，腫瘤的薄切片用抗E1A抗體(棕色)染色，再用蘇木精(藍色)對其它部分進行復染。E1A定量分析(G)表明，Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL組和dl1520組與PBS組在統(tǒng)計上明顯差異(p＜0.01，*)，同時，Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL組與定量dl1520組也具有統(tǒng)計意義上的差異。具體切片如圖所示。圖7.重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在體內(nèi)荷人肝癌細胞BEL-7404瘤裸鼠中抗腫瘤作用的研究。PBS，AdHS4.AFP.E1a/TRAIL(1.0×107TCID50/mm3)，dl1520(1.0×107TCID50/mm3)，或DDP直接注射到AFP低表達的BEL-7404移植瘤瘤內(nèi)，注射體積為50μl，連續(xù)注射5天，DDP連續(xù)注射7天，腫瘤體積通過腫瘤直徑的檢測來計算，每周測量2次，注射日的腫瘤體積設(shè)定為100％，與陰性對照PBS組相比，其它3組均值均有顯著抑瘤作用(p＜0.01，AVONA)。Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL組與dl1520組相比，其抑瘤作用亦有顯著差異(p＜0.05，studentttest)。參考文獻1.ParkinDM，MuirCS.CancerIncidenceinFiveContinents.Comparabilityandqualityofdata.IARCSciPubl.1992；(120)45-173.2.MathurinP，RixeO，CarbonellN，BernardB，CluzelP，BellinMF，KhayatD，OpolonP，PoynardT..ReviewarticleOverviewofmedicaltreatmentsinunresectablehepatocellularcarcinoma--animpossiblemeta-analysisAlimentPharmacolTher.1998Feb；12(2)111-26.3.AbelevGI.Alpha-fetoproteininontogenesisanditsassociationwithmalignanttumors.AdvCancerRes1971；14295-358.4.HallenbeckPL，ChangYN，HayC，GolightlyD，StewartD，LinJ，PhippsS，ChiangYL.Anoveltumor-specificreplication-restrictedadenoviralvectorforgenetherapyofhepatocellularcarcinoma.HumGeneTher.1999Jul1；10(10)1721-33.5.WatanebeK.，SaitoA.，andTamaokT.Cell-specificenhanceractivityinafarupstreamregionofthehumana-fetoproteingene.J.Biol.Chem.，2624812-4818，19876.NakabayashiH，HashimotoT，MiyaoY，TjongKK，ChanJ，andTamaokiT.Aposition-dependentsilencerplaysamajorroleinrepressinga-fetoproteinexpressioninhumanhepatoma.Mol.Cell.Biol.，115885-5893，1991.7.IdoA，NakataK，KatoY，NakaoK，MurataK，F(xiàn)ujitaM，IshiiN，TamaokiT，ShikuH，andNagatakiS.Genetherapyforhepatomacellsusingaretrovirusvectorcarryingherpessimplexvirusthymidinekinasegenneunderthecontrolofhumana-fetoproteingenepromoter.CancerRes.，553105-3109，1995.8.SteinwaerderDS，LieberA.Insulationfromviraltranscriptionalregulatoryelementsimprovesinducibletransgeneexpressionfromadenovirusvectorsinvitroandinvivo.GeneTher.2000Apr；7(7)556-67.9.IdoA，UtoH，MoriuchiA，NagataK，OnagaY，OnagaM，HoriT，HironoS，HayashiK，TamaokiT，TsubouchiH.Genetherapytargetingforhepatocellularcarcinomaselectiveandenhancedsuicidegeneexpressionregulatedbyahypoxia-inducibleenhancerlinkedtoahumanalpha-fetoproteinpromoter.CancerRes.2001Apr1；61(7)3016-2110.YeX，LiangM，Mengx，RenXW，ChenHZ，LiZY，NiSH，AndreLieber，HuF.Insulationfromviraltranscriptionalregulatoryelementsenablesimprovementtohepatomaspeci.cgeneexpressionfromadenovirusvectors.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications307(2003)759-76411.TakahashiM，SatoT，SagawaT，LuY，SatoY，IyamaS，YamadaY，F(xiàn)ukauraJ，TakahashiS，MiyanishiK，YamashitaT，SasakiK，KogawaK，HamadaH，KatoJ，NiitsuY.E1B-55K-deletedadenovirusexpressingE1A-13SbyAFP-enhancer/promoteriscapableofhighlyspecificreplicationinAFP-expressinghepatocellularcar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發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明中所構(gòu)建的重組腺病毒載體是經(jīng)過改造的5型腺病毒。5型腺病毒的基因組含35935個核苷酸，是目前研究的最為清楚的一種病毒，流行病學上主要引起人的呼吸道感染，并具有明顯自愈性的病毒。腺病毒作為疫苗應用于人體已有幾十年的歷史，從未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)化人正常細胞及致癌現(xiàn)象發(fā)生。本發(fā)明所構(gòu)建的重組腺病毒載體AdHS4.AFP.E1a/TRAIL如圖1中所示，腺病毒載體自身的E1a啟動子區(qū)被刪除，取而代之的是甲胎蛋白啟動子(AFPPromoter)，并在其上游插入隔離子(Insulator)，是一段雞的β-球蛋白基因序列HS4，用于控制和加強整個重組腺病毒載體的特異性復制和相關(guān)基因的特異性表達。甲胎蛋白啟動子的下游是腺病毒早期基因E1a基因，以及通過內(nèi)部核糖體進入位點(internalribosomeentrysite，IRES)基因連接的腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體TRAIL基因，E1a基因和TRAIL基因在特異性甲胎蛋白啟動子控制下，經(jīng)IRES的調(diào)控作用，分別同時進行表達，增強了對肝癌細胞的有效殺傷作用。本發(fā)明所構(gòu)建的重組腺病毒載體AdHS4.AFP.E1a/TRAIL已于2003年9月9日提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號是V2003010。甲胎蛋白啟動子結(jié)構(gòu)復雜，序列長達8kb。使用不同部分，其肝癌特異性有很大差別。本發(fā)明采用基因工程方法，對人甲胎蛋白啟動子結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，具體而言，即采用2次重復的增強子(Enhancer)，6次重復的沉默子(Silencer)，及甲胎蛋白啟動子核心區(qū)(Corepromoter)，共同組成一個全新的，高效的，將5型腺病毒基因組置于該啟動子控制之下，并結(jié)合隔離子等調(diào)控元件，組成一個特異性在肝癌細胞中復制表達的重組腺病毒。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明具有殺傷腫瘤特異性強和有效性高的優(yōu)點。特異性方面本發(fā)明中首先選擇使用甲胎蛋白AFP啟動子，使重組腺病毒載體所攜帶的外源插入基因在能夠表達甲胎蛋白的原發(fā)性肝癌細胞中進行復制和表達，并且，所使用的甲胎蛋白啟動子是經(jīng)過研究和改進后的重組的甲胎蛋白啟動子，從其性能上講，其腫瘤特異性較其它文獻報道的強，同時，其啟動功能上有一點優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，在啟動子上游插入隔離子，進一步增強了該啟動子的特異性。這里選擇的是雞的β-球蛋白基因序列HS4，其它類似的隔離子，均可用于增強啟動子特異性的隔離子使用，由此使得腺病毒載體在腫瘤細胞中的復制和表達特異性增強。有效性方面本方面中首先選擇已經(jīng)進入臨床研究的并已被證明具有有效抑瘤作用的腺病毒早期基因E1a基因作為治療用基因進行表達，同時，在內(nèi)部核糖體進入位點IRES基因的特殊重要調(diào)控作用下，即可應用同一個轉(zhuǎn)錄單位的情況下，同時分別表達兩種不同基因編碼的蛋白，選擇與細胞凋亡激活相關(guān)的TRAIL，加強對腫瘤細胞的殺傷作用。凋亡是細胞自殺的過程，它使多細胞生物在組織中控制一定細胞數(shù)并消除個別威脅生物生存的細胞。細胞在嚴重DNA損傷后凋亡啟動失敗而導致惡性腫瘤的發(fā)生。TRAIL，即腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體，是一II型膜蛋白，研究表明，可溶性TRAIL能迅速誘導多種腫瘤細胞凋亡。因此，TRAIL與E1a的共同表達，將增強對腫瘤細胞的殺傷效果。本發(fā)明同樣適應不同靶向的腫瘤特異性啟動子，針對不同腫瘤的特異性治療，同時選用不同腫瘤抑瘤基因和/或誘導激活基因、免疫相關(guān)基因等共同表達，以增強對腫瘤的有效殺傷作用。定義除非另有不同定義，在此使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中一般技術(shù)人員通常所理解的一樣。盡管任何與此描述的相似或相同的任何方法和材料都可用于本發(fā)明的實施或試驗。在此僅對優(yōu)選的方法和材料予以描述。為此本發(fā)明就以下術(shù)語予以定義在此使用的“隔離子”這一術(shù)語，是指編碼任何具有與雞的β-球蛋白隔離子基因序列，即HS4，同樣增強啟動子特異性功能的外源基因序列。在此使用的“外源基因”這一術(shù)語，是指插入本發(fā)明中所用腺病毒載體中的編碼任何感興趣的、有生物功能的蛋白的基因序列，該插入外源基因所編碼的蛋白，可以具有藥用或其它特征。所插入的外源基因的長度的上限取決于腺病毒載體的包裝限度。外源基因可通過常規(guī)方法，即合成、由天然來源提取、基因克隆等方法制備得到。在此使用的“肝癌特異性基因表達”和“肝癌特異性”這兩個術(shù)語，是指腺病毒載體在原發(fā)肝癌細胞中的復制和表達。雖然此載體在正常細胞中也會有表達，但表達水平很低，使得載體復制和包裝無法有效進行，以至于可以將這樣低的復制包裝水平忽略不計。在此使用的“第一代腺病毒載體”或“第一代重組腺病毒載體”這一術(shù)語，是指刪除了早期基因E1區(qū)和E3區(qū)的腺病毒載體，該類腺病毒載體不能復制。具體實施例方式實施例I重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL的構(gòu)建以下描述的重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，是帶有甲胎蛋白啟動子的5型腺病毒載體，并且，在該啟動子上游具有HS4隔離子基因，啟動子下游攜帶外源插入基因為抑瘤作用相關(guān)的腺病毒早期E1a基因和細胞凋亡激活相關(guān)的腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體TRAIL基因，且二者通過內(nèi)部核糖體進入位點IRES連接，共同使用同一轉(zhuǎn)錄單位，分別進行表達。除非另外說明，本發(fā)明所采用的技術(shù)，均是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，如分子克隆技術(shù)、微生物學技術(shù)、細胞生物學技術(shù)，這些技術(shù)在文獻中均有充分解釋。如Sambrook等的《分子克隆實驗室手冊》第二版(1989)等。質(zhì)粒載體的構(gòu)建人的甲胎蛋白啟動子基因序列來源于質(zhì)粒pXZAFP(KanekoSetal.，1995)，人的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體hTRAIL基因序列來源于質(zhì)粒pORF.TRAIL(Invivogen)，內(nèi)部核糖體進入位點IRES來源于質(zhì)粒pIRES2-EGFP(ClonetechLabotorary)，雞的β-球蛋白隔離子基因HS4來源于質(zhì)粒pSLJCa(SteinwaerderDSandLieberA，2000)，腺病毒早期基因E1a基因序列來源于質(zhì)粒pFG140(Microbix)的PCR產(chǎn)物，其擴增引物為5’-GGGACTGAAAATGAGAC-3’和5’-CGCCATGCAAGTTAAACA-3’。所有腺病毒構(gòu)建所用的質(zhì)粒pShuttle和拯救AdEasyl載體為AdEasyTM腺病毒載體系統(tǒng)試劑盒(Stratagene)，用于細菌轉(zhuǎn)化的菌株為BJ5183和XL10-gold。將質(zhì)粒pORF-TRAIL用限制性內(nèi)切酶SalI和NheI水解，得到TRAIL的DNA片段，經(jīng)T4聚合酶作用，補平片段末端，插入pShuttle-pA質(zhì)粒的AflII水解、T4聚合酶補平的DNA片段，得到質(zhì)粒pShuttle-TRAIL-pA。將質(zhì)粒pIRES2-EGFP經(jīng)XhoI和BstXI限制性內(nèi)切酶水解及T4聚合酶補平處理，連接到質(zhì)粒pShuttle-TRAIL-pA的BglII酶切、補平位點，得到質(zhì)粒pShuttle-IRES-TRAIL-pA。將以質(zhì)粒pFG140為模板經(jīng)PCR擴增得到的平端E1a基因插入質(zhì)粒pShuttle-IRES-TRAIL-pA的EcoRVI平端水解位點，得到質(zhì)粒pShuttle-E1A-IRES-TRAIL-pA。來自于質(zhì)粒pXZAFP的、帶有增強子、沉默子和核心啟動子區(qū)域的AFP啟動子基因，經(jīng)SalI和AflII水解后，連接到質(zhì)粒pShuttle-E1A-IRES-TRAIL-pA相應位點，得到質(zhì)粒pShuttle-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA。然后將來自于質(zhì)粒pSLJca的XbaI酶切水解位點的HS4基因，經(jīng)補平后插入質(zhì)粒pShuttle-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA的XhoI補平位點，得到最終質(zhì)粒pShuttle-HS4-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA。重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL的構(gòu)建將質(zhì)粒pShuttle-HS4-AFP-E1A-IRES-TRAIL-pA經(jīng)PmeI限制性內(nèi)切酶的進一步酶切水解線性化，與拯救質(zhì)粒AdEasy1在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組，經(jīng)分析得到的正確克隆將轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL10-Gold中進行進一步的擴增和純化。純化所得質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切線性化后，轉(zhuǎn)染到人胚腎細胞中，經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯和包裝，得到重組的腺病毒載體，經(jīng)進一步的酶切分析鑒定后，將所構(gòu)建的正確重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL進一步在AE25細胞中擴增，經(jīng)CsCl梯度離心，透析和滴度標定(TCID50/ml)，分裝儲藏于-80℃(DirkSSetal.，2000)。實施例II重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在肝癌細胞中的特異性作用研究MTS法檢測重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL對不同腫瘤細胞中的影響為了檢測重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL的腫瘤特異殺傷性，通過使用MTS(Promega)試劑盒檢測活細胞在感染系數(shù)MOI為100(TCID50)時，AFP陰性/陽性細胞中該病毒的細胞毒特異性。HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404分別為肝癌細胞系，L-02為人的正常肝細胞，LS174T為人結(jié)腸癌細胞，Hek293為人胚腎細胞。上述細胞在96孔板中接種至每孔104個細胞，24hr后，分別用AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520感染，或培養(yǎng)液作為對照，在不同時間點加入MTS試劑，37℃保溫一小時后，進行490nm吸光值檢測(BIO-RAD)，結(jié)果見圖2。MTS法檢測重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL對不同肝癌細胞的劑量依賴特異性影響在不同TCID50感染系數(shù)MOI條件下重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL對不同肝癌細胞系的劑量依賴細胞毒性作用。Hep3B，HepG2是AFP高表達細胞系，BEL-7404，SMMC-7721是AFP低表達細胞系，上述細胞在96孔板中培養(yǎng)至每孔104個細胞時，分別用MOI1000，100，10，1的AdHS4.AFP.E1a/TRAIL進行感染，感染后連續(xù)6天進行MTS法檢測490nm吸光值，結(jié)果見圖3。CaspaceTM法檢測重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL中因TRAIL表達引起的肝癌細胞的凋亡作用研究為了檢測TRAIL編碼的蛋白的活性，分別將肝癌細胞系HepG2，Hep3B，SMMC-7721，BEL-7404接種在6孔板中培養(yǎng)至每孔2×106個細胞時，通過低營養(yǎng)培養(yǎng)基，使得細胞生長趨于同步，0.5％FBSMEM培養(yǎng)12hr，換10％FBSMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)9hr，加入Aphidicolin(4ug/ml)培養(yǎng)12hr，更換0.5％FBSMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6hr，然后更換正常細胞培養(yǎng)液，同時分別加入MOI為100的AdHS4.AFP.E1a/TRAIL，dl1520和培養(yǎng)液對照，感染30小時后，收集細胞，裂解細胞(1％NP40，20mMHepes，PH7.4，2mMEDTA，蛋白酶抑制劑混合物(Roche))，4℃離心后其上清進行蛋白含量檢測(PierceBiotechnology)，30-50μg用于CaspaceTM檢測比色試劑盒檢測Caspase的活性，底物為Ac-DEVD-pNA(Promega)，經(jīng)405nm吸光值檢測得到結(jié)果，見圖4，凋亡作用通過縱坐標單位為pmol/mg/min的自由pNA物來表示。實施例III重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在荷肝癌移植瘤裸鼠中的抗腫瘤作用研究重組腺病毒AdHS4.AFP.E1a/TRAIL在體內(nèi)荷人肝癌細胞BEL-7404瘤裸鼠中抗腫瘤作用的研究6周齡的BALB/C裸鼠，接種1×107BEL-7404細胞懸浮液100μl。成瘤后，當移植瘤長至80-200mm3時，進行隨機分組，每組7-12只裸鼠，PBS，AdHS4.AFP.E1a/TRAIL(1.0×107TCID50/mm3)，dl1520(1.0×107TCID50/mm3)，或DDP直接注射到移植瘤瘤內(nèi)，注射體積為50μl，連續(xù)注射5天，DDP連續(xù)注射7天，腫瘤體積通過腫瘤直徑的檢測來計算，每周測量2次，第31天時處死所有荷瘤裸鼠，注射日的腫瘤體積設(shè)定為100％，與陰性對照組相比，其它3組均有顯著抑瘤作用，結(jié)果見圖5。盡管本發(fā)明為了便于明確理解而通過舉例方式在某些方面做了詳細描述，但顯然在權(quán)利要求的范圍內(nèi)進行一定的變化和修飾是可行的。權(quán)利要求1.一種重組腺病毒載體，其E1和/或E3區(qū)基因，及E1區(qū)啟動子刪除，并攜帶可在腫瘤中特異性復制表達的一個或兩個外源插入基因。2.權(quán)利要求1中所述腺病毒載體，其病毒基因組的復制與表達由外源啟動子控制。3.權(quán)利要求2中所述腺病毒載體，其病毒基因組中外源啟動子序列上游具有隔離子(insulator)，用以增強外源啟動子的特異性。4.權(quán)利要求1中所述攜帶的多種外源插入基因，不同外源插入基因之間由具有重要基因調(diào)控作用的腦心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus，ECMV)的內(nèi)部核糖體進入位點(internalribosomeentrysite，IRES)連接，形成基因雙順反表達結(jié)構(gòu)，使不同基因使用同一單位同時分別進行轉(zhuǎn)錄并表達。5.權(quán)利要求2中所述腺病毒載體，由下列元件組成a)腺病毒左側(cè)倒置末端重復序列b)腺病毒包裝序列，位于a)中左側(cè)倒置末端重復序列的下游3’端c)隔離子序列，位于b)中腺病毒包裝序列的下游3’端d)外源插入啟動子及其調(diào)控序列，位于c)中隔離子序列的下游3’端e)外源插入基因序列一，位于d)中外源插入啟動子及其調(diào)控序列的下游3’端，并受該外源插入啟動子調(diào)控f)外源插入內(nèi)部核糖體進入位點IRES基因序列，位于e)中外源插入基因序列一的下游3’端，用于控制其下游外源插入基因序列的同時分別表達g)外源插入基因序列二，位于f)中內(nèi)部核糖體進入位點的下游3’端，并受該調(diào)控基因控制，與e)中外源插入基因序列一同時分別表達h)外源插入基因序列表達終止位點多聚腺苷序列，位于g)中外源插入基因序列二的下游3’端i)一個或一個以上腺病毒基因序列，位于上述元件(a至h)基因序列的下游3’端j)腺病毒右側(cè)倒置末端重復序列，位于重組腺病毒基因的3’端6.權(quán)利要求2中所述腺病毒載體，其具有的外源啟動子是腫瘤相關(guān)的特異性啟動子。7.權(quán)利要求2中所述腺病毒載體，其具有的外源啟動子是甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)啟動子序列。8.權(quán)利要求2中所述腺病毒載體，其具有的外源甲胎蛋白啟動子序列由增強子(enhancer)序列、沉默子(silencer)序列和啟動子核心區(qū)(corepromoter)序列三個元件部分構(gòu)成。9.權(quán)利要求2中所述腺病毒載體，其具有的外源甲胎蛋白啟動子序列中增強子序列重復2次，沉默子序列重復6至8次。10.權(quán)利要求4中所述腺病毒載體，其中的隔離子序列是雞的β-球蛋白隔離子基因序列，即HS4，或其它具有相同功能的外源基因序列。11.權(quán)利要求4中所述腺病毒載體，其中的某個外源插入基因序列表達一個或多個基因產(chǎn)物。12.權(quán)利要求4中所述腺病毒載體，其外源插入基因序列的終止位點是雙向的SV40多聚腺苷序列。13.權(quán)利要求4中所述腺病毒載體，其外源插入基因序列的終止位點是雙向的多聚腺苷序列。14.權(quán)利要求4中所述腺病毒載體，其腫瘤特異性啟動子控制的外源插入基因產(chǎn)物是可以促進腺病毒載體復制的相關(guān)基因及用于直接或間接殺傷腫瘤的相關(guān)基因產(chǎn)物，包括a)細胞凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物，或/和b)細胞裂解基因產(chǎn)物，或/和c)細胞因子基因產(chǎn)物，或/和d)熱休克蛋白類免疫治療相關(guān)基因產(chǎn)物，或/和e)前藥基因類基因產(chǎn)物。f)病毒基因。15.權(quán)利要求3中所述腺病毒載體，其受外源插入啟動子控制的外源插入基因是腺病毒E1a基因。16.權(quán)利要求3中所述腺病毒載體，其受外源插入啟動子控制的外源插入基因是腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TumorNecrosisFactor-RelatedApoptosis-InducingLigand，TRAIL)基因。。17.權(quán)利要求3中所述腺病毒載體，其中的外源插入基因是受IRES調(diào)控的、可同時分別表達的腺病毒E1a基因和腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TumorNecrosisFactor-RelatedApoptosis-InducingLigand，TRAIL)基因。18.對腫瘤細胞的選擇性殺死，其中包括通過將上述權(quán)利要求2-15中任意一種重組腺病毒載體與腫瘤細胞的攜帶細胞群體接觸，即可產(chǎn)生一種被感染的腫瘤細胞的細胞群體。19.殺死腫瘤細胞的藥物組合，將上述權(quán)利要求5-16中任意一種重組腺病毒載體與其它可用藥用載體共同使用。20.權(quán)利要求17中所述與重組腺病毒載體通過藥物組合殺死腫瘤細胞，包括a)與免疫抑制劑接觸的腫瘤細胞；b)與放射性治療物接觸的腫瘤細胞；或c)與化學治療化合物接觸的腫瘤細胞。21.權(quán)利要求5-16中任意一種重組腺病毒載體，用于腫瘤的藥物組合治療用途。全文摘要本發(fā)明“用于原發(fā)性肝癌基因治療的腺病毒載體及使用方法”，提供了基于溶瘤病毒療法的治療原發(fā)性肝癌的方法和組合物。本發(fā)明構(gòu)建了一種基因重組腺病毒，其中含有甲胎蛋白啟動子基因和治療基因。研究表明，該重組病毒可以特異性的殺傷表達甲胎蛋白的原發(fā)性肝癌細胞。此基因重組腺病毒可用于原發(fā)肝癌的基因治療。文檔編號A61K35/76GK1570122SQ0315089公開日2005年1月26日申請日期2003年9月10日優(yōu)先權(quán)日2003年9月10日發(fā)明者梁旻,孟夏,任曉維,胡放申請人:上海三維生物技術(shù)有限公司