Tnfr1基因重組腺病毒及其構(gòu)建的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種腺病毒的構(gòu)建，特別是涉及一種干 擾TNFR1表達(dá)的重組腺病毒。
【背景技術(shù)】
[0002] NMDA受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一類重要的興奮性氨基酸受體，屬離子型受體，在突 觸可塑性及興奮毒性方面具有重要作用。
[0003]NMDA受體是由NR1、NR2和NR3亞單位組成的異四聚體，每種亞基在中樞神經(jīng)系統(tǒng) 中的分布不盡相同。一般認(rèn)為，NR1是NMDA受體的必需亞基，在大腦和脊髓中大量分布，是 實(shí)現(xiàn)其通道功能所必需的。NMDA受體不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的生理作用，而 且對(duì)神經(jīng)元回路的形成亦起著關(guān)鍵作用。Bird等人發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)炎模型的大鼠杏仁核神經(jīng) 元中，NMDA受體NR1的磷酸化（pNRl)明顯上調(diào)，而NR1的表達(dá)沒(méi)有明顯變化；腦片膜片鉗實(shí) 驗(yàn)中，給予杏仁核神經(jīng)元NMDA受體的拮抗劑AP5可顯著降低NMDA受體介導(dǎo)的EPSC幅度， 而且在抑制PKA，即阻斷了PKA磷酸化NR1的途徑后，NMDA受體介導(dǎo)的EPSC也被阻斷，類似 現(xiàn)象在抑制PKC后并沒(méi)有出現(xiàn)。這說(shuō)明PKA介導(dǎo)的NR1磷酸化在突觸后膜表達(dá)上調(diào)，是導(dǎo) 致突觸傳遞發(fā)生可塑性變化的重要原因，也是發(fā)生痛覺(jué)過(guò)敏的基礎(chǔ)。
[0004] 腫瘤壞死因子（TNF-α)是由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎性因子，TNF-α的許 多生物效應(yīng)是通過(guò)兩個(gè)細(xì)胞表面受體TNFR1和TNFR2介導(dǎo)的。TNF-a的大多生物活性由TNFR1來(lái)傳遞信號(hào)，如細(xì)胞程序性死亡、抗病毒活性、轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB的激活以及宿主 防御等；通過(guò)TNFR2的信號(hào)通路僅局限于免疫系統(tǒng)。這兩個(gè)受體是TNF受體超家族的成員。 [0005] 疼痛發(fā)生時(shí)，不僅神經(jīng)元產(chǎn)生的神經(jīng)肽類物質(zhì)參與了痛信號(hào)的傳入，而且神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞釋放的多種促炎細(xì)胞因子，如IL-Ιβ和TNF-α等也促進(jìn)傷害性信息的傳入，如在炎 性痛模型鼠脊髓就會(huì)明顯發(fā)生TNF-a的表達(dá)上調(diào)。
[0006] 資料表明，中樞和外周因素引起脊髓TNF-a表達(dá)上調(diào)，可以促成炎性和神經(jīng)性 疼痛的發(fā)生；脊髓膠質(zhì)細(xì)胞釋放的TNF-a可以提高神經(jīng)元的興奮性；癌痛動(dòng)物內(nèi)源性的 TNF-a表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)熱敏反應(yīng)；在鞘內(nèi)直接注射TNF-a可增強(qiáng)大鼠脊髓廣動(dòng)力神經(jīng)元的 反應(yīng)，并快速誘發(fā)動(dòng)物自發(fā)性縮足行為和熱痛反應(yīng)，而在鞘內(nèi)注射溶解的TNF-a受體的抗 體顯著減弱大鼠異常疼痛的發(fā)生。以上這些都說(shuō)明，TNF-a在脊髓水平都可以通過(guò)激活 TNF受體（TNFR)誘發(fā)痛覺(jué)過(guò)敏。
[0007]Wei等人研究發(fā)現(xiàn)，在腦干RVM利用TNF-a抑制劑，可減弱眶下神經(jīng)慢性縮窄性損 傷（CCI)誘發(fā)的痛敏反應(yīng)，并下調(diào)pNRl的表達(dá)。因此，可以設(shè)想在脊髓水平TNF-a通過(guò)激 活TNFR，介導(dǎo)了NMDA受體NR1亞基的磷酸化，引起興奮傳遞的可塑性變化以及痛敏的發(fā)生。 新近研究表明，TNF-a可以增加普通小鼠脊髓]?層細(xì)胞NMDA電流，鞘內(nèi)應(yīng)用NMDA受體阻斷 劑MK-801后可減弱鞘內(nèi)注射TNF-a所致的熱痛反應(yīng)，說(shuō)明TNF-a通過(guò)其受體TNFR影響 了NMDA受體的功能活動(dòng)。
[0008] 目前已知TNFR的2種亞型TNFR1 (55KD)和TNFR2 (75KD)在背根神經(jīng)節(jié)（DRG)和 脊髓都有表達(dá)，但二者在痛調(diào)制中的作用還有爭(zhēng)議。一般認(rèn)為TNFR1與痛信號(hào)傳遞、痛覺(jué)過(guò) 敏發(fā)生有密切關(guān)系，TNFR2并不參與此過(guò)程。而新近研究提出了不同的觀點(diǎn)，Schafers等 通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，神經(jīng)損傷后TNFR1在引起感覺(jué)神經(jīng)元興奮及誘導(dǎo)痛反應(yīng)的過(guò)程 中起主要作用，TNFR2在TNFR1作用時(shí)發(fā)揮協(xié)同作用，它獨(dú)自并不產(chǎn)生類似TNFR1的作用， 但在神經(jīng)受損后，對(duì)臨近未損傷感覺(jué)神經(jīng)元的興奮有易化作用。Xu等人認(rèn)為，在L5腹前根 離斷損傷模型引起的神經(jīng)病理性疼痛中，背根神經(jīng)節(jié)和脊髓后角的TNF-α及其受體TNFR1 的上調(diào)主要在疼痛起始過(guò)程起作用，但與神經(jīng)切斷產(chǎn)生的持續(xù)性疼痛無(wú)關(guān)。另外敲除TNFR1 和TNFR2基因的小鼠實(shí)驗(yàn)提示，TNFR1和TNFR2都參與炎性痛和痛敏的過(guò)程，但TNFR1發(fā)揮 了主導(dǎo)作用，TNFR2是參與了早期階段的炎性痛反應(yīng)。
[0009] TNF-α在痛信號(hào)傳入時(shí)表達(dá)增多，并參與痛敏及異常疼痛的發(fā)生和維持，但其通 過(guò)何種方式介導(dǎo)了這一過(guò)程，脊髓TNFR被激活后通過(guò)何種途徑引起痛覺(jué)過(guò)敏，目前還并不 清楚。鑒于以上研究，需要對(duì)炎性痛敏發(fā)生時(shí)，TNFR1和TNFR2與痛敏及pNRl的相互關(guān)系 做進(jìn)一步的研究。上述研究的基礎(chǔ)是需要構(gòu)建一種干擾TNFR基因表達(dá)的質(zhì)粒載體，以用于 阻斷TNF與TNFR結(jié)合，阻斷TNF通過(guò)該途徑產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種TNFR1基因重組腺病毒，及該重組腺病毒的構(gòu)建方法， 以用于阻斷/減少TNFR1的表達(dá)，從而緩解TNF-a通過(guò)該途徑產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種含有干擾TNFR1基因表達(dá)的siRNA的TNFR1 基因重組腺病毒，所述siRNA具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。
[0012] 用于構(gòu)建所述TNFR1基因重組腺病毒所采用的穿梭質(zhì)粒為pHBAd-U6_GFP，所述干 擾TNFR1基因表達(dá)的siRNA連接于所述穿梭質(zhì)粒的U6啟動(dòng)子之下。
[0013] 進(jìn)一步地，本發(fā)明構(gòu)建所述腺病毒所采用的骨架質(zhì)粒為pHBAd-BHG，包裝細(xì)胞為 293細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明所述TNFR1基因重組腺病毒的構(gòu)建方法是設(shè)計(jì)SEQIDNo.1所示核苷酸 序列的siRNA，化學(xué)合成對(duì)應(yīng)的SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3所示的shRNA互補(bǔ)單鏈目的 基因片段，退火得到所述目的基因片段的雙鏈表達(dá)模版，與BamHI和EcoRI雙酶切的載體 pHBAd-U6-GFP連接構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒，再將所述腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG 共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，即可得到腺病毒Ad-TNFR1shRNA。
[0015] 本發(fā)明所構(gòu)建的TNFR1基因重組腺病毒可以作為一種工具藥，用于阻斷/減少 TNFR1的表達(dá)，減少TNF-α與TNFR1的結(jié)合，從而緩解TNF-α的致痛敏作用。
[0016] 通過(guò)本發(fā)明上述工具藥的設(shè)計(jì)，可以進(jìn)一步探索TNFR1在痛敏發(fā)生中的作用及胞 內(nèi)作用機(jī)制，進(jìn)而應(yīng)用于臨床服務(wù)，設(shè)計(jì)阻斷炎性因子激活其受體的藥物，以減弱受體激活 后導(dǎo)致的痛敏作用。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是pHBAd-U6-GFP干擾載體的質(zhì)粒圖譜。
[0018] 圖2是重組腺病毒載體質(zhì)粒的細(xì)胞出毒結(jié)果。
[0019] 圖3是腺病毒Ad-TNFR1shRNA感染大鼠PC12細(xì)胞的熒光顯示結(jié)果。
[0020] 圖4是腺病毒Ad-TNFRlshRNA感染大鼠PC12細(xì)胞的WesternBlot檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1 設(shè)計(jì)干擾TNFR1 表達(dá)的siRNA序列，具體為：5'-attgttactaagcccctaact-3'。
[0022] 人工合成含有上述siRNA的shRNA表達(dá)序列，所述序列通過(guò)7個(gè)堿基的loop環(huán)連 接上述siRNA的正義鏈和反義鏈，并在序列兩端分別引入BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)。
[0023]Topstrand(62bp)： 5'-AATTCGattgttactaagcccctaactTGTGCTTagttaggggcttagtaacaatTTTTTTg-3,；Bottomstrand(62bp)： 5'-GATCCAAAAAAattgttactaagcccctaactAAGCACAagttaggggcttagtaacaatCg-3' 。
[0024] 將上述互補(bǔ)利用3'和5'的單鏈退火得到相對(duì)應(yīng)的目的片斷shRNA的雙鏈表達(dá)模 版退火產(chǎn)物。退火程序?yàn)椋?體系：20μ1 ; 10XBuffer2μ1 ； 100mMTris-ClpH7. 5 ； 1MNaCl；lOmMEDTA； shDNA-R/shDNA-F:1/1μ1 ; H20 ：16μl〇
[0025]程序：95°C10 分鐘；75°C10 分鐘；55°C10 分鐘；35°C10 分鐘；15°C10 分鐘。
[0026]pHBAd-U6_GFP干擾載體的質(zhì)粒圖譜如圖1所示，其U6啟動(dòng)子后為MCS(多克隆位 點(diǎn)）區(qū)，BamHI和EcoRI為插入位點(diǎn)，目的片斷插入BamHI、EcoRI位點(diǎn)，由U6啟動(dòng)子調(diào)控表 達(dá)。該腺病毒載體中含有PCMV啟動(dòng)子調(diào)控的GFP基因表達(dá)。
[0027] 用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切載體pHBAd-U6-GFP，酶切體系如下： 20μ1酶切體系37°C1小時(shí)； 4μ1 載體（500ng/μ1); 1 μ1BamHI/Ιμ1EcoRI; 2 μ1 10Xbuffer; 12μ1H20〇
[0028] 酶切完成后膠回收，回收體系：20μ1，含lOXBuffer2yl，100mMTris-Cl pH7. 5,1MNaCl，10mMEDTA。
[0029] 將上述干擾序列TNFR1shRNA的退火產(chǎn)物用T4連接酶連接到載體pHBAd-U6-GFP 的BamHI、EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒，由U6啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)。
[0030] 引物為上海桑尼生物合成PAGE膠純化的oligo序列，分別稀釋至100μM。
[0031] 處理好的目的片段shRNA與載體連接的反應(yīng)體系：