一種新型甲型肝炎病毒株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒領(lǐng)域，具體講，涉及一種新型甲型肝炎病毒株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲肝病毒屬于小RNA病毒科（Picornaviridae)，在1991年甲肝病毒被劃分為 h印atovirus屬且該屬僅包含甲肝病毒一個(gè)種；甲型肝炎病毒是一種顆粒較小，在體外為 無包膜狀態(tài)的球形顆粒，其基因組為單股正鏈RNA，基因組長度約為7400個(gè)核苷酸，主要通 過糞口途徑傳播，并在肝臟中復(fù)制。主要可以感染人和猴，根據(jù)基因組分析，目前甲肝病毒 分為6個(gè)基因型，其中I、II和III型主要感染人，IV、VandVI主要感染猴子，但甲肝病毒 僅包含一個(gè)血清型。甲肝病毒感染的臨床癥狀主要表現(xiàn)為疲乏，食欲減退，肝腫大，肝功能 異常，部分病例出現(xiàn)黃疸，主要表現(xiàn)為急性肝炎，無癥狀感染者常見。任何年齡均可患本病， 但主要為兒童和青少年。成人甲肝的臨床癥狀一般較兒童為重。
[0003] 甲型肝炎病毒常引起急性的肝炎，我國是甲型肝炎的高發(fā)區(qū)之一，其發(fā)病為各型 肝炎的首位，甲肝病毒有時(shí)也引起暴發(fā)。該病毒在體外較穩(wěn)定，耐熱且耐酸性條件，因此的 體外傳播的風(fēng)險(xiǎn)和時(shí)間也大大增加。甲肝病毒感染期較長，多數(shù)感染者病程在15-45天，平 均病程也長達(dá)30天，由于該病的高發(fā)病率及較長的病程，給人民健康及經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來嚴(yán)重 影響。甲肝病毒感染目前仍無有效的治療藥物，接種疫苗是目前人類對(duì)抗甲肝病毒的主要 手段和最經(jīng)濟(jì)的措施。迄今為止，甲肝病毒僅在人類、靈長類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，未在其他動(dòng)物中 發(fā)現(xiàn)有甲肝病毒的存在。但是目前我國采用的甲肝疫苗為減毒疫苗，存在毒力返祖和次傳 播問題，對(duì)接種者及其密切接觸者構(gòu)成潛在的安全隱患。其次，對(duì)免疫功能低下或缺陷者高 度危險(xiǎn)。此外，減毒活疫苗還存在熱穩(wěn)定性差、運(yùn)輸貯存條件要求苛刻等缺點(diǎn)。
[0004] 然而，目前對(duì)于各種類型甲型肝炎病毒的基因組還了解甚少。對(duì)于新型甲型肝炎 病毒的發(fā)現(xiàn)并對(duì)其基因組特征和病毒特性的解析對(duì)于診斷、治療或預(yù)防人類甲肝將有很大 益處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出了一種新的型別的甲型肝炎病毒株，此病毒株多 聚蛋白區(qū)與已知人甲肝病毒氨基酸同源性為67%，同時(shí)可以定義為新的甲肝病毒血清型， 該病毒株的保藏編號(hào)為CGMCCN0. 11200。該甲型肝炎病毒株的全基因序列如SEQIDN0: 1所示。
[0006] 本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出該甲型肝炎病毒株在制備用于預(yù)防和/或治療 甲型肝炎的藥物中的應(yīng)用。其中，藥物選自甲肝減毒活疫苗、甲肝滅活疫苗、甲肝多肽疫苗 或甲肝基因工程疫苗，所述的甲肝滅活疫苗包括亞單位疫苗。
[0007] 本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提出一種甲型肝炎的疫苗，該疫苗中含有本發(fā)明的甲 型肝炎病毒株；所述的疫苗優(yōu)選為甲肝減毒活疫苗、甲肝滅活疫苗、甲肝多肽疫苗或甲肝基 因工程疫苗，所述的甲肝滅活疫苗包括亞單位疫苗。
[0008] 本發(fā)明的第四發(fā)明目的在于提出一種用于制備抗體、雜交瘤細(xì)胞或抗血清的方 法，根據(jù)本發(fā)明的病毒株、該病毒株的裂解成份、該病毒株的基因工程蛋白或該病毒株的多 肽為免疫原進(jìn)行制備。
[0009] 本發(fā)明的第五發(fā)明目的在于提出采用上述方法得到的制備抗體、雜交瘤細(xì)胞或抗 血清。
[0010] 本發(fā)明的第六發(fā)明目的在于提出該甲型肝炎病毒株在制備甲肝診斷制劑中的應(yīng) 用。
[0011] 其中：診斷制劑包括抗原檢測試劑盒、抗體檢測試劑盒和核酸檢測試劑盒；抗原 檢測試劑盒中的抗原選自甲肝病毒、病毒株的裂解成份、病毒株的基因工程蛋白或病毒株 的多肽；；抗體檢測試劑盒中的抗體選自甲肝病毒、病毒株的裂解成份、病毒株的基因工程 蛋白或病毒株的多肽制備的單抗或多抗；核酸檢測試劑盒包括普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR等。
[0012] 下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的解釋和說明。
[0013] 本發(fā)明涉及一種全新的甲型肝炎病毒株，其保藏號(hào)為CGMCCN0. 11200 ;通過對(duì)甲 型肝炎病毒基因組進(jìn)行全序列的測定，全基因組長7581bp，其序列如SEQIDN0 :1所示。最 后進(jìn)行病毒序列的全基因組擴(kuò)增。本發(fā)明為檢測甲型肝炎病毒、研究甲型肝炎病毒感染機(jī) 制等目的奠定可靠的基礎(chǔ)。
[0014] 該甲型肝炎病毒株的分離和純化方法為：取帶毒動(dòng)物的糞便加入到離心管中，加 入緩沖溶液震蕩后離心，粗純化病毒懸液；采用熒光定量PCR檢測病毒中甲型肝炎的RNA 載量；利用蔗糖/甘油密度離心收集甘油和30%蔗糖密度的樣品，脫糖后作為純化后抗原； 本發(fā)明采用土撥鼠糞便進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)，利用real-time實(shí)時(shí)定量初步鑒定為甲肝病 毒，RT-PCR技術(shù)獎(jiǎng)病毒的VP1區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增后測序，經(jīng)Genbank比對(duì)結(jié)果表明，該病毒為 甲型肝炎病毒一個(gè)新的型別。
[0015] 本發(fā)明的基因組全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法和RACE方法獲得。
[0016] 本發(fā)明涉及該甲型肝炎病毒株在制備用于預(yù)防和/或治療甲型肝炎的藥物中的 應(yīng)用。其中，藥物選自甲肝減毒活疫苗、甲肝滅活疫苗、甲肝多肽疫苗或甲肝基因工程疫苗。 其中減毒活疫苗、滅活疫苗、多肽疫苗或基因工程疫苗的制備可采用現(xiàn)有技術(shù)的方法進(jìn)行 制備。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有全面的描述：《動(dòng)物基因工程疫苗原理與方法》，《疫苗學(xué)》 (StanleyA.Plotkin和WaalterA編，梁曉峰等譯，2011)《疫苗研究與應(yīng)用》（趙鎧編著， 2013年），《疫苗關(guān)鍵技術(shù)詳解》第二版（李琦涵著）。
[0017] 本發(fā)明還涉及制備抗體、雜交瘤細(xì)胞或抗血清的方法，具體可采用本發(fā)明的病毒 株、該病毒株的裂解成份、該病毒株的基因工程蛋白或該病毒株的多肽為免疫原按照現(xiàn)有 技術(shù)的方法進(jìn)行制備。
[0018] 本發(fā)明的另一發(fā)明目的在于提出該甲型肝炎病毒株在制備甲肝診斷制劑中的應(yīng) 用。診斷試劑盒的設(shè)計(jì)和制備可采用現(xiàn)有技術(shù)中的方法進(jìn)行制備。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù) 本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并按本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。在獲得線全長序列后， 根據(jù)初步全長序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增2000~3000bp的長片段，以保證全長序列準(zhǔn)確性。
[0019] 本發(fā)明的病毒株，可感染美洲旱獺，lX107C〇pieS/ml的病毒量能夠引起1-3美洲 旱獺的發(fā)病或死亡。
【附圖說明】：
[0020] 圖1為病毒接種于單層FRhK4細(xì)胞后的增殖變化圖；
[0021] 圖2為免疫電鏡結(jié)果圖；
[0022] 圖3為對(duì)動(dòng)物攻毒后血液中轉(zhuǎn)氨酶含量變化圖；
[0023] 圖4為熒光定量PCR檢測份糞便中HAVRNA載量的結(jié)果圖；
[0024] 圖5為肝臟病理分析結(jié)果，圖A攻毒后旱獺肝臟病理分析結(jié)果，肝臟出現(xiàn)了細(xì)胞顆 粒樣變性；圖B為正常未攻毒旱獺肝臟病理分析結(jié)果。
[0025] 保藏說明：
[0026] 本發(fā)明中的甲型肝炎病毒株保藏編號(hào)為CGMCCN0. 11200,分類命名為！fepatitis Avirus。保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期：2015年9月29日。
[0027] 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】僅限于進(jìn)一步解釋和說明本發(fā)明，并不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu) 成限制。
【具體實(shí)施方式】 [0028] 實(shí)施例1
[0029] 病毒的分離和純化：
[0030] 1.取2g糞便加入到離心管中，10mlPBS(+)(含終濃度為100U/ml的青霉素、 100ug/ml的鏈霉素）在震蕩器上強(qiáng)力震蕩20分鐘。
[0031] 2. 4°C、8000RPM離心20分鐘，取上清作為粗純化病毒懸液。
[0032] 3.采用熒光定量PCR(探針法）檢測糞便病毒懸液中新型HAVRNA載量：所述的 熒光定量PCR
[0033] 3.蔗糖梯度離心
[0034] 利用蔗糖/甘油密度離心，38000rpm，離心6小時(shí)，收集甘油和30%蔗糖密度的樣 品，脫糖后作為純化后抗原。
[0035] 4.病毒序列的全基因組擴(kuò)增：
[0036] 在通過高通量測序獲得部分新型甲肝病毒序列的基礎(chǔ)上，通過Genomewalking Kit獲得6000bp的基因組，然后采用SMARTERRACEcDNAAmplificationKit擴(kuò)增 3' 末端 和5末端的獲得全基因組序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物對(duì)全基因組進(jìn)行長片段的驗(yàn)證，保證 序列的準(zhǔn)確性。
[0037] 經(jīng)檢驗(yàn)，其全基因序列如SEQIDN0:1所示。
[0038] 5.病毒的分離培養(yǎng)：上述粗純化病毒接種于單層FRhK4細(xì)胞，接種后每天收集 200微升細(xì)胞上清，培養(yǎng)到28天，用定量PCR檢測細(xì)胞上清中病毒，細(xì)胞雖為出現(xiàn)明顯CPE， 但細(xì)胞在培養(yǎng)過程中有增殖。病毒增殖含量變化圖如圖1所示。
[0039] 實(shí)施例2 :本發(fā)明的甲型肝炎病毒免疫小鼠制備抗血清及評(píng)價(jià)
[0040] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Balb/c小鼠，6周齡，共8只；
[0041] 將實(shí)施例1提純后定量的病毒皮下注射8只，首次劑量分別為1.0X105C〇pieS、 2. 5X104copies、1. 0X104copies、5. 0X103copies、1. 0X103copies、5. 0X102copies、 1. 5X102c〇pies/ml，每個(gè)劑量免疫1只小鼠（加相同體積弗氏完全佐劑），1只作為對(duì)照組， 兩周后劑量減半加強(qiáng)免疫一次（此時(shí)的佐劑為弗氏不完全佐劑），每只小鼠注射體積為100 微升純化病毒加100微升佐劑，采用多點(diǎn)注射方式。以PBS免疫組為對(duì)照，21天眼球采血， 收集血清備用；
[0042] 采用ELISA方法：將蔗糖/甘油純化病毒作為抗原包被96孔板，以小鼠免疫血清 作為一抗將蔗糖/甘油純化病毒作為抗原用包被液（20mMNaHC03pH9.0)稀釋，37°C包被 2h，PBS-T洗板3次，每孔加入200μ1 5%脫脂奶粉，37°C封閉lh，待檢測血清1:200稀釋后 加入包被好的板子，37°Clh;PBS-T洗3次，加入100μ1兔抗旱獺IgG(1:3000) 37°C，30min; PBS-T洗3次，TMB顯色lOmin;加入終止液50μ1終止反應(yīng)，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，450nm 波長測定吸光度；測定結(jié)果如表2所示：
[0043] 表2 :小鼠多克隆抗體制備
[0044]
[0045] 實(shí)施例3 :本發(fā)明的甲型肝炎病毒的免疫電鏡
[0046] 1.將純化病毒材料0. 9m