l，加1 :5~1 :10稀釋的上述小鼠免疫血清0. 1ml充分混 合；
[0047] 2.置37°C作用lh或37°Clh后再置4°C過夜；
[0048] 3.以 17,OOOr/min~23,OOOr/min離心 90min;
[0049] 4.吸去上清，將離心管口倒置于濾紙上，吸去殘留液體；
[0050] 5.沉淀物中加少量H20混懸，用3%磷鎢酸（ρΗ6· 0)負(fù)染20Sec~30Sec，滴加于 400目銅網(wǎng)Fomnvar膜上，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的負(fù)染液；
[0051] 6.在透射電鏡下4X104倍觀察。
[0052] 免疫電鏡結(jié)果顯示清晰的空殼和實(shí)心兩種類型的甲肝病毒顆粒，結(jié)果如圖2所 不。
[0053] 實(shí)驗(yàn)例4 :本發(fā)明的甲型肝炎病毒對(duì)旱獺感染性
[0054] 1.將蔗糖/甘油純化病毒接種后定量1X107C〇pieS/ml靜脈注射1只旱獺，1只 旱獺作為對(duì)照，靜脈注射PBS，分別在7、15、30、45天對(duì)采集旱獺靜脈血，分離血清，用生化 分析儀檢測(cè)檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平，在不同天數(shù)收集的血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 和谷草轉(zhuǎn)氨酶隨時(shí)間變化持續(xù)升高結(jié)果見圖3。
[0055] 2.采用ELISA方法檢測(cè)血清中HAV抗體水平：將純化病毒用包被液（20mM NaHC03pH9. 0)稀釋，37°C包被2h，PBS-T洗板3次，每孔加入200μ1 5%脫脂奶粉，37°C封 閉lh，待檢測(cè)血清1:200稀釋后加入包被好的板子，37°Clh;PBS-T洗3次，加入100μ1兔 抗旱獺IgG(1:3000) 37°C，30min;PBS-T洗3次，ΤΜΒ顯色lOmin;加入終止液50μ1終止反 應(yīng)，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，450nm波長測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組旱獺血清中抗新HAV 抗體為陽性，0D450為1. 98,對(duì)照組旱獺則為陰性。
[0056] 3.采用上述熒光定量PCR檢測(cè)份糞便中HAVRNA載量：結(jié)果如下：感染后旱獺的 在3天開始時(shí)即開始排毒，在8-10天時(shí)達(dá)到高峰期，排毒量達(dá)到10 9C〇pieS/ml，且持續(xù)排 毒，說明病毒在體內(nèi)復(fù)制出大量病毒顆粒，通過糞便排出體內(nèi)。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。
[0057] 4.病理檢測(cè)：將實(shí)驗(yàn)組旱獺45天處死收集肝臟，處死后肝臟用4%多聚甲醛固定， 觀察其肝臟病理變化，結(jié)果在肝臟有肝細(xì)胞出現(xiàn)顆粒樣變性。
[0058] 其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，其中A為實(shí)驗(yàn)組，B為空白對(duì)照組。
[0059] 實(shí)驗(yàn)例4 :甲型肝炎病毒疫苗的制備
[0060] 將保藏號(hào)為CGMCCN0. 11200的甲型肝炎病毒經(jīng)動(dòng)物感染后血液并經(jīng)純化、滅活等 工序，從而得到疫苗。
[0061] 其制備疫苗的另一種方法可將SEQIDN0 :1的全基因序列利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建 含有該病毒的病毒樣顆粒，然后轉(zhuǎn)染相應(yīng)的細(xì)胞等一系列程序得到所述基因工程疫苗。在 獲得細(xì)胞培養(yǎng)物基礎(chǔ)上，細(xì)胞培養(yǎng)物可經(jīng)減毒適應(yīng)后甲醛滅活、澄清過濾和超濾濃縮、蔗糖 密度離心純化、氫氧化鋁佐劑吸附抗原一系列程序獲得滅活的抗甲肝病毒疫苗。該疫苗經(jīng) 靜脈注射美洲旱獺后不出現(xiàn)甲肝病毒感染癥狀，且出現(xiàn)特異性抗體。
[0062] 血清中和抗體滴度測(cè)定：
[0063]血清按照 1 :4、1 :8、1 :16、1 :32、1 :64、1 :128、1 :256、1 :512、1 :1024 進(jìn)行稀釋，以 免疫PBS的為陰性血清；病毒液稀釋成100CCID50/0. 05ml，病毒梯度從0. 1CCID50/0. 05ml 到100CCID50/0. 05ml以10倍梯度稀釋，按照NXN的原則將每個(gè)稀釋度的血清與每個(gè)稀釋 度的病毒混合孵育后接種細(xì)胞，培養(yǎng)28天，每二天收集上清200微升，用于定量檢測(cè)，測(cè)定 旱獺血清中抗體滴度；
[0064] 上述抗原1/4、1/8、1/16稀釋后，7日齡免疫1針，對(duì)美州旱獺均出現(xiàn)良好的免疫保 護(hù)效果。
[0065] 實(shí)驗(yàn)例5:甲型肝炎病毒的抗體、雜交瘤細(xì)胞或抗血清的制備
[0066] 將保藏號(hào)為CGMCCN0.11200的甲肝病毒制備引發(fā)針對(duì)該甲肝病毒或異源核苷酸 序列的抗體，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)（例如，免疫親和層析、離心、沉淀等）分離的 抗體。
[0067] 通過將表達(dá)本發(fā)明甲肝病毒VLP顆粒與等體積的完全弗氏佐劑（Sigma)皮下注射 至三只小鼠而產(chǎn)生針對(duì)該甲肝病毒的抗血清。每只小鼠以隔兩周后再次接種，四周后收集 小鼠血清；這種小鼠抗體可以以下方式用于診斷目的或用作疫苗，可用作目標(biāo)抗體用于檢 測(cè)針對(duì)該病毒的特異性抗原。不完全弗氏佐劑（Sigma)可添加于隨后免疫中?？贵w效價(jià)測(cè) 定方法同滅活疫苗測(cè)定方法。
[0068] 實(shí)施例6:免疫診斷試驗(yàn)
[0069] 本實(shí)施例采用甲肝病毒抗原或其抗原性片段和甲肝病毒抗體或針對(duì)抗原片段的 抗體，用于免疫試驗(yàn)來檢測(cè)抗體水平或抗原水平。采用免疫試驗(yàn)，可以開發(fā)重組抗原。免疫 試驗(yàn)的方案可采用例如競(jìng)爭性、或直接反應(yīng)或夾心型試驗(yàn)。本實(shí)施例的試劑盒還可采用固 體支持物，或免疫沉淀法。本實(shí)施例中的甲肝病毒抗體或多肽可采用現(xiàn)有技術(shù)的方案進(jìn)行 標(biāo)記；標(biāo)記物選自熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射活性標(biāo)記或染料分子。擴(kuò)增探針信號(hào)可以 采用生物素和親和素的試驗(yàn)，酶標(biāo)記的和介導(dǎo)的免疫試驗(yàn)，如ELISA試驗(yàn)。將本發(fā)明的抗原 或者抗體以及進(jìn)行試驗(yàn)所需的其它試劑和材料（例如合適的緩沖液、鹽溶液等）和合適的 試驗(yàn)說明書包裝到合適的容器中，構(gòu)成適用于免疫診斷且含有適當(dāng)標(biāo)記的試劑盒。
[0070] 具體的：一種檢測(cè)甲肝病毒抗原的試劑盒，試劑盒中含有：固相甲肝病毒抗原包 被的孔板、封閉液、小鼠二抗、二次抗體酶結(jié)合物、TMB顯色液、顯色終止液、組織裂解液、濃 縮洗液、樣品稀釋液、陽性參考品和陰性參考品。其中，甲肝病毒抗原包被的孔板預(yù)先采用 甲肝病毒抗原進(jìn)行包被；封閉液為人血清白蛋白；樣品稀釋液為PBS;顯色終止液為濃硫 酸；濃縮洗液為吐溫-20 ;二次抗體酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶-羊抗鼠IgM酶結(jié)合物。
[0071] 實(shí)驗(yàn)例7:檢測(cè)甲型肝炎病毒核酸的試劑盒
[0072] 試劑盒采用引物和探針如表3所示：
[0073]表 3 :
[0074]
[0075] 試劑盒中上述引物退火溫度為58°C。
[0076] 實(shí)驗(yàn)例8 :本發(fā)明甲型肝炎病毒動(dòng)物模型的制備
[0077] 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備：1~3周歲的旱獺飼養(yǎng)；
[0078] 2.病毒的準(zhǔn)備和確定：取權(quán)利要求1中所述甲肝病毒陽性土撥鼠糞便中加入 PBS，制備1:10 (W/V)的糞便懸液，加入PBS體積1/10的氯仿，震蕩后8000rpm離心取上清 液，除去固體雜質(zhì)，上清液通過0. 22μm濾器，盡可能除去顆粒物雜質(zhì)，便懸液分裝后儲(chǔ)存 于-80°C冰箱備用。
[0079] 將上述便懸液提取核酸后采用上游引物：GATCCACAATATCCAGTTTGGG(SEQIDNO: 5);下游引物：CATGGTGTGCTACATTACTAGG(SEQIDN0:6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序，確定為權(quán)利要求1中所述甲肝病毒；
[0080] 3.病毒的定量：將便懸液提取核酸后，采用實(shí)施例6中的根據(jù)本發(fā)明中甲肝病毒 序列設(shè)計(jì)的引物和探針，用探針法熒光定量PCR對(duì)樣本甲肝病毒RNA定量后，換算后將便懸 液稀釋至IXl〇Vml后，儲(chǔ)存于-80°C冰箱備用；
[0081] 4.旱獺分組：5只為實(shí)驗(yàn)組，標(biāo)記為WC1、WC2、WC3、WC4、WC5,分別于7、15、30、45、 60、90天處死，1只為對(duì)照組，在90天處死；
[0082] 實(shí)驗(yàn)組旱獺靜脈注射病毒懸液200μ1，對(duì)照組一只旱獺靜脈注射PBS200μ1，感 染后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組旱獺在獨(dú)立通風(fēng)籠內(nèi)飼養(yǎng)，以保證每只旱獺之間無交叉感染的可 能，飼養(yǎng)一定時(shí)間后處死后對(duì)動(dòng)物模型的建立進(jìn)行評(píng)價(jià)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甲型肝炎病毒株，所述病毒株的保藏編號(hào)為CGMCCNO. 11200。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型甲型肝炎病毒株，其特征在于，所述的甲型肝炎病毒株 的全基因序列如SEQIDNO:1所不。3. 如權(quán)利要求1所述甲型肝炎病毒株在制備用于預(yù)防和/或治療甲型肝炎的藥物中的 應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物選自甲肝減毒活疫苗、甲肝滅活疫 苗、甲肝多肽疫苗或甲肝基因工程疫苗，所述的甲肝滅活疫苗包括亞單位疫苗。5. -種甲型肝炎的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有如權(quán)利要求1所述的甲型肝 炎病毒株；所述的疫苗優(yōu)選為甲肝減毒活疫苗、甲肝滅活疫苗、甲肝多肽疫苗或甲肝基因工 程疫苗，所述的甲肝滅活疫苗包括亞單位疫苗。6. -種用于制備抗體、雜交瘤細(xì)胞或抗血清的方法，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1所述 的病毒株、所述病毒株的裂解成份、所述病毒株的基因工程蛋白或所述病毒株的多肽為免 疫原進(jìn)行制備。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法得到的制備抗體、雜交瘤細(xì)胞或抗血清。8. 如權(quán)利要求1所述的甲型肝炎病毒株在制備甲型肝炎診斷制劑中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的診斷制劑包括抗原檢測(cè)試劑盒、抗 體檢測(cè)試劑盒和核酸檢測(cè)試劑盒。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗原檢測(cè)試劑盒中的抗原選自病 毒株、所述病毒株的裂解成份、所述病毒株的基因工程蛋白或病毒株的多肽；所述抗體檢測(cè) 試劑盒中的抗體選自所述病毒株、所述病毒株的裂解成份、所述病毒株的基因工程蛋白或 病毒株的多肽制備的單抗或多抗。
【專利摘要】本發(fā)明涉及病毒領(lǐng)域，具體講，涉及一種新型甲型肝炎病毒株及其應(yīng)用。該病毒株的保藏編號(hào)為CGMCC？NO.11200，全基因序列如SEQ？ID？NO：1所示。本發(fā)明還涉及該新型甲型肝炎病毒的應(yīng)用，包括制備用于預(yù)防和/或治療甲型肝炎的藥物中的應(yīng)用、制備甲肝病毒動(dòng)物模型中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防和/或治療甲型肝炎的疫苗、用于制備該病毒的抗體、雜交瘤細(xì)胞或抗血清的方法、以及檢測(cè)該甲型肝炎病毒株的試劑盒。CGMCC NO.1120020150929
【IPC分類】C12N7/00, G01N33/569, C12R1/93, C07K16/10, C12Q1/68, A61P31/14, C12Q1/70, A61K39/29
【公開號(hào)】CN105349500
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510836360
【發(fā)明人】段招軍, 虞結(jié)梅, 李利利, 敖元云
【申請(qǐng)人】中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
【公開日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年11月26日