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用于轉(zhuǎn)導(dǎo)脂肪組織的腺相關(guān)病毒載體的制作方法

文檔序號(hào):10556823閱讀:2790來(lái)源:國(guó)知局
用于轉(zhuǎn)導(dǎo)脂肪組織的腺相關(guān)病毒載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)導(dǎo)脂肪組織的腺相關(guān)病毒載體。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生這種腺相關(guān)病毒載體的多核苷酸、質(zhì)粒、載體和方法。本發(fā)明還涉及用于需要調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的疾病的治療的方法。DSM 2605820120608DSM 2605720120608
【專利說(shuō)明】
用于轉(zhuǎn)導(dǎo)脂肪組織的腺相關(guān)病毒載體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)導(dǎo)脂肪組織的腺相關(guān)病毒(AAV)載體。該載體可以以組織特異 性的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)白色或褐色脂肪組織。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪組織,除了其作為脂肪庫(kù)以及能量平衡的調(diào)節(jié)器的已知作用,近來(lái)已被認(rèn)為 是主要的新陳代謝和內(nèi)分泌器官。已經(jīng)提出,減損的白色脂肪組織(WAT)功能,以及降低的 褐色脂肪組織(BAT)活性或BAT質(zhì)量,是肥胖癥(肥胖,obseity)發(fā)展的主要因素。在這方面, 已經(jīng)所描述了人類的脂肪細(xì)胞和WAT功能障礙。此外,還報(bào)告了 BAT活性和體重指數(shù)(BMI)之 間的逆相關(guān)。參見(jiàn)Yee J等,Lipids Health Dis.2012,ll:19_30、Ichimura A等,Nature 2012;483:350_354、Mazzatti D等,Arch.Physiol.Biochem.2012;118(3):112_120、Cypess A等,N.Engl.J.Med.2009;360:1509_1517和van Marken Lichtenbelt W等, N.Engl.J.Med.2009;360:1500-1508。
[0003] 肥胖癥的發(fā)病在過(guò)去幾十年之中已經(jīng)顯著增加以致達(dá)到流行病的比例。據(jù)估計(jì)超 過(guò)5億人是肥胖的。肥胖癥是現(xiàn)今主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。參見(jiàn)IASO, "Global Prevalence of Adult Obesity,Report IOTF 2008"(1厶50兒〇11(1〇11,68,2009)。肥胖癥自身增加死亡的風(fēng)險(xiǎn) 并且與胰島素耐受性和2型糖尿病長(zhǎng)期強(qiáng)烈相關(guān)。參見(jiàn)P e e t e r s A等, Ann · Intern .Med · 2003; 138:24-32和Moller D等,N· Engl · J ·Med · 1991; 325:938-948。此外, 脂肪細(xì)胞的功能障礙和肥胖癥對(duì)于特定類型的癌癥和許多其他嚴(yán)重的疾病,如心臟病、免 疫功能障礙、高血壓、關(guān)節(jié)炎和神經(jīng)退行性疾病而言也是顯著的風(fēng)險(xiǎn)因素。見(jiàn)Roberts D等, Annu·Rev.Med·2010;61:301_316、Spiegelman B等,J·Biol·Chem.1993;268(10):6823-6826和Whitmer R等,Curr.Alzheimer Res.2007;4(2):117-122。
[0004] 飲食和鍛煉是肥胖癥的主要治療方法,但是越來(lái)越多的患者還需要藥物治療干預(yù) 以降低并保持體重。然而,藥物治療不會(huì)引發(fā)非自愿的或顯著的體重減輕,并且此外,抗肥 胖藥物經(jīng)常由于它們的全身作用表現(xiàn)出嚴(yán)重的副作用。因此,存在對(duì)于預(yù)防并對(duì)抗當(dāng)前的 肥胖癥流行的新的和安全的途徑的急切的需要。在這方面,闡明肥胖癥基礎(chǔ)的病理事件對(duì) 于開(kāi)發(fā)新的抗肥胖癥療法是至關(guān)緊要的。候選基因在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移至白色和褐色脂肪組織 可以提供巨大的潛力以了解肥胖癥的發(fā)病和發(fā)作之下的分子機(jī)制。此外,目標(biāo)為脂肪細(xì)胞 的基因治療途徑可以為未來(lái)的肥胖癥及其相關(guān)的失調(diào)的治療,同時(shí)最小化全身的反應(yīng)開(kāi)創(chuàng) 新的機(jī)會(huì)。然而,迄今為止轉(zhuǎn)移至白色和褐色脂肪組織的有效的和特定的基因仍然難以確 定。
[0005] 最近,當(dāng)血清型1的AAV(AAVl)與非離子表面活性劑或雷公藤紅素結(jié)合時(shí),示出其 適度感染的小鼠體內(nèi)的歡1'。見(jiàn)組2111?111^!1等,!111111.66116 11^^.2006;17:921-928和21^即? 等,Gene 11^^.2011;18:128-134。已經(jīng)報(bào)告其他44¥血清型,如44¥6、44¥7、44¥8或44¥9是高 度感染性的,但是它們的脂肪轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是不清楚的。參見(jiàn)G a 〇 G等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002;99:11854-11859、Nakai Η等,J.Virol.2005;79:214-224、 Pacak C等,Circ.Res.2006;99:e3-e9、Broekman Μ等,Neuroscience 2006;138:501-510、 Wang Z等,Diabetes 2006;55:875_884、Taymans J等,Hum.Gene Ther.2007;18:195-206、 Bish L等,Hum.Gene Ther.2008;19:1359-1368和Lebherz C等,J.Gene Med.2008;10:375-382。因此,在本領(lǐng)域中存在對(duì)于開(kāi)發(fā)使脂肪組織特定轉(zhuǎn)導(dǎo),以及,此外使特定類型的脂肪細(xì) 胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及使感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)移至特定類型的脂肪細(xì)胞并且使它們表達(dá)的 腺相關(guān)病毒載體(AAV)。本發(fā)明的脂肪組織特異調(diào)控元件的使用限制感興趣的多核苷酸在 白色脂肪組織或褐色脂肪組織中的表達(dá)。此外,已經(jīng)證明本發(fā)明的載體對(duì)于脂肪組織相關(guān) 的疾病,如,例如2型糖尿病的治療是有用的。本發(fā)明的發(fā)明方面在權(quán)利要求中公開(kāi)。
[0007] 微生物保藏
[0008] 質(zhì)粒 pAAV-mini/aP2-null 和pAAV-mini/UCPl-null 在 2012年6 月8 日分別以登錄號(hào) DSM 26057和DSM 26058保藏于DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),InhoffenstraPe 7 B,D_38124 Braunschweig,德意志聯(lián)邦共和國(guó)。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1.通過(guò)AAV的eWAT內(nèi)部給予的白色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。A-B.在用血清型1、2、4和5 (A)的AAV-CAG-GFP與普蘭尼克F88(Pluronics F88)-起或不與普蘭尼克F88(Pluronics F88)-起處理eWAT的部分和用血清型6、7、8和9(B)的AAV-CAG-GFP處理eWAT的部分中針對(duì) 綠色熒光蛋白(GFP,綠色)的免疫染色。藍(lán)色,細(xì)胞核。箭頭表示轉(zhuǎn)導(dǎo)的脂肪細(xì)胞。初始放大 倍數(shù)100X(B,左側(cè)圖片)和200X(A;B,右側(cè)圖片)<X.用血清型1、6、7、8、S^9AAV-CAG-GFP 處理的eWAT中的GFP含量(n = 5每組)。示出的值是平均值土SEMALU,相對(duì)光單位(relative light unit) 接收AAV8-CMV-LacZ的eWAT的全部X-gal著色。X-gal著色分布貫穿整個(gè)轉(zhuǎn) 導(dǎo)的eWAT。相反地,在來(lái)自用生理鹽水溶液處理的動(dòng)物的eWAT中沒(méi)有檢測(cè)到X-gal著色。E. 由用AAV9-CMV-mHKII或AAV〇-CMV-null載體處理的動(dòng)物的eWAT獲得的分離細(xì)胞中的相對(duì) mHKII表達(dá)水平。F.由來(lái)自用AAV9-CMV-nul 1和AAV-CMV-mHKII注射的小鼠的分離的脂肪細(xì) 胞攝取的基礎(chǔ)的和胰島素刺激的2[1-3H]脫氧-D-葡萄糖。脂肪細(xì)胞獲得自至少5小鼠/組。 G.在2 X 10nvg的AAV8或AAV9-CAG-GFP載體的iWAT內(nèi)部給予兩個(gè)星期之后在腹股溝白色脂 肪組織(iWAT)部分中的針對(duì)GFP(棕色)的免疫染色。初始放大倍數(shù)ΧΙΟΟ。!!:注射2X10 nvg 的AAV8或AAV9-CAG-GFP后兩個(gè)星期iWAT中的GFP表達(dá)水平(η = 6)。示出的值是平均值土 SEMjpfO · 05、#ρ〈0 · 01并且*#ρ〈0 · 001;在相同的胰島素濃度下相對(duì)于AAV9-CMV-null#p〈 0.05。所有的分析是在2 X H^vg/eWAT的eWAT內(nèi)部給予之后兩個(gè)星期進(jìn)行的。
[0010] 圖2.通過(guò)mini/aP2調(diào)控區(qū)的AAV的eWAT內(nèi)部給予之后白色脂肪細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn) 導(dǎo)。A.在接收1012vg/eWAT的AAV8和AAV9-mini/aP2-GFP載體的eWAT中針對(duì)GFP(棕色)的免疫 染色。分析是在注射后兩個(gè)星期進(jìn)行的。初始放大倍數(shù)X40(KB.循環(huán)hSeAP水平。將4X l〇 12vg八鼠的劑量的AAV9-mini/aP2-hSeAP載體雙側(cè)注射入eWAT并在注射后的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn) 行循環(huán)hSeAP水平的測(cè)量。RLU,相對(duì)光單位。示出的值是平均值土 SEM。η = 3 (生理鹽水)以及 n = 4(AAV9-mini/aP2-SeAP)<X.4X1012vg 八鼠的 AAV9-mini/aP2-hSeAP 的 eWAT 內(nèi)部給予一年 后,肝臟和eWAT中的相對(duì)hSeAP表達(dá)水平。D.在AAV9-mini/aP2-null和AAV9-mini/aP2-mHKII載體的eWAT內(nèi)部給予(1.4X10 12vg八鼠)兩個(gè)星期后評(píng)估由eWAT、iBAT和心臟的體內(nèi)2-[1 -?]脫氧-D-葡萄糖攝取。示出的值是平均值土 SEM。11 = 7只小鼠每組。*p〈0.05。
[0011] 圖3.通過(guò)AAV的iBAT內(nèi)部給予的棕色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。A.在用2 X 109vg八鼠的AAV8 或AAV9-CAG-GFP處理的iBAT的部分中,針對(duì)GFP(棕色)的免疫染色。初始放大倍數(shù)X 200和 X 400(小圖)J.接收2 X 109vg八鼠的AAV8或AAV9-CAG-GFP的iBAT中的相對(duì)GFP表達(dá)水平。示 出的值是平均值土 SEMm = 5只小鼠每組。*p〈0.05。C.接收2 X 101Qvg八鼠的AAV4或AAV8-CMV-RFP或 2 X 1010 vg 八鼠的 AA V1、AA V2、AAV5、AAV6、AAV7、AA V8、或 AAV9-CMV-RFP 的 i BAT 中的相對(duì) 紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)水平。轉(zhuǎn)導(dǎo)模式與eWAT相似。參見(jiàn)圖1<^4¥6^4¥7^4¥8和44¥9是用 于轉(zhuǎn)導(dǎo)iBAT最高效的血清型。D.在用10 nvg八鼠的AAV9-CMV-RFP處理的iBAT的部分中針對(duì) RFP(棕色)的免疫染色。初始放大倍數(shù)X 200和X 400(小圖)。分析是在給予AAV后兩個(gè)星期 進(jìn)行的。
[0012] 圖4.通過(guò)mini/UCPl調(diào)控區(qū)的AAV的iBAT內(nèi)部給予之后棕色脂肪細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn) 導(dǎo)。A.通過(guò)注射2X10nvg八鼠的AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP載體后兩個(gè)星期針對(duì)GFP(棕色) 的免疫染色評(píng)估棕色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。初始放大倍數(shù)X 200和X 400(小圖)在給予AAV8-mini/UCPl-null 和 AAV8-mini/UCPl-mHKII 載體(7X101Qvg 八鼠)之后兩個(gè)星期由 iBAT、eWAT 和心臟攝取的體內(nèi)2-[1-3!1]脫氧-0-葡萄糖。11 = 6(六六¥8-111;[11;[/1]0?111服11)以及11=10 (AAV8-mini/UCPl-null)只小鼠每組。C-E.遞送 2X10nvg 八鼠的 AAV9-mini/UCPl-mVEGFi64 或 AAV9-mini/UCPl-null載體之后兩個(gè)星期,iBAT中的相對(duì)mVEGFi64(C)、總mVEGF(D)和 mPECAMl (E)表達(dá)水平。n = 5 只小鼠每組。F.注射 2 X 10nvg 八鼠的 AAV9-mini/UCPl-mVEGFi64 或 AAV9-mini/UCPl-null載體后兩個(gè)星期,iBAT中針對(duì)α-SMA(棕色)的免疫染色。初始放大倍 數(shù)X 400。示出的值是平均值+SEM<3*p〈0.05。紅色箭頭指示毛細(xì)結(jié)構(gòu)。
[0013] 圖5.通過(guò)AAV載體全身遞送至瘦鼠的白色和棕色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。A. eWAT部分中 針對(duì)GFP (綠色)的免疫染色。藍(lán)色,細(xì)胞核。初始放大倍數(shù)X 100 (左側(cè)圖片)和X 200 (右側(cè)圖 片)。B. eWAT中的相對(duì)GFP表達(dá)水平。C. eWAT中的GFP含量。D. iBAT部分中針對(duì)GFP(棕色)的免 疫染色。初始放大倍數(shù)X 200和X400(小圖)J. IBAT中的相對(duì)GFP表達(dá)水平。F. iBAT中的GFP 含量。G-H.將載體靜脈(iv)給予至ICR小鼠(G)和C57B16小鼠(H) (ICR:對(duì)AAV8n = 3并且對(duì)于 AAV9n = 5; C57B16: η = 4)之后,腹股溝(iWAT)、腹膜后(rWAT)、腸系膜(mWAT)、eWAT和iBAT中 的相對(duì)GFP表達(dá)水平。所有的分析是在5 X 1012 vg八鼠的AAV8或AAV9-CAG-GFP載體的尾部靜脈 給予之后兩個(gè)星期進(jìn)行的。AU,任意單位。RLU,相對(duì)光單位。
[0014] 圖6.通過(guò)全身給予mini/UCPl調(diào)控區(qū)的AAV之后,棕色脂肪細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)。A. 在接收AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP載體的iBAT中,針對(duì)GFP(棕色)的免疫染色。初始放大倍 數(shù)X 200和X 400(小圖)J-C·在注射兩個(gè)月后用2 X 1012vg小鼠的AAV9-mini/UCPl-mVEGFi64 或 AAV9-mini/UCPl-null 處理的 iBAT 中的相對(duì) mVEGFi64(B)和總 mVEGF(C)表達(dá)水平。D-E.在 靜脈給予 8X1012vg 的 AAV9-mini/UCPl-VEGFi64 或 AAV9-mini/UCPl-null(n = 5)-個(gè)月后, iBAT中的VEGF164(B)和PECAMl(C)表達(dá)水平。F-G.在與B-C相同的組中針對(duì)CD105(棕色)(D) 和a-SMA(棕色)(E)的免疫染色。紅色箭頭指示血管。初始放大倍數(shù)X 400和X 1000(小圖)。 示出的值是平均值+SEM。!! = 5只小鼠每組,*p〈0.05。
[0015]圖7.AAV的全身給予之后通過(guò)mini/aP2調(diào)控區(qū)和脂肪限制的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的脂肪細(xì) 胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。A.在來(lái)自接收AAV8或AAV9-mini/aP2-GFP載體的動(dòng)物的iBAT部分中,通過(guò)針對(duì) GFP(棕色)的免疫染色評(píng)估棕色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。初始放大倍數(shù)X 200和X 400(小圖)3-C. 注射兩個(gè)星期后通過(guò)針對(duì)GFP(棕色)的免疫染色評(píng)估非脂肪組織的轉(zhuǎn)導(dǎo)。GFP表達(dá)在用AAV8 或AAV9-mini/aP2-GFP(B)和AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP(C)處理的動(dòng)物的肝臟中是最小的 并且不存在于心臟中。初始放大倍數(shù)X 100和X 400(小圖)。所有的分析是在2 X 1012vg八鼠的 全身注射兩個(gè)星期后進(jìn)行的。
[0016] 圖8.AAV的eWAT內(nèi)部給予后,脫靶(off-target)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。A.來(lái)自接收AAV9-CAG-GFP的動(dòng)物的iBAT中的針對(duì)GFP(棕色)的免疫染色。初始放大倍數(shù)X 200和X 400 (小 圖)J.在來(lái)自用AAV9-CAG-GFP處理的動(dòng)物的iBAT和eWAT中的相對(duì)GFP表達(dá)水平。示出的值 是平均值土 SEM。η = 5只小鼠每組。*p〈0.05。C.通過(guò)針對(duì)GFP (綠色)的免疫染色評(píng)估非動(dòng)物 脂肪器官的轉(zhuǎn)導(dǎo)。GFP表達(dá)在來(lái)自用AAV7、AAV8、或AAV9注射的動(dòng)物的心臟和肝臟中是明顯 的。初始放大倍數(shù)X 100。在AAV-CAG-GFP載體(4X 10nvg小鼠)的eWAT內(nèi)部給予兩個(gè)星期后 進(jìn)行分析。
[0017]圖9.通過(guò)mini/aP2調(diào)控區(qū)的脂肪組織限制的AAV-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在1012vg的 AAV8和AAV9-mini/aP2-GFP載體的局部eWAT內(nèi)部給予兩個(gè)星期后,在肝臟和心臟中通過(guò)針 對(duì)GFP的免疫染色沒(méi)有檢測(cè)到GFP表達(dá)。初始放大倍數(shù)X 100。
[0018]圖10.通過(guò)AAV載體的iBAT內(nèi)部給予的非動(dòng)物脂肪器官的轉(zhuǎn)導(dǎo)。注射兩個(gè)星期后通 過(guò)針對(duì)GFP(棕色)的免疫染色評(píng)估非脂肪器官的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在來(lái)自用2X109vg八鼠的AAV8和 AAV9-CAG-GFP載體iBAT內(nèi)部注射的動(dòng)物的心臟和肝臟中GFP的表達(dá)是明顯的。初始放大倍 數(shù) X200。
[0019]圖11.AAV的iBAT內(nèi)部給予之后借助通過(guò)mini/aP2調(diào)控區(qū)和脂肪限制的轉(zhuǎn)基因表 達(dá)的棕色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。A. 2 X 10nvg八鼠的AAV9-mini/aP2-GFP載體的iBAT內(nèi)部遞送兩個(gè) 星期后通過(guò)針對(duì)GFP的免疫染色(棕色)評(píng)估棕色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。初始放大倍數(shù)X 200和X 400(小圖將AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP載體(2X10nvg八鼠)局部注射iBAT兩個(gè)星期后 通過(guò)針對(duì)GFP(棕色)的免疫染色評(píng)估非脂肪器官的轉(zhuǎn)導(dǎo)。肝臟中的GFP表達(dá)較少。初始放大 倍數(shù)X 1 〇〇和X 400 (小圖)。
[0020] 圖12.AAV的尾部靜脈遞送之后廣泛的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。通過(guò)尾部靜脈注射5X1012vg/ 鼠的AAV9-CAG-GFP載體兩個(gè)星期后,針對(duì)GFP(綠色)的免疫染色顯示出肝臟、心臟、骨骼肌、 睪丸和腎臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)。藍(lán)色,細(xì)胞核。初始放大倍數(shù)X 200。
[0021] 圖13 . AAV載體全身給予至肥胖-糖尿病小鼠之后WAT和BAT的轉(zhuǎn)導(dǎo)。A-B .將3 X l〇12vg的AAV8或AAV9-CAG-GFP載體靜脈給予至ob/ob(A)和db/db小鼠(B)之后附睪白色脂肪 組織(eWAT)、腹股溝白色脂肪組織(iWAT)和肩胛間褐色脂肪組織(iBAT)部分中針對(duì)GFP(棕 色)的免疫染色。初始放大倍數(shù)X 200。(ob/ob:n = 4;db/db:n = 4) <X-D.在來(lái)自ob/ob(C)和 db/db小鼠(D)的相同組的腹股溝(iWAT)、腹膜后(rWAT)、腸系膜(mWAT)、eWAT和iBAT庫(kù)中的 GFP表達(dá)。AU,任意單位。所有的分析是在載體遞送兩個(gè)星期后進(jìn)行的。示出的值是平均值± SEM。相對(duì)于AAV9*p〈0 · 05。
[0022] 圖14.用mirT序列的肝臟和心臟的高效脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的去靶(脫靶, de-targeting)。靜脈注射 1012vg 的 AAV9-CAG-GFP、AAV9-CAG-GFP-miRT122、AAV9-CAG-GFP-miRTl或AAV9-CAG-GFP-雙miRT載體兩個(gè)星期后附睪白色脂肪組織(eWAT)、腹股溝白色脂肪 組織(iWAT)、肩胛間褐色脂肪組織(iBAT)、肝臟和心臟中的GFP免疫染色。初始放大倍數(shù)X 1〇〇(肝臟和心臟)、X 200(eWAT和iWAT)和 X 400( iBAT和小圖)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明公開(kāi)了當(dāng)局部給予時(shí),能夠高效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移至WAT或BAT的基于AAV6、 AAV7、AAV8和AAV9血清型的腺相關(guān)病毒載體。參見(jiàn)圖1B和1C和圖3A-3D。這些載體的全身給 予還導(dǎo)致至WAT和BAT二者中高效的基因遞送。參見(jiàn)圖5A和?。雖然由AAV8和AAV9載體介導(dǎo) 的基因遞送是高效的,其不局限于脂肪組織。本發(fā)明公開(kāi)了AAV8和AAV9載體與脂肪組織特 異啟動(dòng)子區(qū)的組合使脂肪組織中感興趣的多核苷酸特定表達(dá)。特別地,AAV8或AAV9的局部 給予包含表達(dá)框(表達(dá)盒,expression cassette),其中,在mini/aP2調(diào)控區(qū)控制下的異源 基因(例如GFP)導(dǎo)致其在WAT中的表達(dá)而沒(méi)有在肝臟或心臟中的表達(dá)。參見(jiàn)圖2A和圖9。此 外,AAV8或AAV9的局部給予包含表達(dá)框,其中,在mini/UCPl調(diào)控區(qū)控制下的異源基因(例如 GFP)導(dǎo)致其在BAT中表達(dá)而沒(méi)有在心臟中表達(dá)以及僅較少的肝臟表達(dá)。參見(jiàn)圖4A和11B。因 此,通過(guò)本發(fā)明的載體和啟動(dòng)子形成的組合的局部給予提供了用于治療多種疾病的基于體 內(nèi)脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的安全機(jī)制。
[0024]此外,本發(fā)明的組合的全身給予構(gòu)成了用于脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的替代途徑。在這方 面,本發(fā)明公開(kāi)了 AAV8或AAV9-mini/UCPl和AAV9或AAV9-mini/aP2組合的全身給予對(duì)于分 別轉(zhuǎn)導(dǎo)BAT和WAT是高效的。參見(jiàn)圖6A和7A。無(wú)論使用哪兩種調(diào)控區(qū),本發(fā)明的組合的全身給 予導(dǎo)致脂肪組織中感興趣的多核苷酸的高度受限的表達(dá),而沒(méi)有心臟中的表達(dá)且肝臟中僅 較少的表達(dá)。參見(jiàn)圖7B和圖7C。
[0025] 1.通用術(shù)語(yǔ)和表達(dá)的定義
[0026] 如在本文中可互換地使用的術(shù)語(yǔ)"腺相關(guān)病毒"、"AAV病毒"、"AAV病毒粒子"、"AAV 病毒顆粒"和"AAV顆粒"是指由至少一種AAV衣殼蛋白(優(yōu)選地全部由特定AAV血清型的衣殼 蛋白)和衣殼化的多核苷酸AAV基因組組成的病毒顆粒。如果該顆粒包含由AAV末端反向重 復(fù)序列側(cè)接的異源多核苷酸(即非野生型AAV基因組的多核苷酸,如轉(zhuǎn)基因遞送至哺乳動(dòng)物 細(xì)胞),其通常稱作"AAV載體顆粒"或"AAV載體"。AAV是指屬于依賴病毒屬細(xì)小病毒科的病 毒。AAV基因組為大約4.7千堿基長(zhǎng),并且由可以是正或負(fù)向的單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)組 成。該基因組在DNA鏈兩端包含末端反向重復(fù)序列(ITR),和兩種開(kāi)放閱讀框(0RF):rep和 cap dep框架由四個(gè)編碼AAV生命周期所需的Rep蛋白質(zhì)的重疊基因形成。cap框架含有衣殼 蛋白的重疊核苷酸序列:VP1、VP2和VP3,它們共同交互以形成二十面體對(duì)稱的衣殼。參見(jiàn) Carter B,Adeno-associated virus and adeno-associated virus vectors for gene delivery、Lassic D等,Eds·,"Gene Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies" (Marcel Dekker,Inc.,New 丫〇4,階,1^,2000)和6&〇6等,了.¥化〇1.2004;78(12):6381-6388〇
[0027] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"腺相關(guān)病毒ITR"或"AAV ITR"是指存在于腺相關(guān)病毒的基 因組的DNA鏈兩端的末端反向重復(fù)序列。ITR序列是AAV基因組的高效增殖所需的。這些序列 的另一特性是它們形成發(fā)夾的能力。此特性有助于其自身引導(dǎo)(self-priming),這允許不 依靠引發(fā)酶的第二DNA鏈的合成。還示出ITR對(duì)于野生型AAV DNA整合至宿主細(xì)胞基因組(即 人類的第19染色體)并從其中拯救,以及對(duì)于與產(chǎn)生的完全組裝的,耐脫氧核糖核酸酶的 AAV顆粒結(jié)合的AAV DNA的高效衣殼化是必需的。
[0028] 如在本文中使用的術(shù)語(yǔ)"AAV2"是指具有在GenBank登錄號(hào)NC001401中限定的具有 基因組序列的腺相關(guān)病毒的血清型。
[0029] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"AAV載體"進(jìn)一步指包含一種或多種由AAV末端重復(fù)序列 (ITR)側(cè)接的感興趣的多核苷酸(或轉(zhuǎn)基因)的載體。當(dāng)這類AAV載體存在于宿主細(xì)胞時(shí),它 們可以復(fù)制并包裝為感染性病毒顆粒,該宿主細(xì)胞已經(jīng)用可以編碼并表達(dá)rep和cap基因產(chǎn) 物(即AAV Rep和Cap蛋白質(zhì))的載體轉(zhuǎn)染,并且其中,宿主細(xì)胞已經(jīng)用編碼和表達(dá)來(lái)自腺病 毒開(kāi)放閱讀框E4orf6的蛋白質(zhì)的載體轉(zhuǎn)染。當(dāng)AAV載體結(jié)合至更大的多核苷酸中(例如,染 色體或另一載體,如用于克隆或轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒)時(shí),則該AAV載體通常稱作"蛋白-載體(pro-vector)"。該蛋白-載體可以通過(guò)在AAV包裝功能和由E4orf6提供的必要的輔助功能存在下 的復(fù)制和衣殼化來(lái)獲得"拯救"。
[0030] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"脂肪組織"是指由成熟的脂肪細(xì)胞(即脂細(xì)胞(fat cell)) 以及小血管、神經(jīng)組織、淋巴結(jié)和基質(zhì)血管成分(SVF)的組合組成的組織。SVF是由內(nèi)皮細(xì) 胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞前體細(xì)胞(即前脂肪細(xì)胞)和免疫細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞組成 的。在哺乳動(dòng)物中,兩種不同類型的脂肪組織通常區(qū)分為:白色脂肪組織(WAT)和褐色脂肪 組織(BAT)。脂肪組織主要作用為以脂肪的形式儲(chǔ)存能量、通過(guò)非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱產(chǎn)生熱量以及分 泌脂肪因子。
[0031] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"脂肪組織細(xì)胞"或"脂肪細(xì)胞"是指包含脂肪組織,并且特異 化為作為脂肪儲(chǔ)存能量,或通過(guò)非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱產(chǎn)生熱量,并且分泌脂肪因子的細(xì)胞類型。脂肪 組織細(xì)胞包括白色脂肪細(xì)胞和褐色脂肪細(xì)胞。
[0032] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"脂肪組織特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)"是指用作啟動(dòng)子(即調(diào)節(jié)可操作 地與啟動(dòng)子連接的選擇的核酸序列的表達(dá))的核酸序列,并且其影響選擇的核酸序列在特 定組織細(xì)胞,如脂肪細(xì)胞中的表達(dá)。脂肪組織特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可以是組成性的或可誘導(dǎo)的。
[0033] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"堿性磷酸酶"或"AP"是指催化來(lái)自許多類型的分子,包括核苷 酸、蛋白質(zhì)和生物堿的磷酸酯基團(tuán)的水解的酶(EC 3.1.3.1)。
[0034]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"血管發(fā)生(angiogenesis)"是指由其他預(yù)先存在的血管形 成新的血管的過(guò)程,并且包括血管生成(vasculogenesis)和動(dòng)脈生成(arteriogenesis)。
[0035] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"動(dòng)脈生成"是指具有平滑肌介質(zhì)層的血管的形成、生長(zhǎng)或發(fā) 育。
[0036] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"褐色脂肪組織細(xì)胞"或"褐色脂肪細(xì)胞"是指多邊形的脂肪 細(xì)胞的類型,并且其特征在于將脂質(zhì)積聚為多個(gè)較小的"多腔"液滴,以及它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)內(nèi) 大量的具有層狀脊堆疊的大型線粒體。不同于白色脂肪細(xì)胞,這些細(xì)胞具有相當(dāng)多的細(xì)胞 質(zhì)。細(xì)胞核是圓形的,并且雖然其位置偏離中心,但不在細(xì)胞的外周。棕色脂肪細(xì)胞的眾多 線粒體和棕色脂肪庫(kù)豐富的血管分布是BAT為棕色顏色的主要原因。棕色脂肪細(xì)胞位于典 型的BAT庫(kù)中并且負(fù)責(zé)通過(guò)非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱產(chǎn)生熱量。參見(jiàn)Enerback S,N.Engl.J.Med.2009; 360:2021-2023。
[0037] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"CAG調(diào)控區(qū)"是指由巨細(xì)胞病毒的早期增強(qiáng)子元件和雞β-肌 動(dòng)蛋白啟動(dòng)子形成的組合。參見(jiàn)Alexopoulou Α等,BMC Cell Biology 2008;9(2): 1-11。
[0038] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"cap基因"或"AAV cap基因"是指編碼Cap蛋白的基因。如本 文中使用的術(shù)語(yǔ)"Cap蛋白"是指具有至少一種天然AAV Cap蛋白(例如,VP1、VP2、VP3)的功 能活性的多肽。Cap蛋白(例如,VP1、VP2、VP3)的功能活性的實(shí)例包括誘導(dǎo)衣殼的形成的能 力、促進(jìn)單鏈DNA的積聚、促進(jìn)AAV DNA包裝進(jìn)入衣殼(即衣殼化)、結(jié)合至細(xì)胞受體并促進(jìn)病 毒粒子進(jìn)入宿主。
[0039] 如在本文中使用的術(shù)語(yǔ)"衣殼"是指其中包裝病毒基因組的結(jié)構(gòu)。衣殼由多種通過(guò) 蛋白形成的低聚構(gòu)造亞單元構(gòu)成。例如,AAV具有通過(guò)三種衣殼蛋白:VP1、VP2、VP3的交互形 成的二十面體衣殼。
[0040] 如在本文中使用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞成分"是指包含本發(fā)明的脂肪細(xì)胞和至少另一種組 分的材料復(fù)合物。該成分可以配制為單個(gè)制劑或可能呈現(xiàn)為各個(gè)組分的單獨(dú)制劑,其可以 結(jié)合為聯(lián)合制劑用于聯(lián)合使用。該組合物可以是其中每種組分單獨(dú)配制并包裝的套裝試劑 盒(kit-〇f-parts)〇
[0041] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"組成型啟動(dòng)子"是指其活性在生物體的所有細(xì)胞中,或在大 部分的發(fā)育階段過(guò)程中維持在相對(duì)恒定水平的啟動(dòng)子,以及與細(xì)胞環(huán)境條件關(guān)聯(lián)較少或不 相關(guān)。
[0042] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)子"是指轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合至其中以增加基因轉(zhuǎn)錄的DNA序 列元件。
[0043] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"表達(dá)框"是指用一系列特化的核酸元件重組地或合成地生 成的核酸構(gòu)結(jié)構(gòu),其允許特定的核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。
[0044] 如在本文中使用的術(shù)語(yǔ)"提供輔助功能的基因"是指編碼進(jìn)行這樣的功能的多肽 的基因,AAV依賴于該功能(即"輔助功能")進(jìn)行復(fù)制。輔助功能包括對(duì)于AAV復(fù)制,包括,但 不限于涉及AAV基因轉(zhuǎn)錄的激活、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA復(fù)制、cap表達(dá)產(chǎn)物的 合成和AAV衣殼組裝那些部分所必需的那些功能?;诓《镜母綄俟δ芸梢栽醋匀魏我阎?的輔助病毒,如腺病毒、皰疹病毒(而非1型單純皰疹病毒)和牛痘病毒。輔助功能包括但不 限于,腺病毒El、E2a、VA和E4或皰疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29以及皰疹病毒聚合酶。
[0045]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"己糖激酶"或"HK"是指催化己糖的磷酸化以形成磷酸己糖 的酶。在大部分生物體中,葡萄糖是HK的主要底物,并且葡萄糖-6-磷酸酯是最重要的產(chǎn)物。 [0046] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"高血壓(high blood pressure)"或"高動(dòng)脈壓(arterial hypertension)"是指其中動(dòng)脈的血壓升高的醫(yī)學(xué)狀況。血壓包括兩種測(cè)量,收縮和舒張,其 取決于心肌在搏動(dòng)之間是否收縮(心臟收縮)或放松(心臟舒張)。靜止時(shí)的正常血壓在100-140mmHg收縮(最高讀數(shù))以及60-90mmHg舒張(最低讀數(shù))的范圍內(nèi)。如果其持續(xù)位于140/ 90mmHg或以上,則稱為存在高血壓癥。高血壓(Hypertension)分類為原發(fā)性(自發(fā)性)高血 壓和繼發(fā)性高血壓;約90-95 %的情況歸類為"原發(fā)性高血壓",這是指沒(méi)有明顯的潛在醫(yī)學(xué) 起因的高血壓癥。其余5-10%的情況(即繼發(fā)性高血壓)是由其他影響腎臟、動(dòng)脈、心臟或內(nèi) 分泌系統(tǒng)的條件引起的。肥胖癥中常見(jiàn)的胰島素耐受性也認(rèn)為促進(jìn)了高血壓。高血壓是中 風(fēng)、心肌梗塞(即心臟病發(fā)作)、心力衰竭、動(dòng)脈的動(dòng)脈瘤(例如,主動(dòng)脈瘤)、外周動(dòng)脈疾病的 主要風(fēng)險(xiǎn)因素并且是慢性腎病的起因。即使中度的動(dòng)脈血壓升高也與預(yù)期壽命的縮短相 關(guān)。
[0047]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"高血糖"是指與空腹基準(zhǔn)水平相比,其中出現(xiàn)異常的高血糖 水平的狀態(tài)。特別地,高血糖理解為當(dāng)空腹血液葡萄糖水平始終高于126mg/dL,餐后葡萄糖 水平高于140mg/dL時(shí),或給予每公斤體重1.75克的劑量的葡萄糖2小時(shí)之后靜脈血漿中的 葡萄糖水平超過(guò)200mg/dL時(shí)發(fā)生。
[0048]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"胰島素耐受性"是指其中細(xì)胞不正確地對(duì)胰島素響應(yīng)的失 調(diào)。結(jié)果是,身體響應(yīng)于高血液葡萄糖水平而產(chǎn)生更多的胰島素。具有胰島素耐受性的患者 經(jīng)常表現(xiàn)出高葡萄糖水平和高循環(huán)胰島素水平。胰島素耐受性經(jīng)常與肥胖癥、高血壓和高 血脂相關(guān)。此外,胰島素耐受性經(jīng)常出現(xiàn)在具有2型糖尿病的患者中。
[0049]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"局部給予"是指將本發(fā)明的多核苷酸、載體、多肽、或藥物組 合物在特定的位點(diǎn)或附近給予至受試者。
[0050] 如本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"肥胖癥"是指由WHO提供的,基于體重指數(shù)(BMI)(其是由 個(gè)人的重量(以kg計(jì))和它們的以米計(jì)的高度的平方之間的比率構(gòu)成)的定義。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn), 低于18.5kg/m 2的BMI認(rèn)為是重量不足或瘦,18.5-24.9kg/m2的BMI認(rèn)為是正常重量25.0-29.9kg/m 2的BMI認(rèn)為是1級(jí)超重,30.0-39.01^/1112的811認(rèn)為是2級(jí)超重以及大于或等于 40.Okg/m 2的BMI認(rèn)為是病態(tài)的肥胖癥??商娲?,存在用于定義受試者的肥胖癥的程度的 其他方法,如在肋部下邊緣和骨盆上邊緣之間的中點(diǎn)測(cè)量的腰部直徑(以cm計(jì))、皮膚皺襞 的厚度、生物阻抗,其基于瘦肉組織(lean mass)比脂肪組織(fatty mass)更好地傳輸電流 的原理。
[0051] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"是指啟動(dòng)子序列相對(duì)于感興趣的多核苷酸 的功能關(guān)系和位置(例如,啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地與編碼序列連接,如果其影響該序列的 轉(zhuǎn)錄)。通常,可操作地連接的啟動(dòng)子與感興趣的序列鄰接。然而,增強(qiáng)子無(wú)須鄰接感興趣的 序列以控制其表達(dá)。
[0052]在本文中可互換地使用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體(carrier)"、"藥學(xué)上可接 受的稀釋劑"、"藥學(xué)上可接受的賦形劑"、或"藥學(xué)上可接受的媒介(vehicle)"是指非毒性 的固體、半固體、或液體填料,稀釋劑,包封材料,或所有常規(guī)類型的制劑輔助劑。藥學(xué)上可 接受的運(yùn)載體基本上在采用的劑量和濃度下對(duì)接受者是非毒性的,并且與制劑的其他成分 相容。藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的數(shù)量和性質(zhì)取決于期望的給予形式。藥學(xué)上可接受的運(yùn)載 體是已知的并且可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備。參見(jiàn)Faulii Trillo C,"Tratado de Farmacia Galenica"(Ed.Luzan 5,S.A.,Madrid,ES,1993)和Gennaro A,Ed.,"Remington: The Science and Practice of Pharmacy"20版(Lippincott Williams&ffilkins, Philadelphia,PA,US,2003)〇
[0053]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"是指位于多核苷酸序列的上游的作用為控制一種 或多種多核苷酸的轉(zhuǎn)錄的核酸片段,并且通過(guò)存在的用于以下各項(xiàng)的結(jié)合位點(diǎn)而被結(jié)構(gòu)識(shí) 別:DNA依賴的RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其他DNA序列,包括(但不限于) 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、抑制子和激活蛋白結(jié)合位點(diǎn),以及任何其他本領(lǐng)域已知的直接或間接 作用以調(diào)節(jié)來(lái)自啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的量的核苷酸的序列。"組織特異"啟動(dòng)子是指僅在特定類型 的分化細(xì)胞或組織中具有活性的啟動(dòng)子。
[0054]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"是指含有脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核酸 分子,DNA或RNA。核酸可以是雙鏈的、單鏈的、或含有雙鏈或單鏈序列二者的部分。術(shù)語(yǔ)"多 核苷酸"包括,但不限于具有編碼與細(xì)胞或其中治療的受試者的內(nèi)源多核苷酸部分或全部 互補(bǔ)的多肽和核酸序列,從而遵循其轉(zhuǎn)錄的能力的核酸序列,其產(chǎn)生能夠雜交和抑制內(nèi)源 多核苷酸的表達(dá)的RNA分子(例如,m i croRNA、shRNA、s i RNA)。
[0055] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)"是指促進(jìn)包含于表達(dá)框或得到的基因產(chǎn)物 中的含有的序列的表達(dá)、穩(wěn)定、或定位的任意多核苷酸。
[0056] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"預(yù)防(prevent)"、"預(yù)防的(preventing)"和"預(yù)防 (prevention)"是指抑制受試者中疾病的開(kāi)始或降低其發(fā)生率。預(yù)防可以是徹底的(例如, 受試者中完全沒(méi)有病理細(xì)胞)或部分的。預(yù)防還指減少對(duì)臨床狀態(tài)的易感性。
[0057]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"重組病毒基因組"是指其中至少一種外源表達(dá)框多核苷酸 插入至自然產(chǎn)生的AAV基因組中的AAV基因組。
[0058]如本文使用的術(shù)語(yǔ)"rep基因"或"AAV rep基因"是指編碼Rep蛋白的基因。如本文 中使用的術(shù)語(yǔ)"Rep蛋白"是指具有至少一種天然AAV Rep蛋白(例如Rep 40、52、68、78)的功 能活性的多肽。Rep蛋白(例如Rep 40、52、68、78)的"功能活性"是與該蛋白的生理功能相關(guān) 的任何活性,包括通過(guò)識(shí)別促進(jìn)DNA的復(fù)制,連接和切口(平切,nicking)DNA復(fù)制的AAV原點(diǎn) 以及DNA解旋酶活動(dòng)。另外的功能包括調(diào)節(jié)來(lái)自AAV的(或其他異源的)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄并將 AAV DNA位點(diǎn)特異地整合至宿主染色體中。
[0059] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"受試者"是指?jìng)€(gè)體、植物、或動(dòng)物,如人類、非人類靈長(zhǎng)類(例 如,黑猩猩和其他類人猿和猴子物種)、家畜(例如,禽類、魚類、牛、綿羊、豬、山羊和馬)、或 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如,嚙齒動(dòng)物,如小鼠(mice)、大鼠(rat)和豚鼠)。該術(shù)語(yǔ)不表示特定的年齡或 性別。術(shù)語(yǔ)"受試者"包含胚胎和胎兒。
[0060] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"全身給予的"和"全身給予"是指將本發(fā)明的多核苷酸、載 體、多肽、或藥物組合物以非局部的方式給予受試者。本發(fā)明的多核苷酸、載體、多肽、或藥 物組合物的全身給予可以達(dá)到受試者的整個(gè)身體的多個(gè)器官或組織,或可以達(dá)到受試者的 特定器官或組織。例如,本發(fā)明的藥物組合物的靜脈給予可以產(chǎn)生受試者中多于一個(gè)組織 或器官的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0061] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)"是指能夠調(diào)節(jié)一種或多種基因的表達(dá)的核酸 片段。本發(fā)明的多核苷酸的調(diào)控區(qū)包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。
[0062] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduce)"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduct ion)"是指借其將外 來(lái)的核苷酸序列通過(guò)病毒載體引入細(xì)胞的過(guò)程。
[0063]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染"是指將DNA引入受體真核細(xì)胞。
[0064]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"治療(treat)"或"治療(treatment)"是指給予本發(fā)明的化 合物或組合物以在疾病的臨床征象出現(xiàn)之后控制其進(jìn)展??刂萍膊∵M(jìn)展理解為是指有利的 或期望的臨床結(jié)果,其包括但不限于:癥狀的減少、疾病持續(xù)時(shí)間的減少、病理狀態(tài)的穩(wěn)定 (特別地,避免另外的惡化)、推遲疾病的進(jìn)展、改善病理狀態(tài)并緩解(部分和全部二者)。與 如果不應(yīng)用治療的預(yù)期存活相比,疾病的進(jìn)展的控制還包括延長(zhǎng)存活。
[0065]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"2型糖尿病"是指表征為不適當(dāng)?shù)难撬皆黾拥募膊?。?尿病的慢性高血糖與不同器官的長(zhǎng)期損傷、功能障礙和失效相關(guān),同時(shí)導(dǎo)致各種并發(fā)癥,如 視網(wǎng)膜病、腎病和周圍神經(jīng)病。2型糖尿病是由外圍組織(主要是骨骼肌、脂肪組織和肝臟) 的胰島素耐受性和由于降低的細(xì)胞團(tuán)和功能的組合導(dǎo)致的不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)償性胰島素分泌 響應(yīng)所引起的。除了葡萄糖濃度增加,胰島素作用欠缺經(jīng)常導(dǎo)致膽留醇或甘油三酯水平的 增加。
[0066] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"血管生成"是指源自未分化的或分化中的細(xì)胞的血管的形 成、生長(zhǎng)、發(fā)育或增殖。
[0067] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"載體(vector)"是指能夠?qū)⒁环N或多種感興趣的多核苷酸 遞送,并且可選地表達(dá)至宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。載體的實(shí)例包括但不限于:病毒載體、裸DNA或 RNA表達(dá)載體、質(zhì)粒、粘粒(cosmid)或菌體載體、與陽(yáng)離子縮合劑(condensing agents)關(guān) 聯(lián)的DNA或RNA表達(dá)載體、包封在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達(dá)載體和某些真核細(xì)胞,如生產(chǎn)細(xì) 胞(producer cell)。載體可以是穩(wěn)定的并且可以自身復(fù)制。關(guān)于可以使用的載體的類型沒(méi) 有限制。載體可以是克隆載體,適用于繁殖和獲得結(jié)合至多種異源生物體的多核苷酸、基因 結(jié)構(gòu)或表達(dá)載體。適合的載體包括原核表達(dá)載體(例如pUC18、pUC19、Blue SCript和它們的 衍生物)、1^18、1^19、?81?322、?]\?9、(:〇此1、?0?1、1^4、噬菌體和穿梭載體(例如,?3厶3和 pAT28),和基于病毒載體的真核表達(dá)載體(例如,腺病毒、腺相關(guān)病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢 病毒),以及非病毒載體,如pSilencer 4. l_CMV(Ambi〇nK,Life Technologies Corp·, Carslbad,CA,US)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/ HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVU^pKSV-10、 pBPV-l、pML2d和pTDTl。
[0068] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"VEGF"是指血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。"VEGF"包括但不限于VEGF變 體A、B、C、D、E和F。參見(jiàn)Hamawy A等,Curr · Opin · Cardiol · 1999; 14:515_522、Neufeld G等, Prog.Growth Factor Res.1994;5:89_97、01ofsson B等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996; 93: 2576-2581、Chi lov D等,J. Biol .Chem. 1997; 272 : 25176-25183 和Olofsson B等, Curr · Opin · Biotechnol · 1999 ; 10 : 528-535。VEGF變體包括,但不限于異形體VEGFi64、 VEGFm、VEGF145、VEGFi67、VEGFi65、VEGF·和VEGF2Q6。參見(jiàn)Tischer E等,J · Biο 1 · Chem· 1991; 266:11947-11954和Poltorak Z等,J · Biol · Chem· 1997; 272:7151-7158。術(shù)語(yǔ) "VEGF" 還包括 血管通透因子或血管調(diào)理素(促血管生成素,vasculotropin) (VPF)。參見(jiàn)Keck P等, Science 1989;246:1309-1312和Senger D等,Science 1983;219:983-985JPF目前在本領(lǐng) 域中已知為VEGF A。也可以使用VEGF家族的其他成員,包括胎盤生長(zhǎng)因子PIGF I和II。適合 的VEGF的序列是容易獲得的(例如,國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/June 2012) 〇例如,人類 VEGF家組成員的基因座(loci )包括:VEGF-A-P15692和NP003367 ; VEGF-B-NP003368、 P49765、AAL79001、AAL79000、AAC50721、AAB06274和AAH08818;VEGF-C-NP005420、P49767, S69207、AAB36425和CAA63907;VEGF-D-NP004460、AAH27948、043915、CAA03942和BAA24264; VEGF-E-AAQ88857;VEGF-F-2VPFF;PIGF-1-NP002623、AAH07789、AAH07255、AAH01422、 P49763、CAA38698和CAA70463;PIGF-1 的鏈A-1FZVA和鏈B-1FZVB的合成結(jié)構(gòu);以及PIGF-2-AAB25832和AAB30462。優(yōu)選地,VEGF是人類來(lái)源的。然而,根據(jù)本發(fā)明也可以使用來(lái)自其他 物種,如小鼠的VEGF。
[0069] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"白色脂肪組織相細(xì)胞"或"白色脂肪細(xì)胞"是指多面體至球 形,并且含有較大的,由薄層的細(xì)胞質(zhì)圍繞的"單室"脂質(zhì)液滴的脂肪細(xì)胞的類型。所述細(xì)胞 的細(xì)胞核是扁平的并且位于外周。白色脂肪細(xì)胞的直徑在根據(jù)庫(kù)部位在30和70μπι之間的范 圍內(nèi)變化。存儲(chǔ)的脂肪處于半液體狀態(tài),并且主要由甘油三酯和膽固醇酯組成。白色脂肪細(xì) 胞分泌多種肽和蛋白,統(tǒng)稱為脂肪因子,如抵抗素、脂連素和瘦素。
[0070] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件"或"WPRE"是指當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí) 產(chǎn)生能夠增強(qiáng)基因表達(dá)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA序列。參見(jiàn)Lee Y等,Exp. Physiol. 2005 ;90(1): 33-37和Donello J等,J·Virol·1998;72(6):5085-5092。
[0071] 如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"m i c r 〇 RNA"或"m i RNA"是涉及在轉(zhuǎn)錄后水平下RNA介導(dǎo)的基 因沉默的小型(~22-nt)的、進(jìn)化保守的調(diào)控RNA。參見(jiàn)Barte 1 DP. Ce 11 2004; 116 : 281 -297。通過(guò)與互補(bǔ)區(qū)域(最常在細(xì)胞信使RNA(mRNA)的3 '未翻譯區(qū)(3 'UTR))的堿基配對(duì), miRNA可以起抑制mRNA翻譯,或在高序列同源性時(shí),造成mRNA的催化解聚。由于許多miRNA高 度分化的組織表達(dá),可以采用細(xì)胞miRNA以介導(dǎo)基因治療載體的組織特異定位。通過(guò)病毒載 體內(nèi)的與組織特異miRNA(miRT)完全互補(bǔ)的靶元件的工程串聯(lián)拷貝,可以高效抑制在不期 望的組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
[0072] 2.提供脂肪組織特異表達(dá)的腺相關(guān)病毒載體
[0073] 在第一方面,本發(fā)明涉及腺相關(guān)病毒(AAV)載體,包含重組病毒基因組,其中,所述 重組病毒基因組包含表達(dá)框,該表達(dá)框包含可操作地連接至感興趣的多核苷酸的脂肪組織 特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明的AAV包括已知的AAV的42種血清型中的任何血清型。通常,AAV的血清 型具有在氨基酸和核酸水平具有顯著同源性的基因組序列,提供等同的系列的遺傳功能, 產(chǎn)生在物理和功能方面實(shí)質(zhì)相同的病毒粒子,并且通過(guò)實(shí)際上相同的機(jī)制復(fù)制和裝配。特 別地,本發(fā)明的AAV可以屬于血清型1的44¥(44¥1)、44¥2、44¥3(包括類型34和38)、4六¥4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、鳥(niǎo)類 AAV、牛類 AAV、犬類 AAV、馬類 AAV、羊類 AAV 和任何其他的AAV。不同的AAV血清型的基因組序列的實(shí)例可以在文獻(xiàn)中或在公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù), 如 GenBank 中找到。參見(jiàn) GenBank 登錄號(hào) AF028704.1(AAV6)、NC006260(AAV7)、NC006261 (AAV8)和AX753250.1(AAV9)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,本發(fā)明的腺相關(guān)病毒載體選自由AAV6、 AAV7、AAV8和AAV9血清型所組成的組中的血清型。
[0075]根據(jù)本發(fā)明的AAV的基因組通常包含順式作用的5'和3'末端反向重復(fù)序列和表達(dá) 框。參見(jiàn)Tijsser P,Ed.,,"Handbook of Parvoviruses"(CRC Press,Boca Raton,F(xiàn)L,US, 1990,pp. 155-168) <JTR序列為約145bp長(zhǎng)。雖然這些序列一定程度的小部分修改是允許的, 優(yōu)選地將基本整個(gè)編碼ITR的序列用于分子。用于修改這些ITR序列的方法是在本領(lǐng)域中已 知的。參見(jiàn)Brown T,"Gene Cloning"(Chapman&Hall,London,GB,1995)、Watson R等, "Recombinant DNA",第2版(Scientific American Books,New York,NY,US,1992)、 Alberts B等,"Molecular Biology of the Cell"(Garland Publishing Inc·,New York, NY,US,2008)、Innis M等,Eds.,"PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications")Academic Press Inc ., San Diego,CA,US,1990)、Erlich H,Ed.,"PCR Technology.Principles and Applications for DNA Amplification"(Stockton Press, New York,NY,US,1989)、Sambrook J等,"Molecular Cloning.A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,US,1989)、Bishop T 等,"Nucleic Acid and Protein Sequence.A Practical Approach"(IRL Press,Oxford, GB,1987),Reznikoff W,Ed·,"Maximizing Gene Express ion"(Butterworths Publishers,Stoneham,MA,US,1987),Davis L等,"Basic Methods in Molecular Biology"(Elsevier Science Publishing Co.,New York,NY,US,1986^PSchleefM,Ed·, "Plasmid for Therapy and Vaccination"(Wiley-VCH Verlag GmbH,Weinheim,DE, 2001)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,AAV重組基因組包含5'和3'AAV ITR。在另一實(shí)施方式中,5'和 3'AAV ITR源自AAV2。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中,AAV重組基因組缺少rep開(kāi)放閱讀框和cap 開(kāi)放閱讀框。在一種實(shí)施方式中,選擇AAV2ITR以生成假型AAV(即具有衣殼和源自不同血清 型的ITR的AAV)。
[0076]本發(fā)明的多核苷酸可以包含源自任一AAV血清型的ITR。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,ITR 源自AAV2血清型。
[0077]本發(fā)明的AAV包含來(lái)自任何血清型的衣殼。在特定的實(shí)施方式中,該衣殼源自由以 下所組成的組中的AAV: AAV 1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。在優(yōu)選的實(shí)施方式 中,本發(fā)明的AAV包含源自AAV8或AAV9血清型的衣殼。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中,AAV衣殼的 VP1序列具有序列表SEQ ID從).18。參見(jiàn)661^3他登錄號(hào)4¥530579。
[0078] 在一些實(shí)施方式中,用于本發(fā)明的方法的AAV Cap可以通過(guò)突變(即通過(guò)插入、刪 除、或替代)上述AAV Cap或其編碼核酸之一產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中,AAV Cap與上述的一 種或多種AAV Cap至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%相似。
[0079]在一些實(shí)施方式中,AAV Cap是嵌合的,包含來(lái)自兩種、三種、四種、或更多種前述 AAV Cap的結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中,AAV Cap是來(lái)源自兩種或三種不同的AAV或重組AAV 的VP1、VP2和VP3單體的嵌合體。在一些實(shí)施方式中,rAAV組合物包含多于一種的前述Cap。
[0080] 在一些實(shí)施方式中,將用于rAAV組合物中的AAV Cap設(shè)計(jì)為含有異源序列或其他 修飾。例如,可以將賦予選擇性定位或免疫逃避的肽或蛋白序列引入至Cap蛋白??商娲?或另外地,Cap可以化學(xué)改性使得rAAV的表面是聚乙二醇化SEQ ID N0.(即聚乙二醇修飾 的),其可以促進(jìn)免疫逃避。Cap蛋白還可以是誘變的(例如去除其天然受體結(jié)合,或掩蓋免 疫原表位)。
[0081] 在另一特定的實(shí)施方式中,AAV載體是假型AAV載體(即該載體包含來(lái)源自至少兩 種不同AAV血清型的序列或組件)。在特定的實(shí)施方式中,假型AAV載體包含源自一種AAV血 清型(例如AAV2)的AAV基因組,和至少部分源自不同的AAV血清型的衣殼。這種假型AAV載體 的特定的實(shí)例包括,但不限于包含源自任何AAV血清型(例如來(lái)自AAV1至AAV11)的基因組, 在源自AAV6、AAV7、AAV8、或AAV9的衣殼中的載體。
[0082] 在一種實(shí)施方式中,AAV載體包含一個(gè)啟動(dòng)子,其中,加入至少一種miRNA的至少一 個(gè)靶序列,該miRNA可以選自以下列表:miR122(miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)MI0000442)、miR152 (MI0000462)、miR199(MI0000242)、miR215(MI0000291)、miR192(MI0000234)、miR148a (MI0000253)、miR194(MI0000488)、miRl(MI0000651)、miRT133(MI0000450)、miR206 (MI0000490)、miR208(MI0000251)、miR124(MI0000443)、miR125(MI0000469)、miR216 (MI0000292)、miR130(MI0000448)。參考序列已經(jīng)獲得自 miRBase(根據(jù)31/07/2013 的版本, http://www.mirbase.org/)〇
[0083] 在一種實(shí)施方式中AAV載體含有一個(gè)啟動(dòng)子,其中加入至少一種可以選自以下列 表的miRNA靶序列:
[0084] 列表 1
[0085] miRT122a(5,CAAACACCATTGTCACACTCCA3,)、
[0086] miRT152(5,AGTCACGTACTGTCTTGAACC3,)、
[0087] miR199a-5p(5'GGGTCACAAGTCTGATGGACAAG3')、
[0088] miR99a-3p(5'TGTCATCAGACGTGTAACCAAT3')、
[0089] miRT215(5,TACTGGATACTTAACTGTCTG3,)、
[0090] miRT192(5,GGCTGTCAATTCATAGGTCAG3,)、
[0091 ] miRT194(5'ACATTGTCGTTGAGGTACACCT3')、
[0092] miRTl(5'TTACATACTTCTTTACATTCCA3')、
[0093] mirT148(5,AGTCACGTGATGTCTTGAAACA3,)、
[0094] mirT133a(5'AAACCAGGGGAAGTTGGTCGAC3')、
[0095] miRT206(5'ACCTTACATTCCTTCACACACC3')、
[0096] miRT124(5'ATTCCGTGCGCCACTTACGG3')、
[0097] miRT125(5'AGGGACTCTGGGAAATTGGACACT3')、
[0098] miRT216(5,ATTAGAGTCGACCGTTGACACT3,)、
[0099] miRT130(5'GTCACGTTACAATTTTCCCGTA3')。
[0100] 在一種實(shí)施方式中AAV載體含有一個(gè)啟動(dòng)子,其中加入至少一個(gè)具有與選自以上 提及的列表1的miRNA靶序列85%同源的miRNA靶序列。
[0101] 在一種實(shí)施方式中AAV載體含有一個(gè)啟動(dòng)子,其中加入至少一個(gè)具有與選自以上 提及的列表1的miRNA靶序列功能等效的miRNA靶序列。在這種情況下,術(shù)語(yǔ)功能等效物是指 能夠與相同的miRNA結(jié)合的任何核苷酸序列,該miRNA與原始序列結(jié)合。例如,miRT122a的功 能等效物是與相同的miRNA雜交的任意序列,該miRNA與mirT122a雜交。
[0102] 功能等效的核昔酸序列保持了參考mirT序列的相關(guān)生物活性。這是指mirT的功能 等效物具有,以與參考mirT序列相同的方式在不期望的組織中抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。 [0 103] 在另一特定的實(shí)施方式中,miRNA革巴序列可以選自mirT122a(5' CAAACACCATTGTCACACTCCA3 '),參考為序列表 SEQ ID NO : 1 9 或 m i r T 1 ( 5 ' TTACATACTTCTTTACATTCCA3'),參考為序列表SEQ ID N0:20。
[0104] 轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可以包含啟動(dòng)子,以及可選地增強(qiáng)區(qū)域。優(yōu)選地,該啟動(dòng)子是對(duì)脂肪組 織特異的。增強(qiáng)子對(duì)脂肪組織不需要是特異的??商娲兀D(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可以包含脂肪組織特 異的啟動(dòng)子和脂肪組織特異的增強(qiáng)子。
[0105] 在一種實(shí)施方式中,組織特異的啟動(dòng)子是脂肪細(xì)胞特異的啟動(dòng)子,例如脂肪細(xì)胞 蛋白2(aP2,也稱作脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4))、PPARy啟動(dòng)子、脂連素啟動(dòng)子、磷酸烯醇丙酮 酸羧激酶(PEPCK)啟動(dòng)子,該啟動(dòng)子源自人芳香酶細(xì)胞色素 p450(p450arom),或Foxa-2啟動(dòng) 子。參見(jiàn)Graves R等,Genes Dev.l991;5:428_437、Ross S等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990;87:9590-9594、Simpson E等,US 5,446,143、Mahendroo Μ等,J.Biol.Chem.1993; 268:19463-19470、Simpson E等,Clin.Chem. 1993;39:317-324和Sasaki H等,Cell 1994; 76:103-115。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,增強(qiáng)子區(qū)選自由脂肪特異aP2增強(qiáng)子和脂肪特異UCP1增 強(qiáng)子組成的組。
[0106]在優(yōu)選的實(shí)施方式中,根據(jù)本發(fā)明的AAV的脂肪組織特異調(diào)控區(qū)包含脂肪特異aP2 增強(qiáng)子和aP2基本啟動(dòng)子(基本aP2啟動(dòng)子,basal ap2 promoter)。參見(jiàn)Rival Y等, J. Pharmaco 1. Exp. Ther. 2004:311 (2): 467-475。該包含脂肪特異aP2增強(qiáng)子和aP2基本啟動(dòng) 子的區(qū)域也稱為"mini/aP2調(diào)控區(qū)",并且是由aP2基因的基本啟動(dòng)子和所述aP2基因的脂肪 特異增強(qiáng)子形成的。優(yōu)選地,aP2啟動(dòng)子是鼠類的。參見(jiàn)Graves R等,Mol. Cell Biol. 1992; 12(3): 1202-1208和Ross S等,Proc .Natl .Acad· Sci .USA 1990 ;87:9590-9594。在特定的實(shí) 施方式中,mini/aP2調(diào)控區(qū)具有序列表SEQIDN0:2的序列。
[0107] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中,根據(jù)本發(fā)明的AAV的脂肪組織特異調(diào)控區(qū)包含脂肪特 異UCP1增強(qiáng)子和UCP1基本啟動(dòng)子(基本UCP1啟動(dòng)子,basal UCP1 promoter)。參見(jiàn)del Mar GonzMez-Barroso Μ等,J. Biol. Chem. 2000; 275(41 ) :31722-31732 和Rim J等, J.Biol.Chem.2002;277(37):34589-34600。包含脂肪特異UCP1增強(qiáng)子和UCP1基本啟動(dòng)子的 該區(qū)域也稱為"mini/UCP調(diào)控區(qū)"并且是指UCP1基因的基本啟動(dòng)子和所述UCP1基因的脂肪 特異增強(qiáng)子的組合。優(yōu)選使用大鼠 UCP1啟動(dòng)子。參見(jiàn)Larose M,等,J.Biol.Chem. 1996;271 (49) :31533-31542和Cassard-Doulcier A等,Biochem.J. 1998;333:243-246。在特定的實(shí) 施方式中,mini/UCPl調(diào)控區(qū)具有序列表SEQ ID N0:3的序列。
[0108] 在另一實(shí)施方式中,組成本發(fā)明的AAV的部分的表達(dá)框進(jìn)一步包含表達(dá)控制序列, 其包括但不限于適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄序列(即起始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)、有效的RNA加工信號(hào)(例 如,剪接和聚腺苷酸化(polyA)信號(hào))、穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列、增強(qiáng)翻譯效率的序列(即 Kozak共有序列)、增強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性的序列、以及當(dāng)需要時(shí),增強(qiáng)編碼的產(chǎn)物的分泌的序列。 非常多的表達(dá)控制序列,包括天然的、組成的、誘導(dǎo)的、或組織特異的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中已 知的并且可以根據(jù)本發(fā)明利用。
[0109] 在另一實(shí)施方式中,構(gòu)成本發(fā)明的AAV的部分的表達(dá)框進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)。 在優(yōu)選的實(shí)施方式中,該轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后區(qū)(WPRE)或其功能變體和 片段,以及PPT-CTS或其功能變體和片段。參見(jiàn)Zufferey R等,J. Virol. 1999; 73:2886-2892 和Kappes J等,W0 2001/044481。在特定的實(shí)施方式中,該轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)是WPRE。
[0110] 構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的AAV的部分的表達(dá)框包含"感興趣的多核苷酸"。在優(yōu)選的實(shí)施 方式中,該感興趣的多核苷酸編碼作用于全身的蛋白。在另一實(shí)施方式中,感興趣的多核苷 酸編碼作用于脂肪細(xì)胞或其附近區(qū)域的蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,作用于所述脂肪細(xì)胞 或其附近區(qū)域的蛋白是己糖激酶(HK),包括相對(duì)于不同的底物,在亞細(xì)胞位置和動(dòng)力學(xué)上 不同的任意四種哺乳動(dòng)物HK同功酶(EC 2.7.1.1)。例如,HK包括HK1 (GenBank登錄號(hào) 陬000179、陬277031、陬277032、陬277033、陬277035)、冊(cè)2(66詘31^登錄號(hào)陬000180)、邢3 (GenBank 登錄號(hào) NP002106)和 HK4 或葡糖激酶(GenBank 登錄號(hào) ΝΡ000153、NP277042、 NP277043)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中,HK是葡糖激酶,其在本文中與己糖激酶4或HK 4可互 換地使用,并且指具有HK1、HK2、或HK3的100倍高的葡萄糖的Km的己糖激酶的異形體。
[0111] 在實(shí)施方式中,作用于所述脂肪細(xì)胞或其附近區(qū)域的蛋白是堿性磷酸酶(AP),包 括但不限于腸類或IAP (GenBank登錄號(hào)ΝΡ001622)、胎盤類或PLAP (GenBank登錄號(hào) NP001623)和非組織特異同功酶或ALPL(GenBank登錄號(hào)即000469、即001120973.2和 NP001170991.1)。在另一實(shí)施方式中,作用于所述脂肪細(xì)胞或其附近區(qū)域的蛋白是VEGF,包 括但不限于VEGF變體A、B、C、D、E和F。
[0112] 在另一實(shí)施方式中,感興趣的多核苷酸編碼通常產(chǎn)生的并且由脂肪細(xì)胞分泌的多 肽。在另一實(shí)施方式中,由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的多肽是脂肪酶(例如特別地,絲氨酸蛋白 酶同系物的脂肪酶)、脂連素、瘦素、抵抗素、或肥胖基因(〇b gene)的蛋白產(chǎn)物。
[0113] 其他還有用的感興趣的多核苷酸包括編碼激素以及生長(zhǎng)和分化因子的那些,包 括,但不限于胰島素、高血糖素、生長(zhǎng)激素(GH)、甲狀旁腺素(PTH)、生長(zhǎng)激素釋放因子 (GRF)、促卵泡激素(FSH)、促黃體生成激素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、血管生成素、 血管抑制素、粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、 血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素生長(zhǎng)因子I和IKIGF-I和TGF-II)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族 中的任一種,包括TGFa、活化素、抑制素、或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)BMP 1-15中的任一種、生 長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)蛋白(heregluin)/神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白/ARIA/Neu分化因子(NDF)家族中的任一種、 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor) (NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白 NT-3和NT-4/5、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因 子(neurturin)、聚集蛋白(agrin)、臂板蛋白(semaphorins)/崩潰蛋白家族的任一種、神經(jīng) 突起導(dǎo)向因子(netrin)-l和神經(jīng)突起導(dǎo)向因子-3、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、肝配蛋白 (ephrin)、頭蛋白(noggin)、音猜因子(sonic hedgehog)和酪氨酸羥基化酶。
[0114] 其他有用的感興趣的多核苷酸包括編碼調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的蛋白的那些,包括,但不 限于細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞活素,如血小板生成素 (ΤΡ0)、白細(xì)胞介素(IL)IL-l至IL-25(例如 IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、單核細(xì)胞趨化蛋白、白血病抑制因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺 激因子、Fas配體、腫瘤壞死因子α和β、干擾素 α、β和γ、干細(xì)胞因子、flk_2/flt3配體。由免 疫系統(tǒng)生產(chǎn)的基因產(chǎn)物對(duì)本發(fā)明也是有用的。這些包括,但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、 IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗體、單鏈抗體、T細(xì)胞受體、嵌合T細(xì)胞受體、單鏈T 細(xì)胞受體、I類和Π 類MHC和HLA分子,以及工程化免疫球蛋白以及MHC和HLA分子。有用的基 因產(chǎn)物還包括補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白,如補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、膜輔因子蛋白(MCP)、衰變加速因子(MCP)、 CR1、CF2和CD59。
[0115] 其他有用的感興趣的多核苷酸包括編碼激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、淋巴細(xì)胞活 素、調(diào)節(jié)蛋白和免疫系統(tǒng)蛋白的受體中任一種的那些。本發(fā)明包含用于膽留醇調(diào)節(jié)或脂調(diào) 節(jié)的受體,包括低密度脂蛋白(LDL)受體、高密度脂蛋白(HDL)受體、極低密度脂蛋白(VLDL) 受體和清道夫受體。本發(fā)明號(hào)也包含基因產(chǎn)物,如包括糖皮質(zhì)激素受體和雌激素受體、維生 素受體和其他核受體的類固醇激素受體總家族成員。此外,有用的基因產(chǎn)物包括轉(zhuǎn)錄因子, 如加11、;1^〇8、11^、1]^(1、血清效應(yīng)因子(31^)、4?1、4?2、111713、]\^〇0和肌細(xì)胞生成素、包含蛋白的 ETS盒(ETS-box containing protein)、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、 HNF_4、C/EBP、SP1、CCAAT盒結(jié)合蛋白(CCAAT-box binding protein)、干擾素調(diào)節(jié)因子 (IRF-1)、腎胚細(xì)胞瘤(Wilms tumor)蛋白、ETS結(jié)合蛋白、STAT、GATA盒結(jié)合蛋白(例如GATA-3)和翼狀螺旋蛋白(winged helix protein)的叉頭(forkhead)家族。
[0116] 其他有用的感興趣的多核苷酸包括編碼以下酶的那些,如氨基甲?;铣擅窱、鳥(niǎo) 氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、富馬酰乙酰乙酸水解 酶、苯丙氨酸羥化酶、α-l抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、膽色素原脫氨基酶、胱硫醚 (cystathione )β-合酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰-輔酶Α脫氫酶、丙酰輔酶Α羧化酶、 甲基丙二酰輔酶A變位酶、戊二酰輔酶A脫氫酶、胰島素、β-葡糖苷酶、丙酮酸鹽羧化酶 (pyruvate carboxylate)、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶、Η蛋白、Τ蛋白、囊性 纖維化跨膜調(diào)節(jié)子(CFTR)序列和抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(肌萎縮蛋白,dystrophin)基因產(chǎn)物 (例如,微小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白或小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白)。還有用的基因產(chǎn)物包括用于代替治療 的酶,如,例如用于治療溶酶體貯積病的含有甘露糖-6-磷酸酯的酶(例如,編碼β-葡糖醛酸 酶(GUSB)的適合的基因)。
[0117] AAV載體的包裝尺寸限制限于母體野生型AAV基因組的尺寸,其在基于AAV血清型 的尺寸的范圍內(nèi)(即4087至4767)。參見(jiàn)Wu Ζ等,Mol. Ther. 2010; 7(1): 80-86。例如,野生型 AAV02具有4679的基因組尺寸并且野生型AAV-6具有4683的基因組尺寸。在一些實(shí)施方式 中,重組體RNA載體的克隆容量可能受限并且期望的編碼序列可能涉及完全替換病毒的4.8 千堿基基因組。因此大的基因在一些情況下可能不適用于標(biāo)準(zhǔn)的重組AAV載體。技術(shù)人員應(yīng) 該理解的是用于克服受限的編碼容量的選項(xiàng)是在本領(lǐng)域中可獲得的。例如,可以將兩個(gè)基 因組的AAV ITR退火以形成頭接尾的串連體(concatamer),幾乎加倍載體的容量。剪接位點(diǎn) 的插入使得ITR從轉(zhuǎn)錄物中去除。其他用于克服受限的克隆容量的選項(xiàng)對(duì)于技術(shù)人員是顯 而易見(jiàn)的。
[0118] 3.基于AAV6、AAV7、AAV8和AAV9對(duì)脂肪組織的嗜性的治療方法
[0119] 在第二方面中,本發(fā)明公開(kāi)了能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)脂肪組織細(xì)胞的AAV6、AAV7、AAV8和 AAV9血清型的腺相關(guān)病毒載體。該特征使得開(kāi)發(fā)用于治療需要或可以受益于脂肪細(xì)胞中感 興趣的聚核苷酸的表達(dá)的疾病的方法成為可能。特別地,此發(fā)現(xiàn)通過(guò)將本發(fā)明的AAV載體給 予至患者,促進(jìn)感興趣的多肽遞送至需要其的受試者,從而產(chǎn)生能夠表達(dá)感興趣的多核苷 酸并在體內(nèi)編碼多肽的脂肪細(xì)胞。如果編碼的多肽是分泌的多肽,其可以由脂肪細(xì)胞分泌, 使得以這種方式全身遞送該多肽。
[0120]因此,在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了包含重組病毒基因組的腺相關(guān)病毒載體 以用于需要感興趣的聚核苷酸的表達(dá)的疾病的治療或預(yù)防,其中,所述重組病毒基因組包 含表達(dá)框,該表達(dá)框包含與感興趣的多核苷酸可操作地連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū),其中,AAV的血 清型選自由AAV6、AAV7、AAV8和AAV9組成的組。
[0121] 在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了包括重組病毒基因組的腺相關(guān)病毒載體用于需 要所述感興趣的多核苷酸的表達(dá)的疾病的治療或預(yù)防,其中,所述重組病毒基因組包含表 達(dá)框,該表達(dá)框包含與感興趣的多核苷酸可操作地連接的脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。
[0122] 在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了用于需要感興趣的多核苷酸在受試者中表達(dá)的 疾病的治療或預(yù)防的方法,其包括將腺相關(guān)病毒載體給予所述受試者,該腺相關(guān)病毒載體 包含重組病毒基因組,其中,所述重組病毒基因組包含表達(dá)框,該表達(dá)框包含與感興趣的多 核苷酸可操作地連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū),其中AAV的血清型選自由AAV6、AAV7、AAV8和AAV9組成 的組。
[0123] 在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供用于需要感興趣的多核苷酸在受試者中表達(dá)的疾 病的治療或預(yù)防的方法,其包括將腺相關(guān)病毒載體給予至所述受試者,該腺相關(guān)病毒載體 包含重組病毒基因組,其中,所述重組病毒基因組包含表達(dá)框,該表達(dá)框包含與感興趣的多 核苷酸可操作地連接的脂肪組織特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。
[0124] 用于本發(fā)明的治療方法的AAV包含含有感興趣的多核苷酸和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的表達(dá) 框。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可以包含啟動(dòng)子,以及可選的增強(qiáng)區(qū)域。
[0125] 在一種實(shí)施方式中,轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)允許感興趣的多核苷酸的組成型表達(dá)。組成型啟 動(dòng)子的實(shí)例包括,但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動(dòng)子(可選地帶有RSV增強(qiáng) 子)、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(可選地帶有CMV增強(qiáng)子)、SV40啟動(dòng)子、二氫葉酸還原酶啟動(dòng) 子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、甘油磷酸激酶(PGK)啟動(dòng)子和EFla啟動(dòng)子。參見(jiàn)Boshart Μ等,Cell 1985;41:521-530。
[0126] 在另一實(shí)施方式中,轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包含β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子可以 源自任何哺乳動(dòng)物,包括人和嚙齒動(dòng)物,或禽類,包括雞。優(yōu)選使用雞肌動(dòng)蛋白。
[0127] 在又一實(shí)施方式中,轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)一步包含增強(qiáng)子區(qū)。優(yōu)選地,增強(qiáng)子區(qū)是CMV增 強(qiáng)子區(qū)。
[0128] 在特定的實(shí)施方式中,調(diào)控區(qū)是CAG調(diào)控區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,CAG調(diào)控區(qū)具有 序列表SEQ ID Ν0:1的序列。
[0129] 在另一實(shí)施方式中,轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)是脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。
[0130] 如果啟動(dòng)子對(duì)脂肪組織特異,則增強(qiáng)子不需要也對(duì)脂肪組織特異??商娲?,轉(zhuǎn)錄 調(diào)控區(qū)可以包含脂肪組織特異的啟動(dòng)子和脂肪組織特異的增強(qiáng)子。
[0131] 在一種實(shí)施方式中,組織特異的啟動(dòng)子是脂肪細(xì)胞特異的啟動(dòng)子,如,例如脂肪細(xì) 胞蛋白2(aP2,也稱作脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4))、PPARy啟動(dòng)子、脂連素啟動(dòng)子、磷酸烯醇丙 酮酸羧激酶(PEPCK)啟動(dòng)子,該啟動(dòng)子源自人類芳香酶細(xì)胞色素 p450(p450arom)和Foxa-2 啟動(dòng)子。參見(jiàn)上文的01&¥6 8(1991)、1?〇88(1990)、3;[1]^)8〇11(1]3 5,446,143)、]\^11611(11'〇〇 (1993)、Simpson(1993)和Sasaki(1994)。
[0132] 在一種實(shí)施方式中,增強(qiáng)子區(qū)選自由脂肪特異aP2增強(qiáng)子和脂肪特異UCP1增強(qiáng)子 組成的組。
[0133] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中,根據(jù)本發(fā)明的AAV的脂肪組織特異調(diào)控區(qū)包含脂肪特異aP2 增強(qiáng)子和鼠類aP2基本啟動(dòng)子(基本鼠類ap2啟動(dòng)子,basal murine aP2 promoter)。在特定 的實(shí)施方式中,mini/aP2調(diào)控區(qū)具有序列表SEQ ID NO:2的序列。
[0134] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中,根據(jù)本發(fā)明的AAV的脂肪組織特異調(diào)控區(qū)包含脂肪特 異UCP1增強(qiáng)子和大鼠 UCP1基本啟動(dòng)子(基本大鼠 UCP1啟動(dòng)子,basal rat UCP1 promoter)。 在特定的實(shí)施方式中,mini/UCPl調(diào)控區(qū)具有序列表SEQ ID N0:3的序列。
[0135] 在另一實(shí)施方式中,表達(dá)框進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,轉(zhuǎn)錄 后調(diào)控區(qū)是WPRE或其功能變體和片段,以及PPT-CTS或其功能變體和片段。
[0136] 其他適合的感興趣的多核苷酸可以用本發(fā)明的AAV載體并且用于疾病的治療或預(yù) 防。參見(jiàn)表1。
[0137] 表1
[0138] 感興趣的多核苷酸 Γηι^9?
[0140]如本文中使用的術(shù)語(yǔ)"需要感興趣的多核苷酸的表達(dá)的疾病"是指任何其中期望 感興趣的多核苷酸的表達(dá)的疾病。如本文中描述的感興趣的多核苷酸可以是編碼感興趣的 多肽的基因,或可替代地,在轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中內(nèi)源多核苷酸的表達(dá)的分子的核 酸序列。因此,需要感興趣的多核苷酸的表達(dá)的疾病可以是,其中期望增加或降低基因的表 達(dá)水平的疾病。
[0141] 此外,感興趣的多核苷酸可以編碼分泌并作用于全身的蛋白,或作用于脂肪細(xì)胞 或其附近區(qū)域的蛋白。在特定的實(shí)施方式中,需要感興趣的多核苷酸的表達(dá)的疾病是需要 感興趣的多核苷酸在脂肪組織中,更優(yōu)選地,在白色脂肪組織或褐色脂肪組織中的表達(dá)的 疾病。
[0142] 需要感興趣的多核苷酸的表達(dá)的疾病的實(shí)例包括,但不限于肥胖癥、高血糖、胰島 素耐受、2型糖尿病、高血壓、癌癥、心臟病、免疫性疾病、關(guān)節(jié)炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和衰 老相關(guān)的疾病。
[0143] 已經(jīng)證明本發(fā)明的AAV對(duì)脂肪組織相關(guān)的疾病的基因治療是有用的,如在WAT和 BAT二者中由本發(fā)明的AAV介導(dǎo)的己糖激酶的遞送,以增加基礎(chǔ)葡萄糖攝取。參見(jiàn)圖2D和4B。 因此在特定的實(shí)施方式中,需要調(diào)節(jié)感興趣的多核苷酸的表達(dá)的疾病是選自由肥胖癥、高 血糖、胰島素耐受性、2型糖尿病和高血壓的組成的組中的疾病。
[0144] 示例性的基因與相關(guān)的疾病狀態(tài)包括,但不限于用于治療糖尿病的胰島素、用于 治療囊腫性纖維化的CFTR、用于治療乙型血友病(hemophilia B)的IX因子、用于治療甲型 血友病(hemophilia A)的VIII因子、葡萄糖-6-磷酸酶,與肝糖貯積癥1A型相關(guān);磷酸烯醇 丙酮酸-羧基酶,與Pepck不足相關(guān);半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶,與半乳糖血癥相關(guān);苯丙 氨酸羥化酶,與苯丙酮尿癥相關(guān);支鏈α-酮酸脫氫酶,與楓糖尿癥相關(guān);富馬酰乙酰乙酸水 解酶,與1型酪氨酸血癥相關(guān);甲基丙二酰-輔酶Α變位酶,與甲基丙二酸血癥相關(guān);中鏈?;?輔酶A脫氫酶,與中鏈?;o酶A缺乏癥相關(guān);鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶,與鳥(niǎo)氨酸氨甲?;D(zhuǎn) 移酶缺之癥相關(guān);精氣基瑰?白酸合成酶,與瓜氣酸血癥相關(guān);低密度脂蛋白受體蛋白,與家 族性高膽固醇血癥相關(guān);UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucouronosyl transferase ),與克 里格勒-納賈爾癥(Crigler-Najjar disease)相關(guān);腺苷酸脫胺酶,與重度聯(lián)合免疫缺陷疾 病相關(guān);次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶,與痛風(fēng)(Gout)和Lesch-Nyan綜合癥相關(guān);生物素 酶,與生物素酶缺乏癥相關(guān);葡糖腦苷酯酶,與高歇疾病相關(guān);葡糖醛酸糖苷酶與斯賴 (Sly)綜合癥相關(guān);過(guò)氧化物酶體膜蛋白70kDa,與Zel lweger綜合癥相關(guān);膽色素原脫氨酶, 與急性間歇性卟啉癥相關(guān);α-l抗胰蛋白酶,用于治療α-l抗胰蛋白酶缺乏癥(肺氣腫);紅細(xì) 胞生成素,用于治療由于地中海貧血或腎衰竭的貧血;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管生成素-1和 纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子,用于治療缺血性疾病;血栓調(diào)節(jié)蛋白和組織因子途徑抑制物,用于治 療如在,例如動(dòng)脈粥樣硬化、血栓、或栓塞中所見(jiàn)的閉塞的血管;芳香族氨基酸脫羧酶 (AADC)和酪氨酸脫羧酶(ΤΗ),用于治療帕金森癥;β-腎上腺素能受體,受磷蛋白的反義或突 變形式、肌質(zhì)(內(nèi)質(zhì))網(wǎng)腺苷三磷酸酶_2(SERCA2)和心臟腺苷酸環(huán)化酶,用于治療充血性心 力衰竭;腫瘤抑制基因,如P53,用于治療各種癌癥;細(xì)胞因子,如各種白細(xì)胞介素之一,用于 治療炎性和免疫功能失調(diào)以及癌癥;肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白或小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白 (minidystrophin)和肌營(yíng)養(yǎng)相關(guān)蛋白(utrophin)或小肌營(yíng)養(yǎng)相關(guān)蛋白(miniutrophin)用 于治療肌營(yíng)養(yǎng)不良;腺苷脫氨酶(ADA),用于治療腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥;亨廷頓蛋白 (HTT),用于治療亨廷頓氏舞蹈癥;低密度脂蛋白受體(LDLR)或脫脂蛋白B(APOB),用于治療 家族性高膽留醇血癥;苯基丙氨酸羥化酶(PAH),用于治療苯丙酮尿癥;多囊性腎病變1 (PKD1)和多囊性腎病變2(PKD2),用于治療多囊性腎病變;TNFR:Fc,用于治療關(guān)節(jié)炎;AAT, 用于治療遺傳性肺氣腫;肌聚糖,用于治療肌肉萎縮癥;GAD65或GAD67,用于治療帕金森氏 病,AAC,用于治療卡納萬(wàn)氏?。–anava ' s disease),CLN2,用于治療巴滕氏?。˙atten ' s disease),NGF,用于治療阿爾茨海默氏病;VEGF拮抗劑,用于治療黃斑變性;IGF/HGF,用于 治療充血性心力衰竭,NGF,用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂;以及針對(duì)HIV的中和抗體,用于治 療 HIV、HIV 感染、或 AIDS。
[0145] 可以通過(guò)本發(fā)明的AAV遞送的感興趣的多核苷酸的實(shí)例包括但不限于,己糖激酶、 葡糖激酶、UCP2、UCP3、PPAR-α、瘦素、瘦素受體ΟΒ-Rb和GLP-1。在特定的實(shí)施方式中,感興趣 的基因選自由己糖激酶(HK)、葡糖激酶(GK)、堿性磷酸酶(AP)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) 組成的組。在另一種實(shí)施方式中,將包含表達(dá)己糖激酶或葡糖激酶的多核苷酸的本發(fā)明的 AAV給予需要其的受試者用于治療或預(yù)防2型糖尿病。在另一實(shí)施方式中,將包含表達(dá)血管 內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的多核苷酸的本發(fā)明的AAV給予需要其的受試者用于治療或預(yù)防肥胖癥。
[0146] 可以用本發(fā)明的方法治療的疾病的示例性的,但是非限制性的實(shí)例包括肥胖癥、 高血糖、胰島素耐受性、2型糖尿病、高血壓和高動(dòng)脈壓。優(yōu)選地,2型糖尿病可以通過(guò)在脂肪 細(xì)胞附近區(qū)域或全身表達(dá)瘦素使其到達(dá)下丘腦來(lái)治療。
[0147] 此外,已經(jīng)證明本發(fā)明的AAV對(duì)BAT的遺傳工程是有用的,因?yàn)橥ㄟ^(guò)AAV 9-mini/ UCP1的VEGF164的內(nèi)部iBAT給予導(dǎo)致總VEGF表達(dá)水平的增加和iBAT中血管數(shù)量增加。參見(jiàn) 圖4C-4F。因此,在特定的實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及本發(fā)明的AAV或藥物組合物用于治療或預(yù) 防需要VEGF表達(dá)的疾病,例如對(duì)該疾病的管理可以受益于誘導(dǎo)血管生成、動(dòng)脈生成、或血管 發(fā)生的那種疾病。需要VEGF的表達(dá)的疾病的實(shí)例包括,但不限于急性外科手術(shù)和外傷傷口、 燒傷、燙傷、靜脈性潰瘍、動(dòng)脈性潰瘍、褥瘡性潰瘍(pressure sore)(又名褥瘡(decubitus ulcer))、糖尿病性潰瘍、輻射后傷口、皮膚移植、混合病因的潰瘍和其他慢性的或壞死性的 傷口。
[0148] 此外,用AAV9_mini/aP2病毒載體的hSeAP基因(即源自人類胎盤的分泌的堿性磷 酸酶)的內(nèi)部eWAT給予導(dǎo)致hSeAP的循環(huán)水平的持續(xù)增加。因此,在特定的實(shí)施方式中,本發(fā) 明涉及本發(fā)明的AAV或藥物組合物,以用于治療或預(yù)防需要AP的表達(dá)的疾病,LPS(即脂多 糖)介導(dǎo)的或惡化的疾病。需要AP的表達(dá)的疾病的實(shí)例包括,但不限于炎癥性腸病、敗血癥 或膿毒性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、腦膜炎球菌血癥、創(chuàng)傷失血性休克、人身傷害 (hum injury)、心血管外科手術(shù)或心肺轉(zhuǎn)流術(shù)、肝臟手術(shù)或移植、肝病、胰腺炎、壞死性小腸 結(jié)腸炎、牙周病、肺炎、囊腫性纖維化、哮喘、冠心病、充血性心力衰竭、腎病、溶血性尿毒癥、 腎臟透析、癌癥、阿爾茲海默氏病和自身免疫性疾病,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼 瘡。
[0149] 4.用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法
[0150] 在第三方面,本發(fā)明涉及通過(guò)使用本發(fā)明的AAV載體用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法。因 此,本發(fā)明還涉及用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法,包括將所述細(xì)胞與包含重組病毒基因組的AAV 接觸,其中,所述重組病毒基因組包含表達(dá)框,該表達(dá)框包含與感興趣的多核苷酸可操作地 連接的脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。
[0151]在優(yōu)選的實(shí)施方式中,用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法的腺相關(guān)病毒載體具有選自由 AAV6、AAV7、AAV8和AAV9血清型所組成的組的血清型。在另一實(shí)施方式中,腺相關(guān)病毒ITR是 AAV2ITR。
[0152]在另一實(shí)施方式中,腺相關(guān)病毒載體包含脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。在又一實(shí) 施方式中,脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包含選自鼠類aP2基本啟動(dòng)子和大鼠 UCP1基本啟動(dòng) 子組成的組的啟動(dòng)子區(qū)。在又一實(shí)施方式中,脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)一步包含與啟 動(dòng)子區(qū)可操作地連接的增強(qiáng)子區(qū)。在又一實(shí)施方式中,增強(qiáng)子區(qū)選自由脂肪特異aP2增強(qiáng)子 和脂肪特異UCP1增強(qiáng)子組成的組。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中,脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū) 選自由以下組成的組:
[0153] i)包含脂肪特異aP2增強(qiáng)子和鼠類aP2基本啟動(dòng)子的多核苷酸以及
[0154] i i)包含脂肪特異UCP1增強(qiáng)子和大鼠 UCP1基本啟動(dòng)子的多核苷酸。
[0155] 在另一實(shí)施方式中,表達(dá)框進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)。在又一實(shí)施方式中,該轉(zhuǎn)錄 后調(diào)控區(qū)是WPRE。
[0156] 在另一實(shí)施方式中,感興趣的多核苷酸編碼選自由作用于全身的分泌蛋白和作用 于所述脂肪細(xì)胞或其附近區(qū)域的蛋白組成的組中的蛋白。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中,感興趣 的多核苷酸編碼選自由己糖激酶、葡糖激酶、堿性磷酸酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子組成的組的 蛋白。
[0157] 在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及用于用包含重組病毒基因組的AAV體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞 的方法,其中,所述重組病毒基因組包含表達(dá)框,該表達(dá)框包含與感興趣的多核苷酸可操作 地連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū),其中,AAV的血清型選自由AAV6、AAV7、AAV8和AAV9組成的組。
[0158] 在一種實(shí)施方式中,腺相關(guān)病毒ITR是AAV2ITR。
[0159] 在另一實(shí)施方式中,腺相關(guān)病毒載體包含含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的重組基因組。在一種 實(shí)施方式中,該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)是組成型啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,該組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包 含肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。在又一實(shí)施方式中,該組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)一步包含與啟動(dòng)子區(qū)可操 作地連接的增強(qiáng)子區(qū)。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中,該增強(qiáng)子區(qū)是巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子。
[0160] 在一種實(shí)施方式中,轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)是脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。在又一實(shí)施方式 中,脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包含選自由鼠類aP2基本啟動(dòng)子和大鼠 UCP1基本啟動(dòng)子組 成的組的啟動(dòng)子區(qū)。在再一實(shí)施方式中,脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)一步包含與啟動(dòng)子 區(qū)可操作地連接的增強(qiáng)子區(qū)。在又一實(shí)施方式中,增強(qiáng)子區(qū)選自由脂肪特異aP2增強(qiáng)子和脂 肪特異UCP1增強(qiáng)子組成的組。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中,脂肪組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)選自 由以下組成的組:
[0161] i)包含脂肪特異aP2增強(qiáng)子和鼠類aP2基本啟動(dòng)子的多核苷酸以及
[0162] ii)包含脂肪特異UCP1增強(qiáng)子和大鼠 UCP1基本啟動(dòng)子的多核苷酸。
[0163] 在另一實(shí)施方式中,表達(dá)框進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)。在又一實(shí)施方式中,該轉(zhuǎn)錄 后調(diào)控區(qū)是WPRE。
[0164] 在另一實(shí)施方式中,感興趣的多核苷酸編碼選自由以下所組成的組的蛋白:作用 于全身的分泌蛋白和作用于所述脂肪細(xì)胞或其附近區(qū)域的蛋白。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式 中,感興趣的多核苷酸編碼選自由己糖激酶、葡糖激酶、堿性磷酸酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子組 成的組的蛋白。
[0165] 使用本發(fā)明的體外方法可以轉(zhuǎn)導(dǎo)任何細(xì)胞。在特定的實(shí)施方式中,AAV用于轉(zhuǎn)導(dǎo)脂 肪組織細(xì)胞。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中,脂肪組織細(xì)胞是褐色脂肪細(xì)胞或白色脂肪細(xì)胞。
[0166] 當(dāng)進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的體外方法以轉(zhuǎn)導(dǎo)白色脂肪細(xì)胞時(shí),AAV內(nèi)的 轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)優(yōu)選地包含mini/aP2調(diào)控區(qū)。在另一實(shí)施方式中,當(dāng)進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的用于轉(zhuǎn) 導(dǎo)細(xì)胞的體外方法以轉(zhuǎn)導(dǎo)棕色脂肪細(xì)胞時(shí),AAV內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)優(yōu)選地包含表達(dá)框,該表達(dá) 框包含mini/UCPl調(diào)控區(qū)。
[0167] 在本發(fā)明的另一方面,為改善由mini/aP2和mini/UCPl啟動(dòng)子獲得的轉(zhuǎn)基因表達(dá), CAG啟動(dòng)子與組織特異的miRNA靶序列結(jié)合使用,以求獲得脂肪組織中的高表達(dá)水平和由脫 靶器官的去靶轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這導(dǎo)致當(dāng)局部或全身給予時(shí),AAV載體遺傳性修改脂肪組織的潛 力進(jìn)一步加強(qiáng)。
[0168] 在另外的實(shí)施方式,本發(fā)明涉及通過(guò)使用本發(fā)明的AAV載體并將它們?cè)隗w外培養(yǎng) 用于分離體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的方法。在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及所述分離的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以 及該細(xì)胞和包含它們的藥物組合物。
[0169] 5.轉(zhuǎn)導(dǎo)的脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞細(xì)胞組合物,離體治療方法
[0170] 在第四方面,本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明的體外方法獲得的脂肪細(xì)胞。在另一實(shí)施方 式中,本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的脂肪細(xì)胞的細(xì)胞組合物。此外,本發(fā)明還涉 及包含根據(jù)本發(fā)明的AAV的基因組的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞細(xì)胞組合物。優(yōu)選地,至少50%的 細(xì)胞組合物包含根據(jù)本發(fā)明的脂肪細(xì)胞。更優(yōu)選地,至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %和 100%的細(xì)胞組合物包含根據(jù)本發(fā)明的脂肪細(xì)胞。
[0171] 如上所述,本發(fā)明的AAV可用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以將感興趣的多核苷酸引入所述細(xì) 胞。接著,可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞植入人或動(dòng)物體內(nèi)以獲得期望的治療效果。
[0172] 因此,在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的脂肪細(xì)胞的 脂肪細(xì)胞或細(xì)胞組合物用于在藥物中使用。
[0173] 在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的脂肪細(xì)胞的脂肪細(xì) 胞或細(xì)胞組合物,以用于需要感興趣的多核苷酸的表達(dá)的疾病的治療。
[0174] 在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防疾病的方法,其包括將根據(jù)本發(fā) 明的方法獲得的脂肪細(xì)胞或細(xì)胞組合物給予至需要其的受試者。可以用此途徑解決的疾病 的實(shí)例已經(jīng)在以上本發(fā)明的AAV的上下文中限定。
[0175] 6.多核苷酸、載體和質(zhì)粒
[0176] 在第五方面,本發(fā)明涉及對(duì)產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的AAV有用的多核苷酸。因此,在另一 實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及多核苷酸("本發(fā)明的多核苷酸"),其包含通過(guò)腺相關(guān)病毒ITR側(cè)接 的表達(dá)框,其中,所述表達(dá)框包含與感興趣的多核苷酸可操作地連接的脂肪組織特異調(diào)控 區(qū)。
[0177] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中,脂肪組織特異的調(diào)控區(qū)包含選自由鼠類aP2基本啟動(dòng)子和 大鼠 UCP1基本啟動(dòng)子的組的啟動(dòng)子區(qū)。
[0178] 在另一實(shí)施方式中,脂肪組織特異的調(diào)控區(qū)進(jìn)一步包含與啟動(dòng)子區(qū)可操作地連接 的增強(qiáng)子區(qū)。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中,增強(qiáng)子區(qū)選自由脂肪特異aP2增強(qiáng)子和脂肪特異 UCP1增強(qiáng)子組成的組。
[0179] 在另一實(shí)施方式中,該調(diào)控區(qū)選自由以下所組成的組:
[0180] i)包含脂肪的特異aP2增強(qiáng)子和鼠類aP2基本啟動(dòng)子的多核苷酸以及
[0181] ii)包含脂肪特異UCP1增強(qiáng)子和大鼠 UCP1基本啟動(dòng)子的多核苷酸。
[0182] 在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)框進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。在 又一實(shí)施方式中,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)是WPRE。
[0183] 在另一實(shí)施方式中,包含在本發(fā)明的多核苷酸中的感興趣的多核苷酸編碼選自由 己糖激酶、葡糖激酶、堿性磷酸酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子組成的組的蛋白。
[0184] 本發(fā)明的多核苷酸可以結(jié)合至載體如,例如質(zhì)粒。因此,在另外的實(shí)施方式中,本 發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體或質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明,術(shù)語(yǔ)"載體"和"質(zhì)粒"是可互 換的。
[0185] 在特定的實(shí)施方式中,本發(fā)明的多核苷酸結(jié)合至腺相關(guān)的病毒載體或質(zhì)粒。優(yōu)選 地,所有的其他生產(chǎn)腺相關(guān)病毒所需的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)編碼序列不存在于病毒載體中,因?yàn)?可以將它們通過(guò)另一載體,如質(zhì)粒,或通過(guò)將序列穩(wěn)定地結(jié)合至包裝細(xì)胞系,以反式提供。
[0186] 本發(fā)明的多核苷酸可以使用本領(lǐng)域中已知的分子生物學(xué)技術(shù)獲得。參見(jiàn)上文的 Brown(1995)、Watson(1992)、Alberts(2008)、Innis(1990)、Erlich(1989)、Sambrook (1989)、Bishop( 1987)、Reznikoff( 1987)、Davis( 1986)和Schleef (2001)。在另一實(shí)施方式 中,本發(fā)明涉及AAV載體,其中,基因組包含本發(fā)明的多核苷酸。
[0187] 7.用于獲得AAV的方法
[0188] 在第六方面,本發(fā)明涉及用于獲得本發(fā)明的AAV的方法。所述AAV可以通過(guò)將本發(fā) 明的多核苷酸引入至組成型表達(dá)rep和cap的細(xì)胞來(lái)獲得。因此,在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明 涉及用于獲得腺相關(guān)病毒載體的方法,包括以下步驟:
[0189] i)提供包含由AAV ITR側(cè)接的本發(fā)明的多核苷酸、AAV cap蛋白、AAV rep蛋白或 AAV依賴于其復(fù)制的病毒或細(xì)胞蛋白的細(xì)胞,
[0190] ii)將該細(xì)胞維持在適合AAV組裝的條件下,以及
[0191] iii)純化由該細(xì)胞生產(chǎn)的腺相關(guān)病毒載體。
[0192] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中,構(gòu)成本發(fā)明的多核苷酸的部分的脂肪組織特異調(diào)控區(qū)包含 選自鼠類aP2基本啟動(dòng)子和大鼠 UCP1基本啟動(dòng)子的組的啟動(dòng)子區(qū)。
[0193] 在另一實(shí)施方式中,脂肪組織特異的調(diào)控區(qū)進(jìn)一步包含與啟動(dòng)子區(qū)可操作地連接 的增強(qiáng)子區(qū)。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中,增強(qiáng)子區(qū)選自由脂肪特異aP2增強(qiáng)子和脂肪特異 UCP1增強(qiáng)子組成的組。
[0194] 在另一實(shí)施方式中,該調(diào)控區(qū)選自由以下所組成的組:
[0195] i)包含脂肪的特異aP2增強(qiáng)子和鼠類aP2基本啟動(dòng)子的多核苷酸以及
[0196] ii)包含脂肪特異UCP1增強(qiáng)子和大鼠 UCP1基本啟動(dòng)子的多核苷酸。
[0197] 在另一實(shí)施方式中,本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)框進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。在 又一實(shí)施方式中,該轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)是WPRE。
[0198] 在另一實(shí)施方式中,包含在本發(fā)明的多核苷酸中的感興趣的多核苷酸編碼選自由 己糖激酶、葡糖激酶、堿性磷酸酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子組成的組的蛋白。
[0199] 用于載體化轉(zhuǎn)基因的重組AAV(rAAV)的生產(chǎn)已經(jīng)在前文描述。參見(jiàn)Ayuso E等, Curr.Gene Ther.2010;10:423-436、0kada T等,Hum.Gene Ther.2009;20:1013-1021、 Zhang Η等,Hum .Gene Ther. 2009; 20:922-929 和 Virag T等,Hum .Gene Ther. 2009; 20:807-817??梢允褂没蛐薷倪@些實(shí)驗(yàn)報(bào)告以生成本發(fā)明的AAV。在一種實(shí)施方式中,將生產(chǎn)細(xì)胞系 用本發(fā)明的多核苷酸(包含由ITR側(cè)接的表達(dá)框)以及用編碼rep和cap蛋白并且提供輔助功 能的結(jié)構(gòu)暫時(shí)轉(zhuǎn)染。在另一實(shí)施方式中,生產(chǎn)細(xì)胞系穩(wěn)定地提供輔助功能,并且用本發(fā)明的 多核苷酸(包含由ITR側(cè)接的表達(dá)框)以及用編碼rep和cap蛋白的結(jié)構(gòu)暫時(shí)轉(zhuǎn)染。在另一實(shí) 施方式中,細(xì)胞系穩(wěn)定地提供rep和cap蛋白以及輔助功能,并且用本發(fā)明的多核苷酸暫時(shí) 轉(zhuǎn)染。在另一實(shí)施方式中,細(xì)胞系穩(wěn)定地提供rep和cap蛋白,并且用本發(fā)明的多核苷酸以及 編碼輔助功能的多核苷酸暫時(shí)轉(zhuǎn)染。在又一實(shí)施方式中,細(xì)胞系穩(wěn)定地提供本發(fā)明的多核 苷酸、rep和cap蛋白以及輔助功能。制備并使用這些的方法和其他AAV生產(chǎn)系統(tǒng)已經(jīng)在本領(lǐng) 域中描述。參見(jiàn)Muzyczka N等,US 5,139,941、Zhou X等,US 5,741,683、Samulski R等,US 6,057,152、Samulski R等,US 6,204,059、Samulski R等,US 6,268,213、Rabinowitz J等, US 6,491,907、Zolotukhin S等,US 6,660,514、aienk T等,US 6,951,753、Snyder R等,US 7,094,604、Rabinowitz J等,US 7,172,893、Monahan P等,US 7,201,898、Samulski R等, US 7,229,823和Ferrari F等,US 7,439,065〇
[0200] 在另一實(shí)施方式中,可以通過(guò)提供兩種可以退火以形成頭接尾的串連體的基因組 的AAV ITR來(lái)增加 AAV的轉(zhuǎn)基因遞送容量。通常,當(dāng)AAV進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí),含有轉(zhuǎn)基因的單鏈 DNA由宿主細(xì)胞DNA聚合酶復(fù)合物轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA,其后ITR幫助在細(xì)胞核中形成串連體。作 為替代,AAV可以設(shè)計(jì)為自身互補(bǔ)(sc)的AAV,其使得病毒載體可以在進(jìn)入靶細(xì)胞時(shí)繞過(guò)第 二鏈合成的步驟,提供具有更快的,潛在更高的(例如多達(dá)100次折疊)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的scAAV 病毒載體。例如,可以將AAV設(shè)計(jì)為具有包含兩個(gè)相連的單鏈DNA的基因組,該單鏈DNA分別 編碼轉(zhuǎn)基因單元及其補(bǔ)體,其可以隨著遞送至靶細(xì)胞而結(jié)合,產(chǎn)出編碼感興趣的轉(zhuǎn)基因單 元的雙鏈DNA。自身互補(bǔ)的AAV已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述。參見(jiàn)Carter B,US 6,596,535、Carter B,US 7,125,717和Takano Η等,US 7,456,683〇
[0201] 已經(jīng)報(bào)告Cap蛋白對(duì)宿主嗜性、細(xì)胞、組織、或器官特異性、受體使用、侵染效率和 AAV病毒的免疫原性的具有作用。因此,可以考慮以下因素選擇用于rAAV的AAV Cap,例如受 試者的種族(例如,人類或非人類)、受試者的免疫狀態(tài)、受試者的對(duì)長(zhǎng)期或短期治療的適應(yīng) 性、或特定的治療應(yīng)用(例如,特定的疾病或失調(diào)的治療,或遞送至特定的細(xì)胞、組織、或器 官)。在另一實(shí)施方式中,rAAV Cap是基于來(lái)自兩種或三種或更多種的AAV血清型的Cap。在 特定的實(shí)施方式中,AAV cap基因源自血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、S AAV9。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,AAV cap基因源自血清型AAV6、AAV7、AAV8和AAV9。
[0202] 在一些實(shí)施方式中,用于本發(fā)明的方法的AAV Cap可以通過(guò)誘變(即通過(guò)插入、刪 除、或替代)前述AAV Cap或其編碼核酸之一生成。在一些實(shí)施方式中,AAV Cap與前述的一 種或多種AAV Cap相似至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%。
[0203]在一些實(shí)施方式中,AAV Cap是嵌合的,包含來(lái)自至少兩種前述AAV Cap的結(jié)構(gòu)域。 在一些實(shí)施方式中,AAV Cap是來(lái)自兩種或三種不同的AAV或重組AAV的VP1、VP2和VP3單體 的嵌合體。在一些實(shí)施方式中,rAAV組合物包含多于一種的前述Cap。
[0204] 在一些實(shí)施方式中,將用于rAAV組合物中的AAV Cap設(shè)計(jì)為包含異源序列或其他 修飾。例如,可以將賦予選擇性定位或免疫逃避的肽或蛋白序列設(shè)計(jì)進(jìn)入Cap蛋白??商娲?地或另外地,Cap可以化學(xué)改性,使得rAAV的表面是聚乙二醇化(即聚乙二醇修飾),其可以 促進(jìn)免疫逃避。Cap蛋白還可以是誘變的(例如,去除其天然受體結(jié)合,或掩蓋免疫原表位)。
[0205] 在特定的實(shí)施方式中,AAV rep基因源自血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、 AAV7、AAV8和AAV9。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,AAV rep和cap基因源自血清型 AAV9〇
[0206] 基因 AAV rep、AAV cap和提供輔助功能的基因可以通過(guò)使所述基因結(jié)合至載體, 例如質(zhì)粒,并將所述載體引入細(xì)胞而引入至細(xì)胞。可以將基因結(jié)合至相同的質(zhì)?;虿煌?質(zhì)粒。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,將AAV rep和cap基因結(jié)合至一種質(zhì)粒并將提供輔助功能的基 因結(jié)合至另一種質(zhì)粒。適用于本發(fā)明的方法的包含AAV rep和cap基因的質(zhì)粒的實(shí)例包括 口!11^19和?1^?6。3?載體。參見(jiàn)(:〇1丨8丨?,1]5 6,001,650和1?11886110等,1]5 6,156,30。在優(yōu) 選的實(shí)施方式中,提供輔助功能的基因源自腺病毒。
[0207] 本發(fā)明的多核苷酸以及包含AAV rep和cap基因或提供輔助功能的基因的多核苷 酸可以通過(guò)使用任何適合的本領(lǐng)域中已知的方法引入細(xì)胞。參見(jiàn)Ausubel等,Eds.,"Short Protocols in Molecular Biology",4th Ed.(John Wiley and Sons,Inc.,New York,NY, US,1997),上文的Brown( 1995)、Watson( 1992)、Alberts(2008)、Innis( 1990)、Erlich (1989)、Sambrook(1989)、Bishop(1987)、Reznikoff(1987)、Davis(1986)和Schleef (2001)。轉(zhuǎn)染方法的實(shí)例包括,但不限于用磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、聚凝胺共沉淀、電穿孔、顯 微注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合、脂轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和基因槍(bioli stic)轉(zhuǎn)染。在特定的 實(shí)施方式中,通過(guò)用磷酸鈣的共沉淀進(jìn)行轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞缺少任何AAV rep和cap基因以及提 供腺病毒輔助功能的基因的表達(dá)時(shí),可以將所述基因與本發(fā)明第一方面的多核苷酸同時(shí)引 入細(xì)胞??商娲?,可以將所述基因在引入本發(fā)明第一方面的多核苷酸之前或之后引入細(xì) 胞。在特定的實(shí)施方式中,將細(xì)胞與以下三種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染:
[0208] 1)包含本發(fā)明的多核苷酸的質(zhì)粒
[0209] 2)包含AAV rep和cap基因的質(zhì)粒
[0210] 3)包含提供輔助功能的基因的質(zhì)粒
[0211] 培養(yǎng)包裝細(xì)胞的方法和促進(jìn)AAV載體顆粒釋放,如產(chǎn)生細(xì)胞裂解物的示例性條件, 可以根據(jù)本文實(shí)施例中所描述地進(jìn)行。生產(chǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)適合的時(shí)段以促進(jìn)病毒載體釋放入介 質(zhì)。通常,細(xì)胞可以成長(zhǎng)約24小時(shí)、約36小時(shí)、約48小時(shí)、約72小時(shí)、約4天、約5天、約6天、約7 天、約8天、約9天、多達(dá)約10天。在約10天后(或更快,取決于培養(yǎng)條件和使用的特定的生產(chǎn) 細(xì)胞),生產(chǎn)水平通常顯著下降。通常,從產(chǎn)生病毒的點(diǎn)測(cè)量培養(yǎng)的時(shí)間。例如,在AAV的情況 下,通常當(dāng)在如本文中描述的適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)細(xì)胞中提供輔助病毒功能時(shí)開(kāi)始病毒產(chǎn)生。通常, 在輔助病毒侵染之后(或開(kāi)始產(chǎn)生病毒之后)約48至約100,優(yōu)選地約48至約96,優(yōu)選地約72 至96,優(yōu)選地約68至約72小時(shí)收獲細(xì)胞。
[0212] 本發(fā)明的AAV可以由:i)用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和ii)轉(zhuǎn)染后一段時(shí)間之 后,優(yōu)選地72小時(shí)后的所述細(xì)胞的培養(yǎng)基二者獲得??梢允褂萌魏斡糜诩兓瘉?lái)自所述細(xì)胞 或所述培養(yǎng)基的AAV以獲得本發(fā)明的AAV。在特定的實(shí)施方式中,遵循基于聚乙二醇沉淀步 驟和兩個(gè)連續(xù)的氯化銫(CsCl)梯度的優(yōu)化方法純化本發(fā)明的AAV。參見(jiàn)上文的Ayuso,2010。 本發(fā)明的純化的AAV可以用PBS滲析,過(guò)濾并在-80 °C下儲(chǔ)存。病毒基因組的滴度可以通過(guò)定 量PCR測(cè)定,該測(cè)定遵循對(duì)于使用線性化的質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的AAV2參考標(biāo)準(zhǔn)材料描述 的流程。參見(jiàn)Lock Μ等,Hum.Gene Ther.2010;21:1273-1285。
[0213] 在一些實(shí)施方式中,該方法進(jìn)一步包括純化步驟,如用核酸酶處理細(xì)胞裂解物,在 CsCl梯度上純化細(xì)胞裂解物,或通過(guò)硫酸肝素層析純化細(xì)胞裂解物。參見(jiàn)Halbert C等, Methods Mol·Biol·2004;246:201-212。
[0214] 適用于生產(chǎn)AAV的,各種自然發(fā)生的和重組的AAV、它們的編碼核酸、AAV Cap和Rep 蛋白和它們的序列、以及用于分離或產(chǎn)生、繁殖和純化這種AAV,以及特別是它們的衣殼的 方法是本領(lǐng)域中已知的。參見(jiàn)上文的63〇,2004、1?11886110等,1]3 6,156,303、!^1(1丨即6『]\1 等,US 7,056,502、Gao G等,US 7,198,951、Zolotukhin S,US 7,220,577、Gao G等,US 7, 235,393、Gao G等,US 7,282,199、Wilson J等,US 7,319,002、Gao G等,US 7,790,449、Gao G等,US 20030138772、Gao G等,US 20080075740、Hildinger M等,TO 2001/083692、Wilson J等,WO 2003/014367、Gao G等,TO 2003/042397、Gao G等,TO 2003/052052、Wilson J等, WO 2005/033321、Vandenberghe L等,WO 2006/110689、Vandenberghe L等,WO 2007/ 127264和Vandenberghe L等,WO 2008/027084。
[0215] 8.藥物組合物
[0216] 本發(fā)明的AAV可以通過(guò)傳統(tǒng)方法給予至人或動(dòng)物體,其需要所述載體在藥物組合 物中的制劑。因此,在第七方面,本發(fā)明涉及包含AAV的藥物組合物(以下稱為"本發(fā)明的藥 物組合物"),其中,所述AAV包含重組病毒基因組,其中,所述重組病毒基因組包含表達(dá)框, 該表達(dá)框包含與感興趣的多核苷酸可操作地連接的脂肪組織特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)??商娲?, 本發(fā)明的藥物組合物可以包含本發(fā)明的多核苷酸或多肽。
[0217] 所述藥物組合物可以包括在治療上有效量的本發(fā)明的AAV和藥學(xué)上可接受的載體 (carrier)〇
[0218] 本發(fā)明的組合物可以配制為用于遞送至動(dòng)物(例如家畜(牛、豬、其他))用于獸醫(yī) 學(xué)目的,以及遞送至其他非人類哺乳動(dòng)物受試者,以及人類受試者??梢杂蒙韺W(xué)可接受的 載體配制AAV以用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療應(yīng)用。制劑的劑量可以測(cè)量或計(jì)算為病毒顆?;?基因組拷貝("GC" )/病毒基因組("vg")。
[0219] 本領(lǐng)域中已知的任何方法可以用于測(cè)定本發(fā)明的病毒組合物的基因組拷貝(GC) 數(shù)。一種用于進(jìn)行AAV GC數(shù)滴定的方法如下:將純化的AAV載體樣品首先用脫氧核糖核酸酶 處理以除去未殼體化的AAV基因組DNA或來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程的污染質(zhì)粒DNA。然后使耐脫氧核糖 核酸酶的顆粒經(jīng)受熱處理以從衣殼中釋放基因組。隨后通過(guò)使用靶定病毒基因組的特定區(qū) 域的引物/探針組的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定釋放的基因組的數(shù)量。
[0220] 另外,可以以劑量單位配制病毒組合物以包含約1.0X109GC至約1.0X1015GC(以 治療平均體重70kg的受試者),并且優(yōu)選地1.0 X 1012GC至1.0 X 1014GC范圍內(nèi)的量的病毒載 體用于人類患者。優(yōu)選地,制劑中病毒的劑量是1.0X109GC、5.0X10 9GC、1.0X101()GC、5.0 X 1010GC、1 · 0 X 10nGC、5 · 0 X 10nGC、1 · 0 X 1012GC、5 · 0 X 1012GC、1 · 0 X 1013GC、5 · 0 X 1013GC、 1.0X1014GC、5.0X1014GCjl.0X10 15GC〇
[0221] 病毒載體可以以傳統(tǒng)方式使用一種或多種生理學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑配 制。AAV可以配置為通過(guò)注射(例如,通過(guò)彈丸式注射(bolus in jection)或持續(xù)輸注 (continuous infusion))進(jìn)行非消化道給予。用于注射的制劑可以以單位劑量(例如,安瓿 瓶或以多劑量容器)的形式存在,其中添加防腐劑。病毒組合物可以采取這些形式,如在油 性或水性媒介中的懸浮液、溶液或乳液,并可以包含配制劑,如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散 劑。AAV制劑的液體劑型可以通過(guò)傳統(tǒng)方法,用藥學(xué)上可接受的添加劑,如懸浮劑(例如,山 梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)、乳化劑(例如,卵磷脂或阿拉伯樹(shù)膠)、非水媒 介(例如,扁桃仁油、油性酯、乙醇或分餾的植物油)和防腐劑(例如,甲基或丙基-對(duì)羥基苯 酸酯或山梨酸)來(lái)制備。該劑型還可以含有緩沖鹽??商娲?,組合物可以是粉末形式,用于 在使用之前與適合的媒介(例如,無(wú)菌的無(wú)熱源的水)組合。
[0222] 還包括了輔劑與本發(fā)明的AAV結(jié)合或混合使用。預(yù)期的輔劑包括,但不限于無(wú)機(jī)鹽 輔劑或無(wú)機(jī)鹽凝膠輔劑、顆粒輔劑、微粒輔劑、粘膜輔劑和免疫刺激輔劑。
[0223] 可以將輔劑作為與本發(fā)明的AAV的混合物,或與AAV結(jié)合使用給予受試者。
[0224] 本發(fā)明的藥物組合物可以局部或全身給予。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,該藥物組合物 在要轉(zhuǎn)導(dǎo)其細(xì)胞的組織或器官附近給予。在特定的實(shí)施方式中,本發(fā)明的藥物組合物通過(guò) WAT內(nèi)部或BAT內(nèi)部注射局部給予至白色脂肪組織(WAT)或褐色脂肪組織(BAT)中。在另一優(yōu) 選的實(shí)施方式中,本發(fā)明的藥物組合物全身給予。
[0225] 藥物組合物可以根據(jù)常規(guī)方法配制為適合于靜脈注射、皮下、或肌內(nèi)給予至人類 的藥物組合物。注射劑可以以常規(guī)形式,作為液體溶液或懸浮液,在注射之前適用于液體中 的溶液或懸浮液的固體形式,或作為乳液制備。必要時(shí),組合物還可以包括,局部麻醉劑,如 利多卡因以便在注射位置止痛。當(dāng)組合物通過(guò)滲透給予時(shí),其可以省去含有藥物質(zhì)量的水 或鹽溶液的滲透瓶。當(dāng)通過(guò)注射給予組合物時(shí),可以提供用于注射的水瓶或無(wú)菌鹽溶液從 而可以在給予之前混合成分。
[0226] 術(shù)語(yǔ)"治療有效量"是指計(jì)算以產(chǎn)生期望的效果的本發(fā)明的多核苷酸、載體、多肽、 或藥物組合物的量,并且總體上連同其它原因,由本發(fā)明的多核苷酸、載體、多肽和藥物組 合物的自身特征以及要獲得的療效決定。通過(guò)本文描述的或本領(lǐng)域另外已知的標(biāo)準(zhǔn)臨床技 術(shù)測(cè)定在疾病的治療中有效的本發(fā)明的多核苷酸、載體、多肽或藥物組合物的量。此外,還 可以可選地使用體外測(cè)定以幫助確定最佳的劑量范圍。在制劑中使用的精確的劑量取決于 給予途徑,和病情的嚴(yán)重性,并且應(yīng)該以醫(yī)生的判斷決定并取決于每個(gè)患者的情況。有效劑 量可以推斷自來(lái)自于體外試驗(yàn)系統(tǒng)或動(dòng)物中的模型的一對(duì)劑量響應(yīng)曲線。對(duì)于全身給予, 治療有效劑量可以最初由體外試驗(yàn)估計(jì)。例如,可以在動(dòng)物模型中配制劑量以達(dá)到包括已 經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC50的循環(huán)濃度范圍。所述信息可用于精確地測(cè)定人類中有用的劑 量。首次劑量還可以估計(jì)自使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)的體內(nèi)數(shù)據(jù)(例如動(dòng)物模型)。本領(lǐng) 域中的普通技術(shù)人員可以容易地基于動(dòng)物中的數(shù)據(jù)優(yōu)化對(duì)人類的給予。
[0227] 這種全身給予包括,但不限于任何意味著并不直接注入脂肪組織的給予途徑。更 特別地,全身給予包括本發(fā)明的多核苷酸、載體、多肽和藥物組合物的全身注射,如肌內(nèi) (im)、血管內(nèi)(ie)、動(dòng)脈內(nèi)(ia)、靜脈內(nèi)(iv)、腹膜內(nèi)(ip)、皮下或經(jīng)皮注射。外周給予還包 括本發(fā)明的多核苷酸、載體、多肽和藥物組合物的口腔給予,使用植入物遞送、或使用噴霧 劑、氣霧劑或任何其他適當(dāng)?shù)闹苿┩ㄟ^(guò)呼吸系統(tǒng)(例如鼻內(nèi))滴注給予。優(yōu)選地,全身給予是 通過(guò)im、ip、ia或iv注射。最優(yōu)選地,通過(guò)iv注射給予本發(fā)明的多核苷酸、載體、多肽和藥物 組合物。參見(jiàn)During M,W0 1996/040954和Monahan P等,W0 2001/091803。
[0228] 本發(fā)明的藥物組合物可以以單一劑量給予,或在本發(fā)明的特定的實(shí)施方式中,可 以采用多次劑量(例如兩次、三次、四次、或更多次給予)以達(dá)到治療效果。優(yōu)選地,當(dāng)需要多 次劑量時(shí),包含在本發(fā)明的藥物組合物中的AAV來(lái)自不同的血清型。
[0229] 所有上文提及的公開(kāi)通過(guò)引證將它們的整體結(jié)合在此。
[0230]雖然已經(jīng)為了清楚和理解,較詳細(xì)地描述了前述發(fā)明,本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀 本公開(kāi)應(yīng)該理解的是,可以在形式和細(xì)節(jié)上做出各種改變而不偏離本發(fā)明和所附權(quán)利要求 的真實(shí)范圍。
[0231 ] -般方法
[0232] 1.受試者特性
[0233] 使用8-12周大的雄性ICR小鼠、9-13周大的C57B1/6J小鼠和8周大的B6.V-Lep° b/ OlaHsd(ob/ob)和BKS · Cg-+Leprdb/+Leprdb/01 aHsd(db/db)小鼠。小鼠用標(biāo)準(zhǔn)食物(Teklad Global【)ietSK,Harlan Labs ·,Inc ·,Madison,WI,US)自由米食,并在光暗周期下(在8: 00a . m .光照)保持12h。對(duì)于組織采樣,將小鼠通過(guò)吸入麻醉異氟烷(丨s〇Fbl:,Abbo11 Laboratories,Abbott Park,IL,US)麻醉并割去頭部。切離感興趣的組織并在-80°C下或使 用甲醛保存直至分析。
[0234] 2.重組AAV載體
[0235] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法,通過(guò)HEK293細(xì)胞的三次轉(zhuǎn)染產(chǎn)生載體。參見(jiàn)上文的Ayuso,2010。在 10個(gè)滾瓶中(850cm2,平面;Corning?,Sigma-Aldrich Co·,Saint Louis,M0,US) 10%FBS的 DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞至80 %細(xì)胞覆蓋,并通過(guò)磷酸鈣方法,用攜帶由AAV2ITR側(cè)接的表達(dá)框的質(zhì) 粒、攜帶AAV2rep基因和AAV血清型1、2、4、5、6、7、8或9的cap基因的輔助質(zhì)粒、以及攜帶輔助 功能腺病毒的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。使用的轉(zhuǎn)基因是:a)由以下驅(qū)動(dòng)的eGFP:al)雜交巨細(xì)胞病毒增 強(qiáng)子/雞肌動(dòng)蛋白組成型啟動(dòng)子(CAG)和WPRE調(diào)控元件,a2)鼠 mini/aP 2調(diào)控區(qū)或a3)小 鼠 mini/UCP1調(diào)控區(qū);b)由以下驅(qū)動(dòng)的鼠類己糖激酶II (mΗKII)cDNA: b 1)CΜV遍在啟動(dòng)子 (ubiquitous promoter)和WPRE,b2)鼠 mini/aP2調(diào)控區(qū)或b3)小鼠 mini/UCPl調(diào)控區(qū),c)由 鼠 mini/aP2調(diào)控區(qū)和WPRE源自人類胎盤的分泌的堿性磷酸酶(hSeAP),d)由小鼠 mini/UCPl 調(diào)控區(qū)驅(qū)動(dòng)的鼠類VEGF! 64,和e)由CMV遍在啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的RFP。參見(jiàn)上文的Ro s s,199 0、 Graves,1992 和 Cassard-Doulcier,1998。使用攜帶 CMV啟動(dòng)子的非編碼質(zhì)粒(pAAV-MCS, Stratagene?, Agilent Technologies,Inc ·,Santa Clara,CA,US)、mini/aP2調(diào)控區(qū)或 mini/UCPl調(diào)控區(qū)以及多克隆位點(diǎn)產(chǎn)生空顆粒。AAV利用基于聚乙二醇沉淀步驟和兩個(gè)連續(xù) 的氯化銫(CsCl)梯度的優(yōu)化的方法進(jìn)行純化。這種第二代的基于CsCl的方法顯著地減少了 空AAV衣殼以及DNA和蛋白雜質(zhì)。參見(jiàn)上文的Ayuso,2010??梢詫⒓兓腁AV載體對(duì)roS進(jìn)行 滲析,過(guò)濾并在-80 °C下保存。病毒基因組的滴度通過(guò)定量PCR確定,該定量PCR遵循對(duì)于使 用線性化的質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的AAV2參考標(biāo)準(zhǔn)材料描述的方法。參見(jiàn)Lock Μ等, Hum.Gene Ther.2010;21:1273-1285。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)造載體。參見(jiàn) 上文的Brown( 1995)、Watson( 1992)、Alberts(2008)、Innis( 1990)、Erlich( 1989)、 Sambrook(1989)、Bishop(1987)、Reznikoff(1987)、Davis(1986)和Schleef(2001)〇
[0236] 3.體內(nèi)AAV載體的eWAT內(nèi)部給予
[0237] 將小鼠用氯胺酮(lOOmg/kg)和賽拉嗪(lOmg/kg)的腹膜內(nèi)注射麻醉。進(jìn)行剖腹術(shù) 以暴露附睪的白色脂肪組織。將AAV載體再懸浮于具有或不具有2%普蘭尼克?88 0八5? Corp.,F(xiàn)lorham Park,NJ,US)的鹽溶液中并直接注射入附睪脂墊。每個(gè)附睪脂墊用50yL的 AAV溶液注射兩次(一次注射接近睪丸并且另一次在脂墊中部)。用無(wú)菌鹽溶液漂洗腹部并 且用兩層方法閉合。
[0238] 4.體內(nèi)AAV載體的iBAT內(nèi)部和iWAT內(nèi)部給予。
[0239]將小鼠用氯胺酮(100mg/kg)和賽拉嗪(10mg/kg)的腹膜內(nèi)注射麻醉。在肩胛間或 腹股溝區(qū)域切開(kāi)縱向1.5-2cm長(zhǎng)的切口,以分別暴露iBAT或iWAT。使用漢密爾頓注射器使每 個(gè)iBAT或iWAT接受4次10μ1的AAV溶液的注射將載體分散至整個(gè)庫(kù)。使用一層方法閉合皮 膚。
[0240] 5. AAV載體的全身給予
[0241] 將適量的AAV溶液在200yL的鹽溶液中稀釋并在遞送時(shí)手動(dòng)注射入尾部側(cè)靜脈而 不施加壓力。在注射之前,將動(dòng)物置于250W的紅外加熱燈(Philips NV,Amsterdam,NL)下幾 分鐘以擴(kuò)張血管并便于觀察且更易達(dá)到尾部靜脈。使用塑料限制器(Harvard Apparatus, Holliston,MA,US)固定動(dòng)物用于注射。由于采用適當(dāng)?shù)南拗蒲b置,不使用麻醉。利用30針徑 的針對(duì)動(dòng)物注射。
[0242] 6.免疫組織化學(xué)
[0243] 將組織在甲醛中固定12至24小時(shí),嵌入石蠟,并切片用于GFP、RFP和α-SMA的檢測(cè)。 將切片用1:300稀釋的羊抗GFP抗體(Abeam pic,Cambridge,MA,US)、用1/400稀釋的兔抗 RFP抗體(Abeam pic,Cambridge,MA,US)或用 1/300稀釋的鼠抗-α-SMA抗體(Sigma-Aldrich Co.,Saint Louis,M0,US)在4°C下溫育過(guò)夜。將1:300稀釋的生物素化的驢抗山羊抗體 (Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA,US),或 1/300稀釋的生物素化的羊抗 兔抗體(Pierce Antibodies,Thermo Fisher Scientific Inc. ,Rockford,IL,US)g!cl/300 稀釋的生物素化的馬抗鼠抗體(Vector Laboratories,Burl ingame,CA,US)用作第二抗體。 將 1:300稀釋的鏈霉親和素 Alexa Fluor 488(Streptavidine Alexa Fluor 488) (MolecularPr〇bes_?,Life Technologies Corp.,0&^]^&(1,〇厶,1]3)用作焚光染料并且將 Hoescht bisbenzimide(Sigma-Aldrich Co.,Saint Louis,M0,US)用于細(xì)胞核對(duì)比染色。 可替代地,使用1:50稀釋的ABC過(guò)氧物酶試劑盒(Pierce Biotechnology,Inc ·,Rockford, IL,US)并將切片在Mayer的蘇木精中對(duì)比染色。
[0244] 7 · eWAT樣品中β-半乳糖苷酶表達(dá)的分析
[0245] 為了檢測(cè)eWAT中存在的所有β-半乳糖苷酶,將組織樣品在4%多聚甲醛中固定lh, 在PBS溶液中洗滌兩次,并且然后在5mM K3Fe(CN)5、5mM K4Fe(CN)6和ImM MgCl2的PBS中的X-Gal(5_溴-4-氯-3-β-?-半乳糖苷(galactopyranoside))中在37°C下在黑暗中溫育6_8h。
[0246] 8 .GFP 含量
[0247] 為測(cè)定GFP含量,將組織在lmL的裂解緩沖液(PBS中,50mM/L Tris、l%Nonidet Ρ40、0·25%脫氧膽酸鈉、150mM/L NaCl、lmM/L EDTA,pH 7.4,無(wú)菌過(guò)濾)中用?〇1)^〇11知型 號(hào)組織勻漿器機(jī)械破碎并在室溫下溫育10分鐘。溫育之后,將樣品以14000rpm離心10分鐘。 將上層清液移至新管并且用具有488nm激發(fā)波長(zhǎng)和512nm發(fā)射波長(zhǎng)的閃光光譜儀FlxSOO (Bio-Tek Instruments,Inc,Winooski,VT,US)測(cè)量100yL的該溶液中的GFP含量。通過(guò)含有 蛋白的樣品校正總GFP含量值。
[0248] 9.來(lái)自附睪脂墊的脂肪細(xì)胞的分離
[0249] 使用改進(jìn)的Rodbell的方法分離AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的脂肪細(xì)胞。參見(jiàn)Rodbell M, J. Biol. Chem. 1964; 239:375-380。通過(guò)去除頭部處死異氟烷麻醉的小鼠并將附睪WAT切碎, 并在35-45分鐘中在37°C下在含有4%BSA(不含脂肪酸)、0.5mM/L葡萄糖和0.5mg/mL II型 膠原酶(C6885;Sigma_Aldrich Co.,Saint Louis,M0,US)的Krebs-Ringer碳酸氫鹽HEPES 緩沖液(KRBH)中消化。通過(guò)溫和的離心分離脂肪細(xì)胞并且用新鮮的不含膠原酶的沒(méi)有葡萄 糖的KRBH洗滌三次。將脂肪細(xì)胞再懸浮于不含葡萄糖的新鮮的KRBH中,并且如先前描述的 估計(jì)細(xì)胞數(shù)。參見(jiàn)DiGirolamo Μ等,Am.J.Physiol 1971;221:850-858。
[0250] 10.RNA 分析
[0251 ] 總RNA通過(guò)分別使用QIAzol裂解試劑(Qiagen NV,Venlo,NL)或tripure分離試劑 (Roche Diagnostics Corp ·,Indianapolis,IN,US),以及RNeasy脂質(zhì)組織迷你試劑盒 (Lipid Tissue Minikit)由分離的脂肪細(xì)胞和脂肪庫(kù)或肝臟獲得。為了除去殘留的病毒基 因組,用DNAsel(Qiagen NV,Venlo,NL)處理總RNA。對(duì)于RT-PCR,使用Superscript VIL0 cDNA合成試劑組(Invitrogen?,Life Technologies Corp.,0&18]^&(1,〇厶,1]3)逆轉(zhuǎn)錄](méi)^區(qū)的 RNA樣品。在使用EXPRESS SYBRGreen qPCR supermix(InvitrogenTM,Life Technologies Corp ·,Carslbad,CA,US)的 SmartCyclerll (Cepheid,Sunnyvale,USA)中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR。正義和反義寡核苷酸引物的序列是:
[0252]
[0253] 數(shù)據(jù)用36B4值標(biāo)準(zhǔn)化并如先前描述的進(jìn)行分析。參見(jiàn)Pfaffl M,Nucleic Acids Res·2001;29(9):e45。
[0254] 11.分離的脂肪細(xì)胞中的離體葡萄糖攝取
[0255] 對(duì)于來(lái)自小鼠的分離的脂肪細(xì)胞,如先前描述的,在不同的胰島素濃度下測(cè)量2-[1」H]脫氧-D-葡萄糖(2_DG;Amersham Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway,NJ,USM^ 取。參見(jiàn)Traxinger R等,J. Biol. Chem. 1989; 264:8156-8163。簡(jiǎn)要地,分離的脂肪細(xì)胞通過(guò) 來(lái)自如之前描述的飼養(yǎng)的小鼠的附睪WAT的膠原酶消化獲得。用KRBH+4%BSA(不含脂肪 酸)、lOmMAJ兌氧-葡萄糖、0.4yCi 2-[ 1」H]脫氧-D-葡萄糖和不同的胰島素濃度溫育250yL 的脂肪細(xì)胞懸液5分鐘。最終,在聚丙稀管中通過(guò)硅油(Sigma-Aldrich Co.,Saint Louis, M0,US)分離脂肪細(xì)胞和培養(yǎng)基,并且通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)評(píng)估脂肪細(xì)胞樣品中的放射性。結(jié) 果表示為pmol的2-[3H]-DG每10 6細(xì)胞每分鐘。
[0256] 12.體內(nèi)葡萄糖攝取
[0257] 如先前描述的測(cè)定體內(nèi)基礎(chǔ)葡萄糖利用指數(shù)。參見(jiàn)Franckhauser S等,Diabetes 2002; 51:624-630。簡(jiǎn)要地,將148GBq(4yCi)的不可代謝的葡萄糖類似物,脫氧-D-[ 1,2-3H] 葡萄糖(2_DG;PerkinElmer,Inc ·,胃&11:1^111,]\^,1]3)混合在1334-朽1檬酸鹽緩沖液中。在零時(shí) 間將放射性同位素標(biāo)記的混合物的閃爍注射劑(flash injection)給予麻醉的(氯胺酮+賽 拉嗪)飼養(yǎng)小鼠的頸靜脈中。如先前描述的,用注射后1、15和30分鐘獲得的25yL血液樣品 (尾部靜脈)測(cè)定具體的血液2-DG清除率。參見(jiàn)Somogyi M,J.Biol.Chem. 1945; 160:69-73。 在注射后30分鐘移除組織樣品。葡萄糖利用指數(shù)是通過(guò)測(cè)量放射性標(biāo)記化合物的積聚測(cè)定 的。參見(jiàn)Ferr6P等,Biochem. J. 1985; 228:103-110。將每毫克蛋白的2-DG-6磷酸酯的量除以 測(cè)量的2-DG與未標(biāo)記的葡萄糖的濃縮比的積分。因?yàn)橹挡皇怯善咸烟谴x途徑中的2-DG的 "判別常數(shù)(discrimination constant)"校正的,結(jié)果表示為葡萄糖利用的指數(shù),以每分鐘 皮摩爾每毫克的蛋白計(jì)。
[0258] 13.血液hSeAP水平的測(cè)量
[0259] 使用Tropix?Phospha-Light?系統(tǒng)(Applied Biosystems?,Life Technologies Corp.,Carslbad,CA,US),由5yL的血清測(cè)定循環(huán)hSeAP水平。
[0260] 14.統(tǒng)計(jì)分析
[0261 ] 所有的值表示為平均值土SEM。由學(xué)生t檢驗(yàn)(Student's t-test)比較組之間的差 值。在P〈〇. 05認(rèn)為差值是顯著的。
[0262] 實(shí)施例1
[0263] 通過(guò)AAV的局部給予的白色脂肪細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)
[0264] 為評(píng)估使用AAV載體的白色脂肪組織(WAT)的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,將4X1011病毒基因組 (vg)八鼠的AAV血清型1、2、4、5、6、7、8和9 (在遍在啟動(dòng)子CAG控制下編碼標(biāo)記蛋白GFP (AAV-CAG-GFP)),帶有或沒(méi)有非離子表面活性劑普蘭尼克F88,雙側(cè)注射入小鼠的附睪白色脂肪 組織(eWAT)中。參見(jiàn)Croyle Μ等,Mol · Ther · 2001 ;4: 22-28、Gebhart C等,J.Control Release 2001;73:401_416、Mizukami Η等,Hum.Gene Ther.2006;17:921-928和Sommer J 等,Mol. Ther. 2003; 7:122-128。如由在eWAT中針對(duì)GFP的免疫染色所評(píng)估的,不帶有普蘭尼 克F88的AAV1、AAV2、AAV4和AAV5的給予在注射兩個(gè)星期后導(dǎo)致非常低的白色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) 的百分比。此外,通過(guò)添加普蘭尼克F88沒(méi)有實(shí)現(xiàn)由任何測(cè)試的血清型介導(dǎo)的脂肪轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 的改善。參見(jiàn)圖1A。因此,對(duì)于隨后的實(shí)驗(yàn)棄去該非離子表面活性劑的使用。與普蘭尼克F88 的添加無(wú)關(guān),AAV1比AAV2、AAV4和AAV5在eWAT體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)中更加高效。參見(jiàn)上文的Mizukami, 2006。與由AAV1轉(zhuǎn)導(dǎo)的少量分散的脂肪細(xì)胞和極少的脂肪細(xì)胞的組相反,用AAV 6和AAV7注 射的動(dòng)物表現(xiàn)出多個(gè)較大的GFP+白色脂肪細(xì)胞的組。此外,用AAV8和AAV9處理的動(dòng)物示出 了大得多的eWAT的轉(zhuǎn)導(dǎo),并且每個(gè)eWAT區(qū)域絕大多數(shù)的脂肪細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)。參見(jiàn)圖1B。通過(guò)熒 光分析的給予兩個(gè)星期后的eWAT中的GFP含量的定量進(jìn)一步確認(rèn)血清型6、7、8和9的AAV比 AAV 1在eWAT體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)中是更高效的。參見(jiàn)圖1C。值得注意的的是用AAV8和AAV9注射的附睪 脂墊表現(xiàn)出最高的GFP含量,并且它們之間沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)差。參見(jiàn)圖1C。在單側(cè)eWAT內(nèi)部 給予2X10 nvg八鼠的,受遍在CMV啟動(dòng)子控制的編碼LacZ基因的AAV8(AA8-CMV-LacZ)兩個(gè)星 期之后,用LacZ底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)的染色表現(xiàn)出遍及eWAT轉(zhuǎn) 導(dǎo)的脂肪細(xì)胞的廣泛分布。參見(jiàn)圖1D。AA V8和AA V9-CAG-GFP載體局部給予至腹股溝WAT (iWAT)介導(dǎo)了該庫(kù)(depot)中白色和淺褐色脂肪細(xì)胞的大量轉(zhuǎn)導(dǎo)。參見(jiàn)圖1G和Η??偠灾?, 這些結(jié)果表明AAV8和AAV9是體內(nèi)遺傳 WAT最適合的載體。
[0265] 此外,AAV載體的eWAT內(nèi)部給予導(dǎo)致實(shí)際上局限于eWAT的轉(zhuǎn)導(dǎo)。注射兩個(gè)星期后, 用AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、或AAV9-CAG-GFP處理的動(dòng)物并沒(méi)有表現(xiàn)出腸系膜、腹膜后和腹股 溝庫(kù)的轉(zhuǎn)導(dǎo),然而少量的GFP+棕色脂肪細(xì)胞存在于用AAV9eWAT內(nèi)部注射的小鼠的iBAT中。 參見(jiàn)圖8A。然而,BAT中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)相比eWAT中檢測(cè)的極少。參見(jiàn)圖8B。關(guān)于非脂肪組織的 轉(zhuǎn)導(dǎo),AAV7、AAV8和AAV9-CAG-GFP的eWAT內(nèi)部給予還導(dǎo)致顯著的轉(zhuǎn)移至肝臟和心臟以及至 較少數(shù)量的胰腺的外分泌細(xì)胞的基因。參見(jiàn)圖8C。
[0266] 作為構(gòu)思的證明,評(píng)估體內(nèi)AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的脂肪細(xì)胞是否可以是研究脂肪功能的可行 的模型,將4 X 10nvg八鼠的,受遍在啟動(dòng)子CMV控制的,編碼鼠類的酶的己糖激酶II(mHKII) 的AAV9載體(AAV9-CMV-mHKII)或等劑量的AAV9-CMV-nul 1載體雙側(cè)注射入健康小鼠的 e WAT。注射兩個(gè)星期后,來(lái)自用AA V9 -CMV-mHK II處理的動(dòng)物的分離的脂肪細(xì)胞與來(lái)自用 AAV9-CMV-nul 1注射的小鼠的脂肪細(xì)胞相比表現(xiàn)出mHKII表達(dá)的3倍增加。參見(jiàn)圖1E。為分析 脂肪細(xì)胞中AAV介導(dǎo)的mHKII的過(guò)表達(dá),測(cè)定離體分離的脂肪細(xì)胞攝取的基礎(chǔ)和胰島素刺激 的2-[l」H]脫氧-D-葡萄糖。在AAV9-CMV-mHKII轉(zhuǎn)導(dǎo)的脂肪細(xì)胞中基礎(chǔ)2-[l」H]脫氧-D-葡 萄糖攝取相比AAV9-CMV-nul 1轉(zhuǎn)導(dǎo)的脂肪細(xì)胞略微增加。相反,相比來(lái)自用AAV9-CMV-nul 1 載體處理的動(dòng)物的脂肪細(xì)胞,胰島素刺激導(dǎo)致由AAV9-CMV-mHKII轉(zhuǎn)導(dǎo)的脂肪細(xì)胞攝取的2-[1-?]脫氧-D-葡萄糖的增加較大。參見(jiàn)圖1F。
[0267] 實(shí)施例2
[0268] 白色脂肪細(xì)胞的體內(nèi)AAV介導(dǎo)的特異遺傳工程化
[0269] 評(píng)估僅由脂肪細(xì)胞特異的增強(qiáng)子組成的短版本的鼠類脂肪細(xì)胞蛋白2(mini/aP2) 啟動(dòng)子與aP2基本啟動(dòng)子的結(jié)合使用。參見(jiàn)上文的Ross,1990和Graves,1992。該試驗(yàn)的目的 是將AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)式限定于脂肪細(xì)胞。單側(cè)eWAT內(nèi)部給予10 12vg八鼠的,受mini/aP2 調(diào)控區(qū)控制的,編碼GFP的AAV8和AAV9介導(dǎo)了有限的白色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo),并且注射兩個(gè)星 期后在肝臟和心臟中沒(méi)有可檢測(cè)的GFP表達(dá)。參見(jiàn)圖2A和9。
[0270] 為評(píng)估由小鼠中的mini/aP2調(diào)控區(qū)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的時(shí)間過(guò)程,將4X1012vg/ 鼠劑量的,受mini/aP2調(diào)控區(qū)控制的,編碼源自人類胎盤的分泌的堿性磷酸酶(hSeAP)cDNA 的AAV9載體(AAV9-mini/aP2-SeAP)或鹽溶液雙側(cè)注射入eWAT,并在AAV給予之后不同的時(shí) 間點(diǎn)測(cè)量循環(huán)hSeAP水平。直到AAV遞送兩個(gè)星期之后,檢測(cè)出高水平的hSeAP,并且逐漸增 加多達(dá)40天。此后,循環(huán)hSeAP水平維持注射后至少一年的跟蹤期間。通過(guò)qPCR定量的肝臟 和eWAT中的hSeAP表達(dá)水平確認(rèn)eWAT是負(fù)責(zé)主要生產(chǎn)hSeAP的組織。參見(jiàn)圖2B-2C。
[0271] 為評(píng)估AAV介導(dǎo)的白色脂肪細(xì)胞的特異的遺傳工程化是否可以構(gòu)成研究小鼠體內(nèi) 脂肪細(xì)胞功能、分化和代謝的新工具,將1.4X10 12vg八鼠的,受mini/aP2調(diào)控區(qū)控制的,編碼 mHKII 的 AAV9 載體(AAV9-mini/aP2-mHKII)或等劑量的 AAV9-mini/aP2-null 載體給予 eWAT。 注射兩個(gè)星期后,測(cè)定體內(nèi)基礎(chǔ)2-[l」H]脫氧-D-葡萄糖攝取。相比用AAV9-mini/aP2-null 載體處理的動(dòng)物,接收AAV9-mini/aP2-mHKII載體的動(dòng)物示出了增加的由eWAT攝取的基礎(chǔ) 2-[1-3Η]脫氧-D-葡萄糖。在基礎(chǔ)條件下,在iBAT中和在,例如心臟的組織(其中,mini/aP2 調(diào)控區(qū)的使用阻止轉(zhuǎn)基因表達(dá))中的組之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)2-[1- 3Η]脫氧-D-葡萄糖攝取的差別。 參見(jiàn)圖2D。
[0272] 實(shí)施例3
[0273] 體內(nèi)褐色脂肪細(xì)胞通過(guò)AAV載體的局部遞送的遺傳工程化
[0274] 考慮到AAV8和AAV9是最高效的介導(dǎo)白色脂肪細(xì)胞的遺傳工程載體,評(píng)估通過(guò)相同 的血清型的褐色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。將2X10 9vg八鼠的AAV8和AAV9-CAG-GFP載體給予至肩胛 間褐色脂肪組織(iBAT)兩個(gè)星期后,檢測(cè)到多種GFP+褐色脂肪細(xì)胞。參見(jiàn)圖3A。通過(guò)qPCR的 GFP表達(dá)水平評(píng)估表明在2 X 109vg八鼠的劑量下通過(guò)AAV8的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相比AAV9較高。參見(jiàn)圖 3B。一旦使用AAV8和AAV9載體證明了褐色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo),我們表征使用血清型1、2、4、5、 6、7、8和9的AAV的褐色脂肪組織(BAT)體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。為此,將1.2 X 101Qvg八鼠劑量的血清型 4和8的AAV或10nvg八鼠劑量的血清型1、2、4、5、6、7、8和9的AAV(AAV-CMV-RFP)(受遍在啟動(dòng) 子CMV控制,編碼標(biāo)記蛋白R(shí)FP)注射入小鼠的iBAT。iBAT內(nèi)部給予兩個(gè)星期后,通過(guò)qPCR的 RFP表達(dá)水平的定量顯示出于44¥1、2、4、5和6相比,通過(guò)44¥7^4¥8和44¥9的丨841'的轉(zhuǎn)導(dǎo)效 率較高。參見(jiàn)圖3C。一致的是在接收AAV9載體的動(dòng)物的iBAT中檢測(cè)道廣泛的RFP+褐色脂肪 細(xì)胞分布。參見(jiàn)圖3D。
[0275] 此外,AAV的iBAT內(nèi)部給予導(dǎo)致該庫(kù)的局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),其中,在附睪、腸系膜、腹膜后 和腹股溝庫(kù)中檢測(cè)不到的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。關(guān)于非脂肪組織的轉(zhuǎn)導(dǎo),iBAT內(nèi)部用AAV7、AAV8和 AAV9載體處理的動(dòng)物表現(xiàn)出心臟和肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo),而在胰腺、腸、脾臟、肺臟、腎臟、骨骼肌、睪 丸、副睪和大腦中檢測(cè)不到GFP表達(dá)。參見(jiàn)圖10。
[0276] 實(shí)施例4
[0277] 體內(nèi)AAV介導(dǎo)的褐色脂肪細(xì)胞的特異遺傳工程化
[0278] 利用由給予棕色脂肪細(xì)胞特異表達(dá)的增強(qiáng)子和大鼠 UCP1基因的基本啟動(dòng)子組成 的mini UCPl(mini/UCPl)調(diào)控區(qū)特異地調(diào)節(jié)感興趣的基因在褐色脂肪組織中的表達(dá)。參見(jiàn) Boyer B等,Mol.Cell Biol.l991;ll:4147-4156、Kozak U等,Mol.Cell Biol.l994;14:59-67、上文的 Cassard-Doulcier,1998,和 Larose,1996。iBAT 內(nèi)部給予 2 X 10nvg 八鼠的 AAV8 或 AAV9-mini/UCPl-GFP載體兩個(gè)星期后,得到褐色脂肪細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。參見(jiàn)圖4A。類似地, iBAT內(nèi)部遞送2X10nvg八鼠的AAV8和AAV9-mini/aP2-GFP也轉(zhuǎn)導(dǎo)褐色脂肪細(xì)胞。參見(jiàn)圖11A。 此外,mini/UCPl調(diào)控區(qū)實(shí)現(xiàn)高度脂肪細(xì)胞特異的GFP表達(dá),完全消除了心臟中AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 基因表達(dá),并且僅介導(dǎo)少量的肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)。參見(jiàn)圖11B。
[0279] 為檢驗(yàn)AAV介導(dǎo)的iBAT的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以是研究褐色脂肪細(xì)胞功能的新模型,將7 X l〇1()vg 八鼠的 AAV8-mini/UCPl-mHKII 載體給予 iBAT。與用 AAV8-mini/UCPl-null 載體處理的 動(dòng)物相比,接收AAV8-mini/UCPl-mHKII載體的動(dòng)物表現(xiàn)出增加的通過(guò)iBAT攝取的基礎(chǔ)2-[1-?]脫氧-D-葡萄糖,并且在基礎(chǔ)條件下,在eWAT和心臟的組之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)2-[ 1-3H]脫氧-D-葡萄糖攝取的差別。參見(jiàn)圖4B。然后,將2X10nvg/小鼠的AAV9-mini/UCPl-VEGF 164載體或 AAV9-mini/UCPl-null 載體遞送 iBAT 內(nèi)部。注射兩個(gè)星期后,接收 AAV9-mini/UCPl-VEGF164 載體的動(dòng)物表現(xiàn)出VEGF164的過(guò)表達(dá)和與用AAV9-mini/UCPl-null載體處理的動(dòng)物相比增加 的iBAT中的總VEGF水平。此外,在過(guò)表達(dá)VEGF 164的動(dòng)物中獲得PECAM1 (常用的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記 物)的過(guò)表達(dá)。如通過(guò)針對(duì)iBAT中α-SMA的免疫染色所證明的,用AAV9-mini/UCPl-VEGF 164載 體處理的動(dòng)物相比接收AAV9-min i /UCP1 -nu 11載體的動(dòng)物表現(xiàn)出增加的血管的數(shù)量。參見(jiàn) 圖4C-4F。
[0280] 實(shí)施例5
[0281 ]通過(guò)AAV8和AAV9的全身給予的白色和褐色脂肪細(xì)胞的體內(nèi)遺傳工程化
[0282]將5 X 1012vg八鼠劑量的AAV8或AAV9-CAG-GFP載體通過(guò)尾部靜脈給予至瘦鼠。注射 兩個(gè)星期后評(píng)估脂肪庫(kù)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。針對(duì)eWAT部分的GFP的免疫染色表現(xiàn)出AAV8和AAV9介導(dǎo)的 白色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外,GFP表達(dá)水平和GFP含量的測(cè)量證明AAV8和AAV9的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相 似。此外,全身遞送5X10 12vg八鼠的AAV8或AAV9載體高效地介導(dǎo)iBAT的褐色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn) 導(dǎo)。通過(guò)qPCR的GFP表達(dá)水平的測(cè)量和通過(guò)熒光分析的GFP含量表明AAV8表現(xiàn)出相比AAV9優(yōu) 良的iBAT轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的傾向。此外,通過(guò)qPCR的GFP表達(dá)水平的測(cè)量證明基因轉(zhuǎn)移至腹股溝、 腹膜后和腸系膜的庫(kù)。然而,在庫(kù)之中觀察到顯著的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的差別。參見(jiàn)圖5A-5H。重要 地,AAV8或AAV9載體靜脈給予至糖尿病-肥胖ob/ob小鼠或db/db小鼠也導(dǎo)致WAT和BAT的遺 傳工程化,并且效率與在瘦鼠中得到的相似。參見(jiàn)圖13。AAV8或AAV9-CAG-GFP載體的全身給 予轉(zhuǎn)導(dǎo)多種非脂肪組織。參見(jiàn)圖12。
[0283] 實(shí)施例6
[0284] 利用AAV-mini/aP2和AAV-mini/UCPl載體的白色和褐色脂肪細(xì)胞的體內(nèi)特異遺傳 工程化
[0285] 雖然提供較低水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)式,全身遞送2X1012vg小鼠的AAV8或AAV9-mini/ aP2-GFP導(dǎo)致白色和褐色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。參見(jiàn)圖7A。相反地,全身給予2X10 12vg小鼠的 AAV8或AAV9-mini/UCPl-GFP載體介導(dǎo)顯著的褐色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。參見(jiàn)圖6A。此外,靜脈注 射遞送的AAV-mini/aP2-GFP和AAV-mini/UCPl-GFP載體實(shí)現(xiàn)高度脂肪細(xì)胞特異的GFP表達(dá), 在心臟中沒(méi)有可檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)以及在肝臟中僅表現(xiàn)出少數(shù)分散的GFP+肝細(xì)胞的少量 表達(dá)。參見(jiàn)圖7B-7C。
[0286] 為進(jìn)一步證明通過(guò)AAV全身給予的脂肪細(xì)胞的遺傳工程化,將2X 1012vg的AAV9-mini/UCPl-VEGF164或AAV9-mini/UCPl-null通過(guò)尾部靜脈遞送。注射后兩個(gè)月,接收AAV9-mini/UCPl-VEGF 164載體的動(dòng)物表現(xiàn)出與用AAV9-mini/UCPl-null載體處理的動(dòng)物相比增加 的 VEGFm 的表達(dá)。參見(jiàn)圖 6B-6C。此外,將 8X1012vg 劑量的 AAV9-mini/UCPl-VEGF164 或 AAV9-mini/UCP Ι-null載體也通過(guò)尾部靜脈傳遞。注射后一個(gè)月,接收8 X 1012vg的AAV9-mini/ UCP1-VEGF164載體的動(dòng)物表現(xiàn)出增加的VEGF164和PECAM1的表達(dá)和增加的血管密度。參見(jiàn)圖 6D-6G〇
[0287] 實(shí)施例7
[0288] 使用AAV-mini/aP2_GK的褐色脂肪細(xì)胞的體內(nèi)特異遺傳工程化
[0289] 將2 X 10nvg八鼠劑量的,受mini/aP2調(diào)控區(qū)控制的,編碼小鼠葡糖激酶的AAV9載體 (AAV9-mini/aP2-rGK)或等劑量的AAV9-mini/aP2-null載體局部給予至小鼠的iBAT。注射 兩個(gè)星期后/一個(gè)月,測(cè)定體內(nèi)基礎(chǔ)和胰島素刺激的2-[1- 3Η]脫氧-D-葡萄糖攝取,以評(píng)估 接收AAV9-mini/aP2-rGK載體的動(dòng)物相比于用AAV9-mini/aP2-null載體處理的動(dòng)物是否表 現(xiàn)出增加的特異的通過(guò)iBAT的基礎(chǔ)2-[1- 3Η]脫氧-D-葡萄糖攝取。
[0290] 實(shí)施例8
[0291] AAV載體的全身給予之后來(lái)自具有mirT序列的肝臟和心臟的高效脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和 轉(zhuǎn)基因表達(dá)的去靶
[0292] 全身給予1012vg八鼠劑量的,在表達(dá)框的3'UTR中克隆的,受遍在CAG啟動(dòng)子(AAV9-CAG-GFP)或CAG啟動(dòng)子外加四個(gè)肝臟特異miR122a的串連靶位點(diǎn)(AAV9-CAG-GFP-miRT122)、 心臟特異miRl (AAV9-CAG-GFP-miRTl)或二者(AAV9-CAG-GFP-雙miRT)控制的,編碼GFP標(biāo)記 蛋白的AAV9載體。注射兩個(gè)星期后,在來(lái)自接收AAV9-CAG-GFP、AAV9-CAG-GFP-miRT122、 AAV9-CAG-GFP-mirTl或AAV9-CAG-GFP-雙miRT載體的小鼠的白色和褐色脂肪細(xì)胞中觀察到 較高水平的GFP表達(dá)。相反的,在分別用AAV9-CAG-GFP-mirT122或AAV9-CAG-GFP-mirTl載體 處理的小鼠中,幾乎完全消除了肝臟或心臟中的GFP產(chǎn)生。顯然的是在來(lái)自用AAV9-CAG-GFP-雙miRT處理的小鼠的肝臟和心臟中GFP產(chǎn)生被大幅抑制。參見(jiàn)圖14。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種腺相關(guān)病毒載體,包含重組病毒基因組,其中,所述重組病毒基因組包含表達(dá) 框,所述表達(dá)框包含與感興趣的多核苷酸可操作地連接的脂肪組織特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,AAV的血清型選自由AAV6、AAV7、AAV8 和AAV9組成的組。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述脂肪組織特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包 含選自由aP2基本啟動(dòng)子和UCPl基本啟動(dòng)子組成的組的啟動(dòng)子區(qū)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述脂肪組織特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)進(jìn)一步 包含與所述啟動(dòng)子區(qū)可操作地連接的增強(qiáng)子區(qū)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述增強(qiáng)子區(qū)選自由脂肪特異aP2增 強(qiáng)子和脂肪特異UCPl增強(qiáng)子組成的組。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)選自由以下各項(xiàng)組成 的組: ⑴包含所述脂肪特異aP2增強(qiáng)子和鼠類aP2基本啟動(dòng)子的多核苷酸,以及 (ii)包含所述脂肪特異UCPl增強(qiáng)子和大鼠 UCPl基本啟動(dòng)子的多核苷酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述表達(dá)框進(jìn)一步包含 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)是土撥鼠肝炎病毒 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述感興趣的多核苷酸 編碼選自由以下組成的組中的蛋白質(zhì):作用于全身的分泌蛋白以及作用于所述脂肪細(xì)胞上 或其附近的蛋白質(zhì)。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述感興趣的多核苷酸 編碼選自由己糖激酶、葡糖激酶、堿性磷酸酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子組成的組中的蛋白質(zhì)。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,腺相關(guān)病毒ITR是 AAV2ITR。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒載體,其進(jìn)一步包含至少一種 miRNA靶序列。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述至少一種miRNA靶序列是 mirT122a〇14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的腺相關(guān)病毒載體,其中,所述至少一種miRNA靶序列是 mirTl〇15. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的腺相關(guān)病毒載體,其包含至少一個(gè)mirTl的拷貝和一個(gè) mirT122a的拷貝16. -種藥物組合物,包含根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒載體。17. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒載體或根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥 物組合物在藥物中的用途。18. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒載體或根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥 物組合物在疾病的治療或預(yù)防中的用途,所述疾病需要所述感興趣的多核苷酸在所述脂肪 組織中的表達(dá)。19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的腺相關(guān)病毒載體的用途,其中,所述脂肪組織包含白色脂肪 組織。20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的腺相關(guān)病毒載體的用途,其中,所述脂肪組織包含褐色脂肪 組織。21. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的腺相關(guān)病毒載體的用途,其中,全身或局部給予所述腺相關(guān) 病毒載體或所述藥物組合物。22. -種轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的體外方法,所述方法包括使所述細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一 項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒載體接觸。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的體外方法,其中,所述細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的體外方法,其中,所述脂肪細(xì)胞是白色脂肪細(xì)胞或褐色脂肪 細(xì)胞。25. -種通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)所述的方法已獲得的脂肪細(xì)胞。26. -種多核苷酸,包含由腺相關(guān)病毒ITR側(cè)接的表達(dá)框,其中,所述表達(dá)框包含與感興 趣的多核苷酸可操作地連接的脂肪組織特異調(diào)控區(qū)。27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的多核苷酸,其中,所述脂肪組織特異調(diào)控區(qū)包含選自由aP2 基本啟動(dòng)子和UCPl基本啟動(dòng)子組成的組中的啟動(dòng)子區(qū)。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的多核苷酸,其中,所述脂肪組織特異調(diào)控區(qū)進(jìn)一步包含與所 述啟動(dòng)子區(qū)可操作地連接的增強(qiáng)子區(qū)。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的多核苷酸,其中,所述增強(qiáng)子區(qū)選自由脂肪特異aP2增強(qiáng)子 和脂肪特異UCPl增強(qiáng)子組成的組。30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的多核苷酸,其中,所述調(diào)控區(qū)選自由以下組成的組: ⑴包含所述脂肪特異aP2增強(qiáng)子和鼠類aP2基本啟動(dòng)子的多核苷酸,以及 (ii)包含所述脂肪特異UCPl增強(qiáng)子和大鼠 UCPl基本啟動(dòng)子的多核苷酸。31. 根據(jù)權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)所述的多核苷酸,其中,所述表達(dá)框進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄 后調(diào)控元件。32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多核苷酸,其中,所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控區(qū)是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄 后調(diào)控元件(WPRE)。33. 根據(jù)權(quán)利要求26至32中任一項(xiàng)所述的多核苷酸,其中,所述感興趣的多核苷酸編碼 選自由己糖激酶、葡糖激酶、堿性磷酸酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子組成的組中的蛋白質(zhì)。34. -種載體或質(zhì)粒,包含根據(jù)權(quán)利要求26至33中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。35. -種腺相關(guān)病毒載體,包含病毒基因組,所述病毒基因組包含根據(jù)權(quán)利要求26至33 中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。36. -種用于獲得腺相關(guān)病毒載體的方法,包括以下步驟: (i)提供包含根據(jù)權(quán)利要求26至33中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、AAV cap蛋白、AAV rep蛋 白和病毒蛋白的細(xì)胞,AAV依賴于所述病毒蛋白進(jìn)彳丁復(fù)制; (i i)將所述細(xì)胞保持在適合AAV組裝的條件下,以及 (i i i)純化由所述細(xì)胞生產(chǎn)的腺相關(guān)病毒載體。37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法,其中,AAV依賴于其進(jìn)行復(fù)制的所述蛋白來(lái)源于腺病 毒。38. 根據(jù)權(quán)利要求36或34所述的方法,其中,腺相關(guān)病毒rep或cap蛋白來(lái)源于選自由 AAV6、AAV7、AAV8和AAV9血清型組成的組中的AAV血清型。39. 根據(jù)權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)所述的方法,其中,步驟(iii)進(jìn)一步通過(guò)聚乙二醇 沉淀步驟或氯化銫梯度分級(jí)分離進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C12N15/864GK105916990SQ201380080085
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2013年8月2日
【發(fā)明人】森薩諾 韋羅尼卡·希門尼斯, 圖貝特 法蒂瑪·博希
【申請(qǐng)人】巴塞羅那自治大學(xué)
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