專利名稱：改進的甲病毒復(fù)制子和輔助構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備重組甲病毒顆粒的改進構(gòu)建體和制備重組甲病毒顆粒的方法。
背景技術(shù)：
在真核生物中，細(xì)胞中已經(jīng)進化了兩種不同的機制以啟動翻譯。在其中一個機制中，存在于mRNA的5’端(“帽”)的甲基-7-鳥苷(5′)pppN結(jié)構(gòu)被起始因子eIF4A所識別，它包括eIF4E、eIF4G和eIF4A。這種“起始前復(fù)合物”的形成需要，但不限于，對結(jié)合起始子tRNA-Meti負(fù)責(zé)的起始因子eIF2和與40S核糖體亞基相互作用的eIF3的協(xié)同作用(Hershey & Merrick.Translational Control of GeneExpression，pp.33-88，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY 2000)。
在另一種機制中，翻譯起始發(fā)生于轉(zhuǎn)錄物內(nèi)部并由一種內(nèi)部核糖體進入序列(IRES)元件介導(dǎo)，所述元件在反式作用因子的輔助下將翻譯機制募集至mRNA中的一種內(nèi)部起始密碼子(Jackson.Translational Control of Gene Expression，pp.127-184，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY 2000)。已經(jīng)在多種來自感染脊椎動物、無脊椎動物或植物細(xì)胞的病毒的轉(zhuǎn)錄物中，以及在來自脊椎和無脊椎基因的轉(zhuǎn)錄物中發(fā)現(xiàn)了IRES元件。
在許多病毒感染的過程中，以及在其它細(xì)胞應(yīng)激條件中，降低三重復(fù)合物eIF2-GTP-tRNA-Meti的水平的eIF2的磷酸化狀態(tài)的變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的總體抑制。相反地，帽依賴性起始的特異性關(guān)閉依賴于eIF4F功能的修飾(Thompson & Sarnow.Current Opinion inMicrobiology 3366-370(2000))。
IRES元件避開帽依賴性翻譯抑制；因而由IRES元件所指導(dǎo)的翻譯稱為“不依賴于帽的”。IRES驅(qū)動的翻譯起始在許多病毒感染，如，例如細(xì)小核糖核酸病毒感染的過程中普遍存在(Macejak & Sarnow.Nature 35390-94(1991))。在這些環(huán)境下，帽依賴性起始受到抑制或由于存在小量功能性eIF4G而受到嚴(yán)重?fù)p害。這是由eIF4G的切割或溶解性的減少(Gradi等.Proceedings of the Natiomal Academyof Sciences，USA 9511089-11094(1998))；4E-BP去磷酸化(Gingras等.Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 935578-5583(1996))或聚(A)-結(jié)合蛋白(PABP)的切割(Joachims等.Journal of Virology 73718-727(1999))所導(dǎo)致的。
已經(jīng)介紹過以不同水平表達(dá)目的核酸(NOI)的甲病毒載體。所有這些例子都描述甲病毒非結(jié)構(gòu)基因或26S(亞基因組)啟動子的修飾以調(diào)控載體復(fù)制或從亞基因組啟動子開始的轉(zhuǎn)錄。例子包括非結(jié)構(gòu)基因的突變，其提高或降低亞基因組RNA轉(zhuǎn)錄或改變基因組RNA復(fù)制，導(dǎo)致修飾的NOI表達(dá)。以往未曾描述在亞基因組mRNA的翻譯水平上來自甲病毒載體的蛋白質(zhì)表達(dá)的控制。
本發(fā)明提供甲病毒復(fù)制子和輔助載體，它們經(jīng)過工程化以便在IRES元件的指導(dǎo)下通過不依賴于帽的機制在蛋白質(zhì)翻譯的水平上控制一種或多種異源核酸序列表達(dá)。
發(fā)明概述在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種重組復(fù)制子核酸，包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列，至少一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列，至少一個甲病毒亞基因組啟動子，至少一個IRES元件，至少一個異源核酸，和編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸，以及允許復(fù)制子包裝入顆粒中的甲病毒包裝信號。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種重組輔助核酸，包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列，甲病毒亞基因組啟動子，IRES元件，編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，以及編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸。
本文還提供一種甲病毒顆粒，它包含含有本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸的甲病毒復(fù)制子RNA。在另一個實施方案中，本文提供傳染性的、有缺陷的甲病毒顆粒群體，其中每個顆粒都包含含有本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸的甲病毒復(fù)制子RNA。在某些實施方案中，本發(fā)明提供傳染性的、有缺陷的甲病毒顆粒群體，其中每個顆粒都包含含有本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸的甲病毒復(fù)制子RNA，并且如由細(xì)胞培養(yǎng)物傳代所測量的，該群體沒有可檢測到的可復(fù)制的病毒。在特定的實施方案中，本發(fā)明的顆粒能夠包含一種或多個減毒突變。
此外，還包括藥物組合物，其在可藥用的載體中包含本發(fā)明的顆粒和群體。
在其它的實施方案中，本發(fā)明提供一種制備傳染性的、有缺陷的甲病毒顆粒的方法，包括(a)將(i)本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸；和(ii)一種或多種編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的輔助核酸導(dǎo)入細(xì)胞群中；其中所有的甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白都提供在細(xì)胞中；和(b)在細(xì)胞群中生產(chǎn)所述甲病毒顆粒。本發(fā)明的方法能夠進一步包括從細(xì)胞中收集所述甲病毒顆粒的步驟。
在某些實施方案中，本發(fā)明的輔助核酸也可以是一種本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸。例如，本發(fā)明的重組核酸能夠包含編碼一種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列作為一種異源核酸，和/或除了一種異源核酸之外，包含編碼一種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列。在這些實施方案中，重組復(fù)制子核酸被認(rèn)為是一種重組復(fù)制子輔助核酸，它能夠存在于具有其它輔助核酸和/或本發(fā)明的其它重組核酸的細(xì)胞中。
因而，在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸進一步編碼一種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白?？梢詫⑦@種重組復(fù)制子核酸與一種或多種輔助核酸一起導(dǎo)入細(xì)胞群體中，以使重組復(fù)制子核酸和輔助核酸產(chǎn)生所有的甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并將重組復(fù)制子核酸包裝入所述細(xì)胞中的顆粒內(nèi)。
此外還提供引發(fā)受試者中免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用免疫原量的核酸、載體、顆粒群體和/或本發(fā)明的組合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種重組核酸，其包含一種指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的啟動子；一種IRES元件；和一種包含編碼序列的核酸，其中IRES元件被可操作地定位，從而使編碼序列的翻譯是通過由IRES元件指導(dǎo)的不依賴于帽的機制并且不通過帽依賴性機制。
附圖簡述

圖1顯示間隔區(qū)-IRES復(fù)制子亞基因組RNAs的RNA印跡。
發(fā)明詳述如本文所用的，根據(jù)其所用的上下文，″一個″、″一種″和″該″可以意指一個或多個。作為示例，″一個細(xì)胞″可以意為一個細(xì)胞或多個細(xì)胞；而“一個異源核酸”可以意為一個異源核酸或多個異源核酸。
本發(fā)明是基于令人驚奇的和意想不到的發(fā)現(xiàn)，即，核酸的轉(zhuǎn)錄和核酸的翻譯可以分開。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種重組核酸，其包含一種指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的啟動子；一種IRES元件；和一種編碼序列，其中IRES元件被可操作地定位，從而使編碼序列的翻譯通過由IRES元件指導(dǎo)的不依賴于帽的機制并且不通過帽依賴性機制。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“轉(zhuǎn)錄”包括由本身可以是一種RNA分子的重組復(fù)制子核酸的甲病毒亞基因組啟動子生產(chǎn)RNA。即，本發(fā)明的重組復(fù)制子RNA分子上的亞基因組啟動子可以指導(dǎo)編碼異源NOI的信使RNA的轉(zhuǎn)錄。單獨地，可以“復(fù)制”重組復(fù)制子核酸，即，由5’復(fù)制識別序列到3’復(fù)制識別序列進行拷貝。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供一種重組復(fù)制子核酸，其包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列，至少一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列，至少一個甲病毒亞基因組啟動子，至少一個IRES元件，至少一個異源核酸，和編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸。在某些實施方案中，重組復(fù)制子核酸進一步包含一種甲病毒包裝信號，從而可以將所述復(fù)制子包裝入顆粒中。在其它實施方案中，所述重組復(fù)制子核酸可以包含一種間隔區(qū)核酸序列，其可以定位于IRES元件的上游。
應(yīng)當(dāng)理解在各種實施方案中，本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸的元件可以列于本文中的順序存在和/或以任何順序存在。因而例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種以下列順序包含以下結(jié)構(gòu)的重組復(fù)制子核酸編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列，至少一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列，至少一個甲病毒亞基因組啟動子，至少一個IRES元件，至少一個異源核酸，和編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸。
如本文所用的，“5’甲病毒復(fù)制識別序列”和“3’甲病毒復(fù)制識別序列”是5’和3’序列(5’和3’標(biāo)號指它們在甲病毒核酸中的定位)，它們控制甲病毒基因組的復(fù)制。在某些實施方案中，5’和3’甲病毒復(fù)制識別序列二者之一或二者都能夠在任一末端截短，條件是它們的甲病毒基因組復(fù)制功能保持完好。
還如本文所用的，“至少一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列”包括一種核酸序列，其編碼至少一種，可能是多種，甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白。例如，本發(fā)明的第二核酸序列可以是一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1，nsp2，nsp3和nsp4的連續(xù)核苷酸序列，一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1，nsp2和nsp3的連續(xù)核苷酸序列，一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2，nsp3和nsp4的連續(xù)核苷酸序列，一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1和nsp2的連續(xù)核苷酸序列，一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp3和nsp4的連續(xù)核苷酸序列，一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2和nsp3的連續(xù)核苷酸序列，一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1的核酸，一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的核酸，一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp3的核酸，一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp4的核酸，和/或其任何組合和/或順序，從而使重組復(fù)制子核酸包含編碼全部nsp1，nsp2，nsp3和nsp4的核苷酸序列。
在特定的實施方案中，本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸可以包含編碼一種或多種任意組合或相互任意定位的甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，從而使重組復(fù)制子核酸包含編碼全部nsp1，nsp2，nsp3和nsp4的核苷酸序列。例如，本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸能夠以下列順序包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列，編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1，nsp2和nsp3的第二核酸序列，至少一個甲病毒亞基因組啟動子，至少一個IRES元件，至少一個異源核酸，另一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp4的第二核酸序列，和編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸。
還如本文所用的，″甲病毒亞基因組啟動子″，″亞基因組啟動子，″或″26S啟動子″是存在于甲病毒基因組中的啟動子，它在正常的甲病毒復(fù)制過程中指導(dǎo)亞基因組信息的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，甲病毒亞基因組啟動子能夠被截短(例如，產(chǎn)生最小的甲病毒基因組啟動子)和/或修飾，從而減弱、保持或提高它的活性。
本發(fā)明的重組核酸能夠包含一種內(nèi)部核糖體進入序列(IRES)元件，如本文所述的和如本領(lǐng)域公知的，它通過不依賴于帽的機制指導(dǎo)核酸翻譯成蛋白質(zhì)。特別是在本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸中，通過在甲病毒26S亞基因組啟動子下游和待翻譯的編碼序列上游導(dǎo)入內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)來實現(xiàn)在翻譯水平對核酸表達(dá)的控制。將IRES元件進行定位，從而使它指導(dǎo)mRNA的翻譯，由此最小化、限制或防止mRNA來自存在于亞基因組mRNA(“帽”)5’端的甲基-7-鳥苷(5’)pppN結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯的起始。這種“IRES指導(dǎo)的”不依賴于帽的翻譯并不需要或?qū)е履軌蚋淖儚?fù)制和轉(zhuǎn)錄的甲病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白基因的任何顯著改進。
甲病毒載體比早期的載體設(shè)計具有幾個優(yōu)點，所述甲病毒載體被設(shè)計來控制異源核酸表達(dá)水平而不調(diào)節(jié)(例如，干擾、打亂、擾亂、破壞、提高、促進、減弱、最小化)基因組復(fù)制或亞基因組轉(zhuǎn)錄。第一，調(diào)節(jié)基因組復(fù)制能夠通過限制可包裝入顆粒中的基因組RNAs數(shù)目來負(fù)面影響VRP的產(chǎn)生。第二，通過改變(例如，通過截短、缺失、添加和/或取代)26S啟動子調(diào)節(jié)亞基因組轉(zhuǎn)錄能夠改變基因組RNA復(fù)制，再導(dǎo)致限制可包裝入顆粒中的基因組RNAs數(shù)目。第三，甲病毒復(fù)制誘導(dǎo)細(xì)胞中的應(yīng)激反應(yīng)，其能夠?qū)е耺RNAs的帽依賴性翻譯減少。從甲病毒亞基因組mRNA的帽依賴性翻譯轉(zhuǎn)變到由IRES元件提供的不依賴于帽的機制使得這種對于NOI表達(dá)的負(fù)面效應(yīng)最小化。
本發(fā)明的IRES元件可以包括，但不限于，來自細(xì)小核糖核酸病毒，例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)或人腸道病毒71，例如病毒株7423/MS/87及其BrCr；來自腦心肌炎病毒(EMCV)；來自口蹄疫病毒(FMDV)；來自黃病毒，例如，丙型肝炎病毒(HCV)；來自瘟病毒，例如，經(jīng)典豬熱病毒(CSFV)；來自逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，鼠白血病病毒(MLV)；來自慢病毒，例如，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)；來自細(xì)胞mRNAIRES元件，如來自翻譯起始因子，例如，eIF4G或DAP5的元件；來自轉(zhuǎn)錄因子，例如，c-Myc(Yang and Sarnow，Nucleic AcidsResearch 252800-2807(1997))或NF-κB-阻抑因子(NRF)；來自生長因子，例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)和血小板衍生的生長因子B(PDGF B)；來自同源異型基因，例如，Antennapedia；來自存活蛋白，例如，X-連鎖的凋亡抑制劑(XIAP)或Apaf-1；來自伴侶蛋白，例如，免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白BiP(Martinez-Salas等，Journal of General Virology 82973-984，(2001))，來自植物病毒的IRES元件，以及任何現(xiàn)在已知的或以后鑒定的其它IRES元件。
在某些實施方案中，本發(fā)明的IRES元件可以源自，例如，腦心肌炎病毒(EMCV，GenBank登錄號#NC001479)，蟋蟀麻痹病毒(GenBank登錄號#AF218039)，果蠅屬C病毒(GenBank登錄號#AF014388)，Plautia stali腸病毒(GenBank登錄號#AB006531)，Rhopalosiphumpadi病毒(GenBank登錄號#AF022937)，Himetobi P病毒(GenBank登錄號#AB017037)，急性蜜蜂麻痹病毒(GenBank登錄號#AF150629)，Black queen細(xì)胞病毒(GenBank登錄號#AF183905)，錐獵蝽屬病毒(GenBank登錄號#AF178440)，Acyrthosiphon pisum病毒(GenBank登錄號#AF024514)，感染性flacherie病毒(GenBank登錄號#AB000906)，和/或Sacbrood病毒(GenBank登錄號#AF092924)。此外，本發(fā)明提供一種合成的IRES元件，它可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進行設(shè)計以模仿天然存在的IRES元件的功能(見Chappell等.Proc Natl Acad Sci USA.(2000)97(4)1536-41。
在特定的實施方案中，所述IRES元件可以是昆蟲IRES元件或其它非哺乳類IRES元件，它在選來包裝本發(fā)明的重組甲病毒顆粒的特定輔助細(xì)胞系中具有功能，但在靶宿主細(xì)胞中將不具功能，或具最小功能。昆蟲病毒IRES元件已經(jīng)進化為在昆蟲細(xì)胞內(nèi)最佳地發(fā)揮作用并且類似地哺乳動物病毒IRES元件在哺乳動物細(xì)胞中最佳地發(fā)揮作用。因而，可以通過將昆蟲病毒特異性IRES元件插入復(fù)制子RNAs中而將翻譯的控制導(dǎo)入復(fù)制子載體系統(tǒng)中。以此方式，來自復(fù)制子載體的異源NOIs的翻譯能夠在哺乳動物細(xì)胞中進行調(diào)控(減弱)并在昆蟲細(xì)胞中增強。這對于那些對包裝細(xì)胞有毒的或?qū)撞《景b過程有害的那些NOIs是有用的。另一種實現(xiàn)這種效果的途徑是使用包裝在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的復(fù)制子載體內(nèi)的IRES元件，由此還避免了包裝過程中異源NOI的可能性的顯著翻譯。不受特定假說或理論所限，細(xì)胞因子和培養(yǎng)環(huán)境可能在IRES活性和功能中發(fā)揮作用。所以，預(yù)期在同一細(xì)胞內(nèi)的額外控制水平/不同IRES種類的調(diào)控可以通過某些細(xì)胞因子的提供/去除或通過培養(yǎng)環(huán)境(例如，溫度)的變化來實現(xiàn)，從而與第二種IRES相比，優(yōu)先地指導(dǎo)一種IRES的翻譯。
在某些實施方案中，可以改變輔助或包裝細(xì)胞系的細(xì)胞環(huán)境，從而增強或減弱IRES的比活性。一般，IRES元件已經(jīng)進化為在細(xì)胞應(yīng)激的條件下行使功能，在所述細(xì)胞應(yīng)激條件下提高水平的eIF-α激酶導(dǎo)致減弱的帽依賴性翻譯和IRES依賴性翻譯/活性的互利提高。通過多種方法，包括但不限于低氧、低溫、營養(yǎng)/氨基酸饑餓、ER應(yīng)激誘導(dǎo)(例如使用Thapsigargin)、干擾素或PKR元件(例如，使用聚IC)誘導(dǎo)、封閉tRNA依賴性合成(例如，使用Edeine)，或本領(lǐng)域公知的其它通用的細(xì)胞應(yīng)激物，包括但不限于，過氧化氫和山梨糖醇，可以在細(xì)胞包裝系統(tǒng)中進行人工誘導(dǎo)這些條件從而增強來自選擇的IRES元件的表達(dá)。
在其它的實施方案中，IRES元件指導(dǎo)的NOI翻譯能夠，例如，通過使用對IRES元件/間隔區(qū)特異性的反義siRNAs或NOI來進行調(diào)節(jié)，所述NOI能夠通過多種本領(lǐng)域已知的和本文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)染入，或轉(zhuǎn)導(dǎo)/瞬間表達(dá)于包裝細(xì)胞中。
作為另一種選擇，NOI的表達(dá)還能夠通過使用配體結(jié)合對，例如，核酸元件和結(jié)合于其上的分子(即配體)進行調(diào)節(jié)(見，例如，美國專利號6,242,259)。所以，本發(fā)明還提供一種重組復(fù)制子核酸，其包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的核酸序列，一個或多個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列，至少一個甲病毒亞基因組啟動子，至少一個IRES元件，一個非甲病毒核苷酸序列，所述非甲病毒核苷酸序列當(dāng)被配體結(jié)合時改變亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄和/或由IRES的翻譯，至少一個異源核酸，和編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的核酸。
作為一個具體的實施方案，所述配體可以是RNA結(jié)合蛋白(例如，R17外殼蛋白)，反義序列，染料(例如，Hoechst染料H33258或H3342)，和/或抗生素(例如妥布拉霉素或卡那霉素)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將這些導(dǎo)入包裝細(xì)胞或在包裝細(xì)胞中生產(chǎn)(見美國專利號6,242,259)。
如在本發(fā)明的上下文中所用的，亞基因組RNA轉(zhuǎn)錄的減少，或由IRES指導(dǎo)的NOI的翻譯的減少應(yīng)當(dāng)被理解為分別指在選定配體存在時轉(zhuǎn)錄或翻譯的統(tǒng)計學(xué)顯著的減少，所述減少是由于結(jié)合非甲病毒核苷酸序列的配體的作用，所述核苷酸序列定位于緊鄰甲病毒亞基因組啟動子或IRES。在某些實施方案中，與不存在結(jié)合配體時的水平相比，細(xì)胞中亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄或IRES指導(dǎo)的NOI翻譯的水平減弱至少25％，50％，75％，或90％，或3倍，5倍，或10倍。本領(lǐng)域已知的許多測試法都能夠用于評定轉(zhuǎn)錄或翻譯減弱的水平，包括，例如，報道基因的酶學(xué)測試、RNA印跡、代謝RNA標(biāo)記等。
本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸可以包含一種或多種IRES元件，并且在那些包含兩種或多種IRES元件的實施方案中，IRES元件可以是相同的或者它們可以是不同的，以任何順序排列和/或組合。在特定的實施方案中，所述重組復(fù)制子核酸可以包含兩個或多個“啟動子-IRES-異源NOI盒”，其中每個盒中的啟動子、IRES和異源NOI盒既可以是不同的也可以是相同的?；蛘?，所述重組復(fù)制子核酸可以編碼兩個或多個NOI，其中之一受“啟動子-IRES盒”控制，而另一個NOI(s)可以受亞基因組啟動子單獨或受IRES單獨控制。
本發(fā)明的異源核酸是這樣一種核酸，它不存在于野生型甲病毒的基因組中和/或不以與它存在于本發(fā)明重組復(fù)制子核酸中相同的順序存在于野生型甲病毒的基因組中。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明的異源核酸能夠編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白(例如，C，PE2/E2，E1，E3，6K)和/或除了異源核酸之外的一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白。當(dāng)本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸包含編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸時，所述重組復(fù)制子核酸能夠作為在如本文所述傳染性的、有缺陷的甲病毒顆粒的組裝中的重組復(fù)制子輔助核酸而起作用。
本發(fā)明的異源核酸能夠編碼一種蛋白質(zhì)或肽，其可以是，但不限于，抗原、免疫原或免疫原性多肽或肽、融合蛋白、融合肽、癌癥抗原等。由本發(fā)明的異源核酸編碼的蛋白質(zhì)和/或肽包括，但不限于，適于保護受試者免受疾病的免疫原性多肽和肽，所述疾病包括但不限于微生物性、細(xì)菌性、原生動物性、寄生蟲性和病毒性疾病。
在某些實施方案中，例如，由異源核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽可以是一種正粘病毒免疫原(例如，一種流感病毒蛋白質(zhì)或肽，如流感病毒血凝素(HA)表面蛋白質(zhì)或流感病毒核蛋白，或馬流感病毒蛋白質(zhì)或肽)，或副流感病毒免疫原，或后肺病毒(metapneumovirus)免疫原，或呼吸道合胞病毒免疫原，或鼻病毒免疫原，慢病毒免疫原(例如，馬傳染性貧血病毒蛋白質(zhì)或肽，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)蛋白質(zhì)或肽，或人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白質(zhì)或肽，如HIV或SIV包膜GP160蛋白，HIV或SIV基質(zhì)/殼體蛋白質(zhì)，和HIV或SIV gag，pol和env基因產(chǎn)物)。所述蛋白質(zhì)或肽還可以是一種沙粒病毒免疫原(例如，拉薩熱病毒蛋白質(zhì)或肽，如拉薩熱病毒核衣殼蛋白和拉薩熱病毒包膜糖蛋白)，細(xì)小核糖核酸病毒免疫原(例如，口蹄疫病毒蛋白質(zhì)或肽)，痘病毒免疫原(例如，牛痘蛋白質(zhì)或肽，如牛痘L1或L8蛋白質(zhì))，環(huán)狀病毒免疫原(例如，非洲馬疫病毒蛋白質(zhì)或肽)，黃病毒免疫原(例如，黃熱病毒蛋白質(zhì)或肽，西尼羅河病毒蛋白質(zhì)或肽，或日本腦炎病毒蛋白質(zhì)或肽)，絲狀病毒免疫原(例如，埃波拉病毒蛋白質(zhì)或肽，或馬堡病毒蛋白質(zhì)或肽，如NP和GP蛋白質(zhì))，布尼亞病毒免疫原(例如，RVFV，CCHF和SFS蛋白質(zhì)或肽)，或冠狀病毒免疫原(例如，傳染性人冠狀病毒蛋白質(zhì)或肽，如人冠狀病毒包膜糖蛋白，或豬可傳播的胃腸炎病毒蛋白質(zhì)或肽，或鳥類傳染性支氣管炎病毒蛋白質(zhì)或肽)。由本發(fā)明的異源核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽還可以是一種脊髓灰質(zhì)炎抗原，皰疹抗原(例如，CMV，EBV，HSV抗原)，腮腺炎抗原，麻疹抗原，風(fēng)疹抗原，水痘抗原，肉毒毒素，白喉毒素或其它白喉抗原，百日咳抗原，肝炎(例如，甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝)抗原，或任何本領(lǐng)域已知的其它疫苗抗原。
如本文所用的，“引發(fā)免疫應(yīng)答”和“免疫受試者”包括在受試者中產(chǎn)生對本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或多肽(例如，免疫原、免疫原性肽，和/或一種或多種抗原)的激素/細(xì)胞免疫應(yīng)答。如本領(lǐng)域公知的術(shù)語“體液”免疫應(yīng)答指包含抗體的免疫應(yīng)答，而如本領(lǐng)域公知的術(shù)語“細(xì)胞”免疫應(yīng)答指包含T淋巴細(xì)胞和其它白細(xì)胞的免疫應(yīng)答，特別是由HLA限制的溶細(xì)胞性T細(xì)胞，即，″CTLs″進行的免疫原特異性應(yīng)答。當(dāng)處理的免疫原，即，肽片段結(jié)合主要組織相容性復(fù)合物(MHC)HLA蛋白一起展示時，發(fā)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，所述HLA蛋白為兩種一般類型，I類和II類。I類HLA限制的CTLs通常結(jié)合9聚體肽并在細(xì)胞表面呈遞那些肽。在HLAI類分子內(nèi)容中的這些肽片段被T淋巴細(xì)胞上的特異性T細(xì)胞受體(TCR)所識別，導(dǎo)致T細(xì)胞的激活。所述激活能夠?qū)е露喾N功能性結(jié)果，包括但不限于直接通過細(xì)胞毒性或凋亡事件導(dǎo)致攜帶HLA肽復(fù)合物的細(xì)胞的破壞的特異性T細(xì)胞亞組的增殖或非破壞性機制的激活，例如，干擾素/細(xì)胞因子的生產(chǎn)。通過I類MHC蛋白呈遞免疫原，一般刺激CD8+CTL反應(yīng)。
細(xì)胞免疫應(yīng)答的另一方面包括II類HLA限制的T細(xì)胞應(yīng)答，其包括輔助T細(xì)胞的激活，所述T細(xì)胞刺激并集中非特異性效應(yīng)器細(xì)胞的活性，所述效應(yīng)器細(xì)胞針對在其表面結(jié)合展示結(jié)合MHC分子的肽片段的細(xì)胞。識別至少兩種類型的輔助細(xì)胞分泌細(xì)胞因子白介素2(IL-2)和γ干擾素的T輔助1細(xì)胞(Th1)，和分泌細(xì)胞因子白介素4(IL-4)，白介素5(IL-5)，白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)的T輔助2細(xì)胞(Th2)。通過II類MHC蛋白呈遞免疫原一般引發(fā)CD4+CTL應(yīng)答以及B淋巴細(xì)胞的刺激，其導(dǎo)致抗體應(yīng)答。
如本文所用的，“免疫原性多肽”、“免疫原性肽”或“免疫原”包括任何引發(fā)受試者中免疫應(yīng)答的肽、蛋白質(zhì)或多肽，并且在某些實施方案中，免疫原性多肽適于對受試者提供某種程度的保護以對抗疾病。這些術(shù)語可以與術(shù)語“抗原”交互使用。
在某些實施方案中，本發(fā)明的免疫原可以包含一種或多種“表位”，基本上由一種或多種“表位”組成，或由一種或多種“表位”組成。“表位”是一組氨基酸殘基，其參與由一種特定免疫球蛋白的識別。在T細(xì)胞的概念中，表位被定義為對于T細(xì)胞受體蛋白和/或MHC受體識別所必需的氨基酸殘基組。在體內(nèi)或體外的免疫系統(tǒng)環(huán)境中，表位指分子的集合特征，如一級、二級和/或三級肽結(jié)構(gòu)，和/或電荷，其一起形成一個被免疫球蛋白、T細(xì)胞受體和/或HLA分子識別的位點。對于B細(xì)胞(抗體)表位來說，它一般是最小3-4個氨基酸，優(yōu)選至少5個，最大為大約50個氨基酸。優(yōu)選地，體液應(yīng)答誘導(dǎo)性表位為5至30個氨基酸，通常為12至25個氨基酸，最常見為15至20個氨基酸。對于T細(xì)胞表位來說，表位包括至少大約7-9個氨基酸，而對于輔助T細(xì)胞表位來說，至少大約12-20個氨基酸。一般，這種T細(xì)胞表位將包括大約7至15個氨基酸，例如，7，8，9，10，11，12，13，14或15個氨基酸。
本發(fā)明可以用于在受試者中表達(dá)一種編碼免疫原性多肽的核酸(例如，進行疫苗接種)或進行免疫治療(例如，治療癌癥或腫瘤受試者)。因而，對于疫苗而言，本發(fā)明由此提供在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的核酸、顆粒、群體和/或組合物。
還考慮本發(fā)明的核酸、顆粒、群體和藥物組合物能夠用于向細(xì)胞遞送目的NOI的方法中，所述細(xì)胞可以是受試者中的細(xì)胞。因而，本發(fā)明提供一種向細(xì)胞遞送異源核酸的方法，包括向細(xì)胞中導(dǎo)入有效量的本發(fā)明的核酸、顆粒、群體和/或組合物。還提供一種向受試者中的細(xì)胞遞送異源核酸的方法，包括向受試者遞送有效量的本發(fā)明的核酸、顆粒、群體和/或組合物。根據(jù)公知的基因治療方案，這些方法可以用于對本發(fā)明的細(xì)胞和/或受試者給予治療效應(yīng)。
本發(fā)明的“受試者”包括，但不限于，溫血動物，例如，人、非人靈長類、馬、牛、貓、狗、豬、大鼠和小鼠?？梢酝ㄟ^幾種不同途徑的任一個實現(xiàn)本發(fā)明各種組合物(例如，核酸、顆粒、群體、藥物組合物)的給藥。在特定的實施方案中，所述組合物能夠進行肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、顱內(nèi)、舌下、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服或局部給藥。本文的組合物可以通過劃痕法或通過藥膏或液體經(jīng)皮進行給藥。所述組合物能夠以可生物降解材料的形式進行皮下遞送，所述材料隨著時間而釋放所述組合物。
可以預(yù)防性地使用本發(fā)明的組合物以預(yù)防疾病或治療性地使用以治療疾病。可以治療的疾病包括由病毒、細(xì)胞、真菌或寄生蟲引起的傳染性疾病，和癌癥。還可以治療涉及表達(dá)異?；蚍闯５鞍谆蜻^表達(dá)正常蛋白的慢性疾病，例如，阿爾茨海默病，多發(fā)性硬化癥，中風(fēng)等。
本發(fā)明的組合物可以進行優(yōu)化或組合其它疫苗接種方案以提供最廣泛的(即，免疫應(yīng)答的所有方面，包括本文上述的那些特征)可能的細(xì)胞和體液應(yīng)答。在某些實施方案中，這可以包括使用異源激發(fā)-加強策略，其中將本發(fā)明的組合物用于組合一種包含下列一種或多種的組合物源自病原體或腫瘤的免疫原、重組免疫原、裸核酸、用含脂部分制成的核酸、非甲病毒載體(包括但不限于痘病毒載體、腺病毒載體、皰疹病毒載體、水泡性口炎病毒載體、副黏液病毒載體、細(xì)小病毒載體、乳頭多瘤空泡病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)和其它甲病毒載體。所述病毒載體可以是病毒樣的顆粒或核酸。所述甲病毒載體可以是包含復(fù)制子的顆粒、基于DNA的包含復(fù)制子的載體(有時稱為“ELVIS”系統(tǒng)，見，例如，美國專利號5,814,482)或裸RNA載體。
本發(fā)明的組合物還可以用來產(chǎn)生抗慢性或潛伏傳染劑的免疫應(yīng)答，所述潛伏傳染劑一般由于不能在受試者中引發(fā)強烈免疫應(yīng)答而存留持久。例證性的潛伏或慢性傳染劑包括，但不限于，乙肝、丙肝、EB病毒、皰疹病毒、人免疫缺陷病毒和人乳頭瘤病毒?？梢愿鶕?jù)本文所述的方法將編碼來自這些傳染劑的肽和/或蛋白質(zhì)的甲病毒載體向細(xì)胞或受試者施用。
或者，所述免疫原性蛋白質(zhì)或肽可以是任何腫瘤或癌細(xì)胞抗原。優(yōu)選地，所述腫瘤或癌抗原在所述癌細(xì)胞表面表達(dá)。特定乳腺癌的示例性癌癥抗原為HER2和BRCA1抗原。其它例證性癌癥和腫瘤細(xì)胞抗原在S.A.Rosenberg，(1999)Immunity 10281)中進行了描述，并且包括，但不限于，MART-1/MelanA，gpl00，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，GAGE-1/2，BAGE，RAGE，NY-ESO-1，CDK-4，β-連環(huán)蛋白，MUM-1，Caspase-8，KIAA0205，HPVE &，SART-1，PRAME，p15和p53抗原，Wilms′腫瘤抗原，酪氨酸酶，癌胚抗原(CEA)，前列腺特異抗原(PSA)，前列腺特異性膜抗原(PSMA)，前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)，人天冬氨酰(天冬酰)β-羥化酶(HAAH)，和EphA2(一種上皮細(xì)胞酪氨酸激酶，見國際專利公開號WO01/12172)。
本發(fā)明的免疫原性多肽或肽還可以是如國際專利公開WO99/51263中所述的“普遍”或“人工”癌癥或腫瘤細(xì)胞抗原，將WO99/51263全部內(nèi)容并入本文作為參考以作這類抗原的教導(dǎo)。
在多種實施方案中，本發(fā)明的異源核酸可以編碼反義核酸序列。“反義”核酸是與特定核酸(例如，基因，cDNA和/或mRNA)的全部或一部分互補(即，能夠在體內(nèi)或在嚴(yán)格體外條件下雜交)的核酸分子(即，DNA或RNA)，所述特定核酸編碼或參與核酸的表達(dá)，后者編碼一種被反義核酸的作用靶向以抑制或減弱生產(chǎn)的多肽。如果需要，可以利用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)包含所需修飾的反義核酸。例如，可以利用硫代磷酸酯寡核苷酸作為反義核酸以抑制反義寡核苷酸在體內(nèi)被核酸酶降解。當(dāng)所述反義核酸與編碼被靶向的多肽的核酸的一部分互補時，所述反義核酸會足夠緊密地雜交到編碼所述多肽的核酸的5’端，以便它抑制功能多肽的翻譯。一般，這意味著所述反義核酸應(yīng)當(dāng)互補于與其雜交的核酸的5’一半或三分之一內(nèi)的序列。
本發(fā)明的反義核酸還能夠編碼催化性RNA(即，核酶)，它通過水解編碼被靶向的基因產(chǎn)物的mRNA而抑制靶核酸的表達(dá)。此外，可以將錘頭狀RNA用作反義核酸以防止內(nèi)含子剪接?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域反義技術(shù)的方案程序生產(chǎn)并檢驗本發(fā)明的反義核酸。
本文所用的術(shù)語“甲病毒”具有其在本領(lǐng)域的傳統(tǒng)意義，并包括東方馬腦炎病毒(EEE)，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)，沼澤病毒，穆茨布病毒，Pixuna病毒，西方腦炎病毒(WEE)，辛德畢斯病毒，南非蟲媒病毒No.86(S.A.AR86)，Girdwood S.A.病毒，Ockelbo病毒，塞姆利基森林病毒，Middleburg病毒，基孔貢亞病毒，奧絨絨病毒，羅斯河病毒，Barmah森林病毒，蓋塔病毒，鷺山病毒，畢巴汝病毒，馬亞羅病毒，烏納病毒.奧拉病毒，Whataroa病毒，Babanki病毒，Kyzlagach病毒，高地J病毒，摩根堡病毒，恩杜姆病毒，BuggyCreek病毒，以及任何由國際病毒分類學(xué)委員會(ICTV)分類為甲病毒的其它病毒。
在本發(fā)明的特定實施方案中，所述核酸和/或由本發(fā)明所述核酸編碼的蛋白質(zhì)可以包含減毒突變。本文所用的短語“減毒突變”和“減毒氨基酸”包括一種包含突變的核苷酸序列，或由包含突變的核苷酸序列編碼的氨基酸，根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，它導(dǎo)致在其宿主中引發(fā)疾病的可能性降低(即，毒性減少或“減弱”)。見，例如，Davis等，MICROBIOLOGY 132(第三版.1980)。短語“減毒突變”不包括對病毒致死性的突變或突變的組合。不過，另一方面，它包括可以與導(dǎo)致減毒表型的恢復(fù)性或援救性突變組合摻入的那些致死性突變。
適當(dāng)?shù)臏p毒突變將依賴于所用的甲病毒，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。示例性的減毒突變包括，但不限于，在授與Johnston等的美國專利號5,505,947，授與Johnston等的美國專利號5,185,440，授與Davis等的美國專利號5,643,576，授與Johnston等的美國專利號5,792,462，和授與Johnston等的美國專利號5,639,650中所述的突變，在此將它們的全部內(nèi)容全都并入本文作為參考。
在本發(fā)明的多種實施方案中，本發(fā)明的甲病毒顆粒的一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以包含一種或多種減毒突變，例如，在美國專利號5,792,462和6,156,558中所定義的。對VEE E1糖蛋白特異性的減毒突變可以包括在E1氨基酸位置81、272和/或253的任一個上的減毒突變。由VEE-3042突變體制成的甲病毒顆粒于E1-81上包含一個異亮氨酸取代，而由VEE-3040突變體制成的甲病毒顆粒于E1-253上包含一個減毒突變。對VEE E2糖蛋白特異性的減毒突變可以包括在E2氨基酸位置76、120或209的任一個上的減毒突變。由VEE-3014突變體制成的甲病毒顆粒于E1-272和E2-209上都包含一個減毒突變(見美國專利號5,792,492)。對VEE E3糖蛋白特異性的減毒突變包括由E3氨基酸56-59的缺失組成的減毒突變。由VEE-3526突變體制成的病毒顆粒包含這種E3中的缺失(aa56-59)，以及于E1-253上的第二個減毒突變。對S.A.AR86 E2糖蛋白特異性的減毒突變可以包括在E 2氨基酸位置304、314、372或376的任一個上的減毒突變?；蛘?，所述減毒突變可以是E2糖蛋白中氨基酸的取代、缺失和/或插入，例如，在下列氨基酸位置的任何一個或多個的任何組合上158，159，160，161和162(見Polo等，PCT公開號WO 00/61772，在此將其全部內(nèi)容并入作為參考)。
本發(fā)明的另一種減毒突變可以是在VEE基因組RNA的核苷酸3上的減毒突變，即，5’甲基化帽后的第三個核苷酸(見，例如，美國專利號5,643,576，其描述了在nt3上的一個G→C突變)。所述突變可以是G→A，U或C，在某些實施方案中也可以是G→A突變。
當(dāng)甲病毒結(jié)構(gòu)和/或非結(jié)構(gòu)蛋白來自S.A.AR86時，在結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白中的減毒突變包括，但不限于，指定減毒氨基酸的在nsp1氨基酸位置538上的密碼子，優(yōu)選異亮氨酸為nsp1氨基酸538；指定減毒氨基酸的在E2氨基酸位置304上的密碼子，優(yōu)選蘇氨酸為E2氨基酸304；指定減毒氨基酸的在E2氨基酸位置314上的密碼子，優(yōu)選賴氨酸為E2氨基酸314；指定減毒氨基酸的在E2氨基酸位置372上的密碼子，優(yōu)選亮氨酸于E2氨基酸殘基372；指定減毒氨基酸的在E2氨基酸位置376上的密碼子，優(yōu)選丙氨酸為E2氨基酸376；組合如上所述指定減毒氨基酸的在E2氨基酸殘基304、314、372和376上的密碼子；指定減毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置96上的密碼子，優(yōu)選甘氨酸為nsp2氨基酸96；指定減毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置372上的密碼子，優(yōu)選纈氨酸為nsp2氨基酸372；組合如上所述在nsp2氨基酸殘基96和372上的編碼nsp2氨基酸殘基96和372上減毒氨基酸的密碼子；指定減毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置529的上密碼子，優(yōu)選亮氨酸于nsp2氨基酸殘基529；指定減毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置571上的密碼子，優(yōu)選天冬酰胺于nsp2氨基酸殘基571；指定減毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置682上的密碼子，優(yōu)選精氨酸于nsp2氨基酸殘基682；指定減毒氨基酸的在nsp2氨基酸位置804上的密碼子，優(yōu)選精氨酸于nsp2氨基酸殘基804；指定減毒氨基酸的在nsp3氨基酸位置22上的密碼子，優(yōu)選精氨酸于nsp3氨基酸殘基22；以及組合如上所述指定減毒氨基酸的于nsp2氨基酸殘基529、571、682和804以及于nsp3氨基酸殘基22上的密碼子。
其它例證性的減毒突變包括在PCR申請?zhí)朠CT/US01/27644中所述的突變(在此將其全部內(nèi)容并入作為參考)。例如，所述減毒突變可以是S.A.AR86 nsp3蛋白的氨基酸位置537上的減毒突變，更加優(yōu)選地是在此位置上的取代突變，還要更加優(yōu)選地是導(dǎo)致終止密碼子取代的無義突變。翻譯終止(即，停止)密碼子是本領(lǐng)域已知的，包括″opal″(UGA)，″amber″(UAG)和″ochre″(UAA)終止密碼子。在本發(fā)明的實施方案中，所述減毒突變可以導(dǎo)致在S.A.AR86 nsp3氨基酸位置537上Cys→opal的取代。
另外的例示性減毒突變包括在S.A.AR86 nsp3蛋白之后的減毒插入突變。所述插入可以包含至少2，4，6，8，10，12，14，16或20個氨基酸的插入。在本發(fā)明的某些實施方案中，插入的氨基酸序列富含絲氨酸和蘇氨酸殘基(例如，包含至少2，4，6或8個這種位點)，其作為絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化作用的底物而起作用。
在某些實施方案中，所述減毒突變可以包含nsp3的氨基酸385之后的氨基酸序列Thr-Ser-Met-Asp-Ser-Tip-Ser-Ser-Gly-Pro-Ser-Ser-Leu-Glu-Ile-Val-Asp(SEQ ID NO1)的插入(即，第一個氨基酸被指定為nsp3中的氨基酸386)。在本發(fā)明的其它實施方案中，所述插入突變可以包含SEQ ID NO1片段的插入，其導(dǎo)致一種減毒的表型。所述片段可以包含至少4，6，8，10，12，14，15，16或17個來自SEQ ID NO1的相鄰氨基酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解可以通過常規(guī)方法(如上所述)對其它減毒插入序列進行常規(guī)鑒定，所述其它減毒插入序列包含如上所示序列的片段，或?qū)⒈Ｊ匦园被崛〈鷵饺肷鲜龅男蛄兄?。盡管不希望被本發(fā)明的任何理論所束縛，似乎SEQ ID NO1的插入序列在絲氨酸殘基上高度磷酸化，其賦予一種減毒的表型。因而，可以通過本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)技術(shù)鑒定其它的減毒插入序列，其作為絲氨酸(或蘇氨酸)磷酸化的底物而起作用?；蛘撸虼送?，在S.A.AR86 nsp3蛋白的氨基酸385上有一個Tyr→Ser取代(即，在以上插入序列的緊前面)。這種序列在非毒性辛德畢斯族病毒中是保守的，但從S.A.AR86中缺失。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的甲病毒可以是任何辛德畢斯病毒株(例如，TR339)，VEE(在甲基化帽之后于基因組RNA的核苷酸3上具有突變)，S.A.AR86病毒，Girdwood S.A.病毒，Ockelbo病毒，和/或其嵌合病毒。多種甲病毒的完整的基因組序列，以及各種結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的序列是本領(lǐng)域已知的并包括辛德比斯病毒基因組序列(GenBank登錄號J02363，NCBI登錄號NC_001547)，S.A.AR86基因組序列(GenBank登錄號U38305)，VEE基因組序列(GenBank登錄號L04653，NCBI登錄號NC_001449)，Girdwood S.A基因組序列(GenBank登錄號U38304)，塞姆利基森林病毒基因組序列(GenBank登錄號X04129，NCBI登錄號NC_003215)，和TR339基因組序列(Klimstra等(1988)J.Virol.727357；McKnight等(1996)J.Virol.701981)。
在本發(fā)明的特定實施方案中，本發(fā)明的甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以是辛德比斯病毒結(jié)構(gòu)蛋白，SFV結(jié)構(gòu)蛋白，VEE結(jié)構(gòu)蛋白，羅斯河病毒結(jié)構(gòu)蛋白，S.A.AR86結(jié)構(gòu)蛋白，EEE結(jié)構(gòu)蛋白和/或WEE結(jié)構(gòu)蛋白。這些可以組合任何其它一個存在并可以組合任何甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白和/或其它甲病毒序列存在，如來自任何這些和/或其它甲病毒的5’甲病毒復(fù)制識別序列，甲病毒亞基因組啟動子和3’甲病毒復(fù)制識別序列，以便產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合重組甲病毒顆粒和/或嵌合重組核酸。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的IRES元件指導(dǎo)由本發(fā)明的重組核酸的異源核酸所編碼的基因產(chǎn)物的翻譯，從而使至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的由異源核酸編碼的基因產(chǎn)物的翻譯受IRES元件活性的控制。根據(jù)本領(lǐng)域公知的和在本文實施例部分所述的分析法可以測定由IRES所控制的本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸中異源核酸編碼的基因產(chǎn)物的翻譯的百分比。
另外，在本發(fā)明的該實施方案中，其中本發(fā)明的I RES元件指導(dǎo)存在于本發(fā)明輔助構(gòu)建體中的甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯，本發(fā)明的IRES元件能夠指導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯，從而使至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯受IRES元件活性的控制。根據(jù)本領(lǐng)域公知的和在本文實施例部分所述的分析法可以測定由本發(fā)明的IRES所控制的結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯的百分比。
本發(fā)明的核酸可以是RNA或DNA。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供一系列輔助核酸(“輔助構(gòu)建體”或“輔助分子”)，即，表達(dá)一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組DNA或RNA分子。在一組RNA實施方案中，所述輔助構(gòu)建體包含一種編碼(i)5′甲病毒復(fù)制識別序列，(ii)轉(zhuǎn)錄啟動子，(iii)編碼至少一種，但并非全部甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列，和(iv)甲病毒3′復(fù)制識別序列的第一核酸序列。在某些實施方案中，E1和E2糖蛋白由一種輔助構(gòu)建體所編碼，而殼體蛋白由另一種獨立的輔助構(gòu)建體所編碼。在另一個實施方案中，E1糖蛋白、E2糖蛋白和殼體蛋白每種都由獨立的輔助構(gòu)建體所編碼。在其它的實施方案中，殼體蛋白和一種糖蛋白由一種輔助構(gòu)建體所編碼，而另一種糖蛋白由一種獨立的第二輔助構(gòu)建體所編碼。仍在其它的實施方案中，所述殼體蛋白和糖蛋白E1由一種輔助構(gòu)建體所編碼，而殼體蛋白和糖蛋白E2由一種獨立的輔助構(gòu)建體所編碼。在某些實施方案中，本發(fā)明的輔助構(gòu)建體不包括甲病毒包裝信號。
或者，上述的輔助核酸被構(gòu)建為DNA分子，其能夠穩(wěn)定地整合入輔助細(xì)胞的基因組或由游離體所表達(dá)(例如，EBV來源的游離體)。所述DNA分子也可以在細(xì)胞中瞬時表達(dá)。所述DNA分子可以是本領(lǐng)域已知的任何載體，包括但不限于，非整合性DNA載體，如一種質(zhì)粒或病毒載體。所述DNA分子能夠編碼本文所述的一種或任意組合的全部甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
將本發(fā)明的輔助構(gòu)建體導(dǎo)入“輔助細(xì)胞”中，所述輔助細(xì)胞被用來產(chǎn)生本發(fā)明的甲病毒顆粒。如上所注，編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸可以短暫存在于輔助細(xì)胞中或穩(wěn)定整合入輔助細(xì)胞的基因組中。用于生產(chǎn)本發(fā)明的甲病毒顆粒的編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸可以在組成性和/或可誘導(dǎo)的啟動子的控制下。還如上所注，甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列可以提供于重組復(fù)制子核酸和/或包含IRES元件的輔助構(gòu)建體上并且這些編碼序列的翻譯可以受IRES元件的活性控制。在這些實施方案中，IRES元件可以在特異性輔助細(xì)胞類型中具有活性或不具有活性，或在其它細(xì)胞類型中具有最小活性。在特定的實施方案中，當(dāng)將重組復(fù)制子核酸導(dǎo)入細(xì)胞時，本發(fā)明的輔助細(xì)胞包含組合和/或足以產(chǎn)生本發(fā)明的甲病毒顆粒的編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列，所述導(dǎo)入是在產(chǎn)生甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白和將重組復(fù)制子核酸包裝入本發(fā)明的甲病毒顆粒的條件下進行的。
在本發(fā)明的全部實施方案中，預(yù)期至少一種由重組復(fù)制子核酸和/或輔助分子，和/或所述重組復(fù)制子的非翻譯區(qū)和/或輔助核酸所編碼的甲病毒結(jié)構(gòu)和/或非結(jié)構(gòu)蛋白，如本文所述的和文獻(xiàn)中所公知的，可以包含一個或多個任意組合的減毒突變。
在本發(fā)明的特定構(gòu)建體中，使用一種指導(dǎo)由DNA進行RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子，即，一種DNA依賴性的RNA聚合酶。在本發(fā)明的輔助RNA和復(fù)制子實施方案中，將啟動子用于在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中合成RNA，適于這種應(yīng)用的具體啟動子包括，但不限于，SP6，T7和T3 RNA聚合酶啟動子。在DNA輔助實施方案中，所述啟動子在細(xì)胞中發(fā)揮作用以指導(dǎo)RNA的轉(zhuǎn)錄。對于構(gòu)建體的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的潛在啟動子包括，但不限于，真核啟動子如RNA聚合酶II啟動子，RNA聚合酶III啟動子，或病毒啟動子如MMTV和MoSV LTR，SV40早期區(qū)，RSV或CMV。許多對于本發(fā)明全適的其它哺乳動物和病毒啟動子是本領(lǐng)域現(xiàn)有的和已知的。或者，可以采用來自細(xì)菌或噬菌體的DNA依賴性RNA聚合酶啟動子，例如，SP6，T7和T3，與通過分離質(zhì)粒、RNA載體或病毒載體提供給細(xì)胞的匹配RNA聚合酶一起進行體內(nèi)應(yīng)用。在一個特定的實施方案中，匹配RNA聚合酶可以在可誘導(dǎo)啟動子的控制下穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到輔助細(xì)胞系。在細(xì)胞內(nèi)作用的構(gòu)建體可以作為轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的自主質(zhì)粒起作用和/或它們能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化入基因組中。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中，所述啟動子可以是一種可誘導(dǎo)的啟動子，從而當(dāng)細(xì)胞暴露于適當(dāng)?shù)拇碳の?誘導(dǎo)物)時細(xì)胞僅產(chǎn)生由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體編碼的RNA聚合酶。將輔助構(gòu)建體在暴露于誘導(dǎo)物的同時，之前和/或之后導(dǎo)入穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，由此影響甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)?；蛘?，可以將設(shè)計來在細(xì)胞內(nèi)作用的構(gòu)建體通過病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞中，所述病毒載體如，例如，腺病毒、痘病毒、腺伴隨病毒、SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒、野田村病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、水泡性口炎病毒和具有哺乳類pol II啟動子的桿狀病毒。
在本文提供的本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸和/或輔助核酸可以包含一種間隔區(qū)核酸，其能夠位于本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸和/或輔助核酸的IRES元件的上游。所述間隔區(qū)核酸可以包含任何隨機的或特異性的非編碼核酸序列，或基本由其組成，或由其組成，所述核酸序列足夠長以防止至少一些，在某些實施方案中，防止全部的信使RNA5’帽的翻譯，從而隨后使翻譯部分或全部受IRES指導(dǎo)?；蛘撸鲩g隔區(qū)核酸可以是這樣一種長度和序列結(jié)構(gòu)，即給予核酸充分的二級結(jié)構(gòu)以防止至少一些并且可能是全部的信使RNA5’帽的翻譯活性。
作為一個例子，用限制酶AluI消化一種可商購的質(zhì)粒pCDNA 3.1(-)，所述限制酶在這種質(zhì)粒中頻繁地切割，由此產(chǎn)生許多隨機的和不同大小的片段(詳見實施例3)。所述pCDNA 3.1(-)質(zhì)粒長為5427個核苷酸，并且是一種真核表達(dá)載體，包含多個啟動子(CMV，T7，SV40)用于插入核酸的表達(dá)，以及多聚腺苷化信號和抗生素抗性基因。AluI酶在全部這些元件中切割，提供了一系列隨機片段。下面提供幾種不同的間隔區(qū)及其序列的例子，其由此例子產(chǎn)生并且它不編碼任何來自質(zhì)粒的功能性元件357個核苷酸的間隔區(qū)CTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAG342個核苷酸的間隔區(qū)CTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCAC GCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG257個核苷酸的間隔區(qū)
CTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAG383個核苷酸的間隔區(qū)CTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCGAAAATGGATATACAAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG579個核苷酸的間隔區(qū)CTGCAATAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG749個核苷酸的間隔區(qū)CTGCAATAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAACCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAG
除了使用由不相關(guān)質(zhì)粒產(chǎn)生的隨機核酸片段(如在上述AluI片段中)之外，還有可能使用來自細(xì)胞或病毒基因的片段，例如，來自基因的5’非編碼區(qū)作為間隔區(qū)。一種方法是使用存在的I RES周圍的非編碼序列(見實施例4B.4)；另一種方法是使用甲病毒基因，例如，殼體基因的5’非編碼區(qū)(見實施例4A.2)。
因而，預(yù)期本發(fā)明的間隔區(qū)核酸在給定的重組復(fù)制子核酸中最小可以為25個核苷酸長，并且可以盡可能地長。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明的間隔區(qū)核酸可以為大約25，30，35，40，45，50，55，60，65，75，80，85，90，95，100，110，115，120，125，130，135，140，145，150，160，170，175，180，190，200，210，220，225，230，235，240，245，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，50，600，700，800，900，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500或10,000個核苷酸長。“大約”意為所述間隔區(qū)核酸可以變化最大為長度的10％，15％，20％和/或25％。
本發(fā)明的間隔區(qū)核酸還可以是一個3’到5’方向的核苷酸序列，用于起始信使RNA以及5’到功能性IRES元件的轉(zhuǎn)錄，其中由所述IRES元件指導(dǎo)的翻譯水平至少比獲自非功能性IRES元件的水平高5倍。在優(yōu)選的實施方案中，翻譯的水平至少高大約10倍、20倍、50倍、100倍、150倍、180倍、200倍、300倍、400倍、或500倍。在其它的實施方案中，至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的由異源核酸編碼的基因產(chǎn)物和/或由包含IRES的輔助構(gòu)建體編碼的結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯受IRES元件活性的控制。
本發(fā)明還提供一種包含本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸的甲病毒顆粒。還提供了傳染性和有缺陷的甲病毒顆粒群體，其中每個顆粒都包含一種甲病毒復(fù)制子RNA，其含有本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸。在某些實施方案中，如通過細(xì)胞培養(yǎng)物的傳代和/或其它公知的檢測可復(fù)制病毒的分析法所測量的，本發(fā)明的群體不具有可檢測的能夠復(fù)制的病毒。
本發(fā)明進一步提供一種藥物組合物，其在一種可藥用的載體中包含本發(fā)明的核酸、載體、顆粒和/或群體?！翱伤幱谩币鉃橐环N并非生物或原本不需要的材料，即，所述材料可以與所選的肽、多肽、核酸、載體或細(xì)胞一起向個體施用，而不會引起顯著的有害生物學(xué)效應(yīng)或以有害的方式與任何組合物中包含的其它組分相互作用。
另外，本發(fā)明的任何組合物都能夠包含一種可藥用的載體和一種適合的佐劑。如本文所用的，“適合的佐劑”描述一種佐劑，其能夠組合本發(fā)明的肽或多肽以進一步增強免疫應(yīng)答，而對受試者或受試者的細(xì)胞沒有有害效應(yīng)。適合的佐劑可以是，但不限于，MONTANIDEISA51(Seppic，Inc.，F(xiàn)airfield，NJ)，SYNTEX佐劑制劑1(SAF-1)，其由磷酸緩沖鹽溶液中的5％(wt/vol)角鯊烯(DASF，Parsippany，N.J.)，2.5％Pluronic，L121聚合物(AldrichChemical，Milwaukee)，和0.2％聚山梨酯20(Tween 80，Sigma)所組成。其它適合的佐劑是本領(lǐng)域公知的并且包括QS-21，弗氏佐劑(完全的和不完全的)，鋁鹽(明礬)，磷酸鋁，氫氧化鋁，N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP 11637，稱為正-MDP)，N-乙?；邗?L-丙氨酰-D-異谷氨酰氨-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰基氧)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)和RIBI，其包含三種由細(xì)胞中提取的組分，溶解于2％角鯊烯/Tween 80乳劑中的單磷酰脂質(zhì)A、海藻糖二霉菌酸酯和細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐劑既可以與本發(fā)明的組合物也可以與其它疫苗組合物組合，所述疫苗組合物能夠與本發(fā)明的組合物組合使用。佐劑的例子可以包括，但不限于，水包油乳劑制劑，免疫刺激劑，如細(xì)菌細(xì)胞壁組分或合成的分子，或寡核苷酸(例如CpGs)和核酸聚合物(雙鏈和單鏈RNA與DNA)，其能夠摻入可選的骨架部分，例如，聚乙烯聚合物。
本發(fā)明的組合物還可以包括其它藥物，藥劑，載體，稀釋劑，免疫刺激性細(xì)胞因子等。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，制備這些劑型的實際方法是已知的，或是顯而易見的。如本發(fā)明所預(yù)期的，優(yōu)選的甲病毒復(fù)制子顆粒劑量可以為103到1010顆粒/劑。對于人類來說，106、107或108為優(yōu)選的劑量。如對于通過向受試者施用本發(fā)明的組合物而獲得預(yù)期預(yù)防和/或治療作用所必需的，劑量方案可以是每小時、每天、每周、每月、每年一劑或多劑。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法可以測定特定劑量的效力。
本發(fā)明進一步提供一種制備傳染性的有缺陷的甲病毒顆粒的方法，包括a)向細(xì)胞中導(dǎo)入下列成分(i)本發(fā)明的重組復(fù)制子核酸，和(ii)一種或多種編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的輔助核酸，其中所述一種或多種輔助核酸產(chǎn)生全部甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白，和b)在細(xì)胞中產(chǎn)生所述甲病毒顆粒。在某些實施方案中，所述重組復(fù)制子核酸可以包含至少一種編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的異源核酸。
在本發(fā)明的方法的其它實施方案中，所述輔助核酸可以是一種重組核酸，其包含5′甲病毒復(fù)制識別序列、甲病毒亞基因組啟動子、編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列。
在其它實施方案中，所述輔助核酸可以是一種重組核酸(其可以是DNA)，其包含啟動子(例如，CMV啟動子)和編碼一種或多種包括全部甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。
本發(fā)明的輔助核酸可以包含以任意順序和/或任意組合編碼任一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白(C，E1，E2)的核酸序列。因而，輔助細(xì)胞可以包含所需要的多種輔助核酸從而提供產(chǎn)生甲病毒顆粒所需要的全部甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白。輔助細(xì)胞還可以包含被穩(wěn)定整合入輔助(例如，包裝)細(xì)胞的基因組中的輔助核酸。在這些輔助細(xì)胞中，可以在啟動子的控制下產(chǎn)生甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白，所述啟動子可以是一種可誘導(dǎo)的啟動子。
在某些實施方案中，本發(fā)明的方法中所用的輔助核酸可以是這樣一種重組核酸，它包含5’甲病毒復(fù)制識別序列、IRES元件、編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列。
在其它的實施方案中，所述輔助核酸可以是這樣一種重組核酸，它包含5’甲病毒復(fù)制識別序列、甲病毒亞基因組啟動子、IRES元件、編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列。
此外，本文提供一種制備傳染性有缺陷甲病毒顆粒的方法，包括a)向細(xì)胞中導(dǎo)入下列成分(i)甲病毒復(fù)制子RNA，其包含5’甲病毒復(fù)制識別序列、編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列、甲病毒亞基因組啟動子、異源核酸序列和3’甲病毒復(fù)制識別序列；和(ii)一種或多種編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的輔助核酸，它包含5’甲病毒復(fù)制識別序列、甲病毒亞基因組啟動子、IRES元件、編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列，由此在細(xì)胞中產(chǎn)生全部甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白；和b)在細(xì)胞中產(chǎn)生所述甲病毒顆粒。
本文還提供一種制備傳染性有缺陷甲病毒顆粒的方法，包括a)向細(xì)胞中導(dǎo)入下列成分(i)甲病毒復(fù)制子RNA，其包含5’甲病毒復(fù)制識別序列、編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列、至少一個甲病毒亞基因組啟動子、至少一個IRES啟動子、至少一個異源核酸序列和3’甲病毒復(fù)制識別序列；和(ii)一種或多種編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的輔助核酸，它包含5’甲病毒復(fù)制識別序列、甲病毒亞基因組啟動子、IRES元件、編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列，由此在細(xì)胞中產(chǎn)生全部甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白；和b)在細(xì)胞中產(chǎn)生所述甲病毒顆粒。
本發(fā)明的制備傳染性有缺陷甲病毒顆粒的方法可以進一步包括從細(xì)胞中收集所述甲病毒顆粒的步驟。
本發(fā)明還提供一種重組核酸，它包含5’甲病毒復(fù)制識別序列、甲病毒亞基因組啟動子、IRES元件、以任意組合和/或順序編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列。在某些實施方案中，這種重組輔助核酸可以包含一種間隔區(qū)核苷酸序列，它可以在IRES元件的上游。還提供一種包含這種重組核酸的載體和/或細(xì)胞。
此外本文提供一種重組核酸，其包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列；至少一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列；第一甲病毒亞基因組啟動子；第一IRES元件；第一異源核酸；第二甲病毒亞基因組啟動子；第二IRES元件；編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸。在某些實施方案中，所述第一和第二甲病毒亞基因組啟動子可以是相同的或不同的，所述第一和第二IRES元件可以是相同的或不同的，和/或所述第一和第二異源核酸可以是相同的或不同的。這種重組核酸可以包含甲病毒包裝信號和/或間隔區(qū)核苷酸序列，它可以在IRES元件的上游。這種重組核酸還可以包含一個或多個以任意順序和/或組合編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列，從而全部四種甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列都存在于所述重組核酸上。這種重組核酸可以存在于本發(fā)明的甲病毒顆粒中并且這些顆粒能夠作為本發(fā)明的群體和/或于本發(fā)明的藥物組合物中存在。
還提供一種如上所述的重組復(fù)制子核酸，進一步包含第三或其它額外的甲病毒亞基因組啟動子，第三或其它額外的IRES元件和/或第三或其它額外的異源核酸。這種重組核酸可以存在于本發(fā)明的甲病毒顆粒中并且這些顆粒能夠作為本發(fā)明的群體和/或于本發(fā)明的藥物組合物中存在。包含重組核酸的這一實施方案的甲病毒顆?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的任何方法進行生產(chǎn)并用于引發(fā)免疫應(yīng)答和/或向細(xì)胞遞送NOI的任何方法中。
作為另一種實施方案，本發(fā)明提供一種重組核酸，包含指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的啟動子；IRES元件；和包含編碼序列的核酸，其中所述IRES元件被可操作地定位，從而使編碼序列的翻譯通過由IRES元件指導(dǎo)的不依賴于帽的機制來進行。在這一實施方案中，核酸的轉(zhuǎn)錄與核酸的翻譯分開。
可以理解以上詳細(xì)描述僅僅是通過示例的方式給出的，并且其中可以進行改進和變化，而不會背離本發(fā)明的精神和范圍。
實施例實施例1.轉(zhuǎn)移克隆載體的構(gòu)建A.包含EMCV IRES的載體制備一種轉(zhuǎn)移載體(pCDNA3.3)，可以將腦心肌炎(EMCV)IRES序列和任何NOI導(dǎo)入其中。用限制酶Bathe消化質(zhì)粒pCDNA 3.1(+)(Nitrogen)并用T4DNA聚合酶處理以消除獨特的Bathe限制位點，導(dǎo)致pCDNA3.2的產(chǎn)生。用限制酶Bay進一步消化pCDNA3.2DNA并且也用T4DNA聚合酶處理以去除獨特的Bay限制位點，導(dǎo)致pCDNA3.3的產(chǎn)生。
通過將約250bp的ApaI/NotI MCS片段連接到ApaI/NotI線性化的pBluescript KS+(Stratagene)DNA中，產(chǎn)生pKS-rep2來制備包含來自VEE復(fù)制子載體的多克隆位點(MCS)的中間克隆載體。用限制酶EcoRI和BamHI從D1+2+3(Kaminski等，1995)中消化EMCVIRES并連接入EcoRI和BamHI線性化的pKS-rep2DNA中，產(chǎn)生pKS-rep2/EMCV。利用引物EMCVF(AscI).2和EMCVR(AscI).1(表1)對來自pKS-rep2/EMCV載體的EMCV IRES和MCS序列進行PCR擴增。用AscI限制酶消化EMCV PCR產(chǎn)物并連接入AscI線性化的VEE復(fù)制子(pERK)載體DNA中，產(chǎn)生pERK/EMCV。為了完成轉(zhuǎn)移克隆載體，用EcoRV和NotI限制酶消化pERK/EMCV DNA并將862bp的EcoRV/NotI片段連接和EcoRV和NotI線性化的pCDNA3.3DNA中，產(chǎn)生pCDNA3.3/EMCV。在用它制備其它構(gòu)建體之前在pCDNA3.3/EMCV載體中對EMCV IRES的序列和相關(guān)聯(lián)的多克隆位點進行確認(rèn)。
表1
B.包含XIAP IRES的載體利用cDNA提供的銜接子引物和XIAP反向引物(XIAP-R)從胎肝marathon ready cDNA(Clontech，Palo Alto，CA)由包含推定IRES元件(見Holcik等，(1999)Nature Cell Biol 1190-192；Holcik和Komeluk(2000)Mol Cell Biol 204648-57與Holcik等，(2003)Mol Cell Biol 23280-288，元件的序列和大小)的凋亡的X連鎖抑制劑(XIAP)基因5’非編碼區(qū)(NCR)進行PCR擴增，隨后利用XIAPIRES特異引物進行巢式PCR。引物列于表2中。利用可商購的試劑盒(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)對大約1007和241bp的得到的PCR產(chǎn)物進行TA克隆。除了推定的XIAP IRES之外，這些構(gòu)建體分別具有XIAP基因非編碼區(qū)的844個核苷酸或78個核苷酸。通過自動DNA測序確認(rèn)每個構(gòu)建體的序列。為了生成用于克隆入VEE復(fù)制子的穿梭載體，將作為EcoRI片段的XIAP序列轉(zhuǎn)移入pKS-rep2的等同位點，產(chǎn)生pKS-rep2/XIAP 1007和pKS-rep2/XIAP241 DNAs。
表2
1007bp XIAP 5’NCRACACGTGGGGCAACCCTGATTTATGCCTGTTGTCCCAGTGTGATTATTACTAGTGTAATTTTTCACTTTGAGAAGTGTCCAGGTTTGGAGGATAAATTATCTTTCTAATAATTGATACCCTTCTCATAACCTAACGGGTTCCTTTTAGTATTTTATCTGGGTTAAAATTACCAGCTGTAATTTGGCAGCTCTAATAAGACTGCAGCAATACTTATCTTCCATTTGAACAGATTGTTACTTGACCAAGGGAAGTTAATAGCAAAAGTAACTGCAGGGCACATGTATGTCATGGGCAAAAAAAAAAAAGTAACAGCAATTAAGGTTTGCAGGTACTTAGAATTTTTCCTGAGCCACCCTCTAGAGGGCAGTGTTACATATATATCTGTAATTATCCAGTTACAACAAAAAAAGGGCTCTCATTCATGCATGAAAATCAGAAATATTTCATACTCTTAAAGAACACATTGGAACCAATATTATGATTAAAACATATTTTGCTAAGCAAAGAGATATTAAAAATTAATTCATTAACATTCTGAACATTTTTTAACTTGTAAAAACAACTTTGATGCCTTGAATATATAATGATTCATTATAACAATTATGCATAGATTTTAATAATCTGCATATTTTATGCTTTCATGTTTTTCCTAATTAATGATTTGACATGGTTAATAATTATAATATATTCTGCATCACAGTTTACATATTTATGTAAAATAAGCATTTAAAAATTATTAGTTTTATTCTGCCTGCTTAAATATTACTTTCCTCAAAAAGAGAAAACAAAAATGCTAGATTTTACTTTATGACTTGAATGATGTGGTAATGTCGAACTCTAGTATTTAGAATTAGAATGTTTCTTAGCGGTCGTGTAGTTATTTTTATGTCATAAGTGGATAATTTGTTAGCTCCTATAACAAAAGTCTGTTGCTTGTGTTTCACATTTTGGATTTCCTAATATAATGTTCTCTTTTTAGAAAAGGTGGACAAGTCCTATTTTCAAGAGAAGAT
實施例2.改進的復(fù)制子載體的構(gòu)建A.包含EMCV IRES的構(gòu)建體為了證明置于功能性甲病毒26S啟動子下游的IRES序列的功能性，將報告基因亞克隆入pCDNA 3.3/EMCV轉(zhuǎn)移載體中并隨后將EMCV/報告基因盒移入pERK復(fù)制子載體中。利用表達(dá)氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)報告基因的復(fù)制子載體進行起始實驗。利用引物F′-CAT(BamHI)和R′-CAT(XbaI)(表1)擴增CAT基因。用BamHI和XbaI限制酶消化PCR產(chǎn)物并連接入BamHI/XbaI線性化的pCDNA3.3/EMCVDNA中，產(chǎn)生pCDNA 3.3/EMCV/CAT。在確認(rèn)CAT基因的序列后，用AscI限制酶消化pCDNA3.3/EMCV/CAT DNA以釋放1303bp的EMCV/CAT片段。隨后將AscI消化的EMCV/CAT片段連接入AscI線性化的pERK載體DNA中，產(chǎn)生pERK/EMCV/CAT。
已經(jīng)顯示EMCV IRES具有指導(dǎo)性的活性并且當(dāng)它相對于NOI處于錯誤的方向時，沒有記錄到不依賴于帽的翻譯(Roberts and Belsham(1997)Virology 22753-62)。此外，EMCV IRES的5’末端序列的缺失終止了eicistronic表達(dá)載體的不依賴于帽的翻譯(Van derVelden等.(1995)Virology 21482-90；Jang & Wimmer(1990)Genes & Development 41560-72)。為了證明發(fā)生了CAT基因的不依賴于帽的翻譯，制備與ERK/EMCV/CAT相同的pERK載體，僅僅在反義方向上具有EMCV IRES(pERK/反-EMCV/CAT)或具有EMCV IRES末端序列的5′缺失(pERK/ΔAvr/CAT)。
利用引物反-En(EcoRI)和反-En(BamHI)(表1)從pKSrep2/EMCV DNA中PCR擴增EMCV IRES的反義形式。用EcoRI和BamHI限制酶消化擴增的EMCV IRES片段并連接入EcoRI/BamHI線性化的pKS-rep2 DNA中，產(chǎn)生pKS-rep2/反-EMCV。將上述BamHI/XbaI消化的CAT基因連接入BamHI/XbaI線性化的pKS-rep2/反-EMCV DNA中，產(chǎn)生pKS-rep2/反-EMCV/CAT。利用引物EMCVR(AscI).1和反-En(AscI)(表1)從KS-rep2/反-EMCV/CAT DNA中PCR擴增1295bp的反-EMCV/CAT基因盒。最后，用AscI限制酶消化反-EMCV/CAT片段并連接入AscI線性化的pERK載體DNA中，產(chǎn)生pERK/反-EMCV/CAT。在實施進一步的實驗之前對反EMCV/CAT基因區(qū)的序列進行確認(rèn)。
為了生成ΔAvr/CAT pERK載體，首先在pKS-rep2/EMCV中間載體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的EMCV IRES中制成ΔAvr缺失。通過用EcoRI和AvrII限制酶消化pKS-rep2/EMCV DNA來實現(xiàn)缺失，從EMCV IRES的5’區(qū)缺失145bp。用T4DNA聚合酶處理線性化的DNA以生成鈍末端并進行再連接以產(chǎn)生pKS-rep2/ΔAvr DNA。通過將上述BamHI/XbaI CAT基因連接入BamHI和Xbal限制酶線性化的pKS-rep2/ΔAvr中而將CAT基因克隆入中間載體，生成pKS-rep2/ΔAvr/CAT DNA。利用引物EMCVR(AscI).1和dAvr En(AscI)R(表1)由pKS-rep2/ΔAvr/CAT對1177bp的ΔAvr/CAT DNA基因盒進行PCR擴增。最后，用AscI限制酶消化ΔAvr/CAT片段并連接入AscI線性化的pERK載體DNA中，生成pERK/ΔAvr/CAT。在進行其它實驗之前對ΔAvr/CAT基因區(qū)的序列進行確認(rèn)。
B.包含EV71 IRES的構(gòu)建體在有義和反義兩個方向上將人腸道病毒71(EV71)IRES元件(Thompson和Samow(2003)Virology 315259-266)克隆入間隔區(qū)復(fù)制子載體并分析CAT報告基因的表達(dá)。利用引物由pdc/MSDNA(Thompson和Sarnow，2003)中PCR擴增The EV71 IRES元件(7423/MS/87株)以產(chǎn)生有義片段(dc/MS(EcoRI)F和dc/MS(BamHI)R)以及反義片段(dc/反-MS(EcoRI)R和dc/反-MS(BamHI)F)(表3)。用EcoRI和BamHI限制酶消化有義和反義的EV71-MS IRESPCR產(chǎn)生并連接入用EcoRI和BamHI線性化的pCDNA3.3(見實施例1)中，生成pCDNA3.3/MS和pCDNA3.3/反-MS。對每個pCDNA3.3載體中的EV71-MS IRES區(qū)進行測序以確證在起始進一步的實驗之前于克隆過程中沒有導(dǎo)入核苷酸變化。
將如上述A.中的CAT報告基因克隆入BamHI和XbaI線性化的pCDNA3.3/MS和pCDNA3.3/反-MS載體中，分別生成pCDNA3.3/MS/CAT和pCDNA3.3/反-MS/CAT。通過用AscI限制酶消化pCDNA3.3/MS/CAT和pCDNA3.3/反MS/CAT DNAs并將MS-CAT或反-MSCAT AscI片段連接入間隔區(qū)復(fù)制子載體中來產(chǎn)生間隔區(qū)復(fù)制子構(gòu)建體。對每個載體的間隔區(qū)-IRES-CAT區(qū)進行測序以確證在起始進一步的實驗之前于克隆過程中沒有導(dǎo)入核苷酸變化。
表3
C.包含XIAP IRES的構(gòu)建體在利用CATF(5′-GGAGAAAAAAATCACTGGATATAC-3′)和CATR(Bam)(5′-GGGGATCCTTACGCCCCGCCCTGCCAC-3′)引物對基因進行PCR擴增后將CAT基因克隆入pKS-rep2/XIAP1007的EcoRV和BamHI位點中(見下面實施例4中)，生成pKSrep2/XIAP/CAT 1007。這一策略重構(gòu)了野生型XIAP基因位點。隨后將中間體作為ApaI/SphI片段克隆入pERK中以生成pERK/XIAP/CAT 1007。在體外轉(zhuǎn)錄和電穿孔入Vero細(xì)胞中后，測定感染細(xì)胞中的VRP產(chǎn)量和CAT蛋白表達(dá)并與pERK/EMCV/CAT342相比。兩種構(gòu)建體的VRP產(chǎn)量相等。在這種特定的構(gòu)建體中，有可能利用XIAP IRES(3.97 e5 ng/μg)與EMCV IRES(1.08 e6 ng/μg)相比改進CAT蛋白表達(dá)的水平，由此在所要求的發(fā)明中說明不同IRESs的用途。
D.表達(dá)HIVgp160的構(gòu)建體構(gòu)建表達(dá)HIVgp 160 C類基因的復(fù)制子，其中HIVgp 160的翻譯由EMCV IRES指導(dǎo)。在此構(gòu)建體中，將來自pH1500A/EMCV/V帽輔助構(gòu)建體(見實施例4.B.1.)的167bp間隔區(qū)克隆入如下的EMCV IRES復(fù)制子構(gòu)建體中。用ApaI限制酶消化pH1500A/EMCV/Vcap DNA以釋放194bp的包含167bp間隔區(qū)和一部分EMCV IRES的片段。還用ApaI限制酶消化pERK/EMCV 749載體并將釋放的749bp的間隔區(qū)ApaI片段用167bp的間隔區(qū)ApaI片段替換，生成pERK/EMCV 167載體。為了證明異源基因也能夠由pERK/EMCV 167復(fù)制子載體進行有效表達(dá)和包裝，將HIV C類gp 160基因(Williamson C等(2003)AIDSRes Hum Retroviruses 19133-44)如下克隆入這種載體中。擴增HIVgp160基因(使用引物env-5′-XbaI和DU151gp160 3′-XbaI)表4)并克隆入pCR-XL-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，生成pCR-XL-TOPO/gp160。對gp160基因進行測序以確保在起始進一步的研究之前于PCR擴增過程中沒有引入錯誤。用XbaI限制酶消化pCR-XL-TOPO/gp160 DNA并隨后將gp160片段連接入XbaI線性化的pCDNA3.3/EMCV中，生成pCDNA3.3/EMCV/gp160。用AscI限制酶消化pCDNA3.3/EMCV/gp160DNA以釋放EMCV/gp160片段。隨后將EMCV/gp160片段連接入AscI線性化的pERK/EMCV 167載體DNA中，生成pERK/EMCV/gp160 167載體。
表4
E.表達(dá)多個NOIs的雙亞基因組IRES復(fù)制子的構(gòu)建構(gòu)建連續(xù)編碼兩個26S-間隔區(qū)-IRES-NOI盒的IRES復(fù)制子載體。用于生成雙亞基因組IRES復(fù)制子(pERK MCS2)的基礎(chǔ)pERK載體包含342bp的26S啟動子下游的間隔區(qū)并在其MCS中編碼接下來的限制性位點(5′AscI，SnaBI，SphI 3′)。
將肉毒桿菌神經(jīng)毒素A和B(BoNT A和BoNT B)重鏈(Hc)的C末端部分克隆入pCDNA3.3/EMCV中作為BamHI/XbaI片段，分別生成pCDNA3.3/EMCV/BoNT A和pCDNA3.3/EMCV/BoNT B。用AscI限制酶將BoNT基因消化出pCDNA3.3/EMCV載體并將AscI EMCV/BoNT盒連接入AscI線性化的pERK MCS2DNA中，生成pERK/BoNT A MCS2和pERK/BoNT B MCS2單價載體。通過限制性分析測定插入的方向并分離于有義方向具有插入片段的克隆。對EMCV IRES和BoNT基因進行測序以證實在起始進一步的實驗之前于克隆的過程中沒有導(dǎo)入錯誤。
為了生成雙亞基因組BoNT A/B IRES復(fù)制子構(gòu)建體(pERK-BoNTA/B MCS2)，利用單價pERK BoNT MCS 2載體。用PspOM I限制酶對pERK/BoNT B MCS2載體進行部分消化并利用T4DNA聚合酶將末端制成鈍末端。用SphI限制酶進一步消化pERK/BoNT B MCS2 DNA以釋放26S-342bp間隔區(qū)-EMCV-BoNT B片段。隨后將26S-342 bp間隔區(qū)-EMCV-BoNT B片段連接入SnaBI/SphI消化的pERK/BoNT A MCS2DNA中，生成pERK-BoNT A/B MCS2載體。構(gòu)建體的最后結(jié)構(gòu)為5′NCR-nsP 1，2，3，4-26S-342bp間隔區(qū)-EMCV-BoNT A-26S-342bp間隔區(qū)-EMCV-BoNT B-NCR 3′。在表達(dá)前確證所述雙亞基因組復(fù)制子的序列并進行VRP包裝研究。
F.構(gòu)建包含IRES的S.A.AR86復(fù)制子將源自S.A.AR86的復(fù)制子載體(pRep89；在Heise等.J Virol.200377(2)1149-56中得到描述)改進為包含26S啟動子下游的342bp間隔區(qū)-EMCV-HIV gag盒。利用引物填充片段342(cal)和3-42.pr4(表5)由pERK/EMCV/gag 342DNA對342bp間隔區(qū)-EMCV-HIV gag片段進行PCR擴增。用3-42.pr4引物進行擴增允許并入3′ClaI位點，其存在于pERK/EMCV/gag 342DNA中HIV gag基因的緊鄰下游。隨后用ClaI限制酶消化PCR產(chǎn)物并連接入ClaI線性化的pRep89中，生成pRep89/EMCV/gag 342載體。對完整的插入?yún)^(qū)進行測序以確保在PCR擴增過程中未曾導(dǎo)入過錯誤。
表5.
實施例3.由IRES-指導(dǎo)的復(fù)制子進行NOI表達(dá)分析A.EMCV IRES復(fù)制子表達(dá)1.CAT表達(dá)利用pERK/EMCV/CAT，pERK/反-EMCV/CAT，和pERK/AAvr/CAT復(fù)制子構(gòu)建體檢查CAT蛋白表達(dá)。利用T7RiboMax試劑盒(PromegaCorporation；Madison，WI；Cat No.P1300)對加帽復(fù)制子RNAs進行體外轉(zhuǎn)錄。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書利用RNeasy純化柱(QiagenCorporation，Germantown，MD)對RNAs進行純化。將Vero細(xì)胞(6×106細(xì)胞懸浮于0.4mlInVitrusTtM化學(xué)限定的細(xì)胞培養(yǎng)基中，(CellCulture Technologies GmbH，Zurich，CH；Catalog No.IVT)并以15μg的pERK/EMCV/CAT或pERK/反-EMCV/CAT RNA利用Bio RadGene Pulser(BioRad Laboratories，Hercules，CA)進行電穿孔。用設(shè)定于290伏和25微法拉的電穿孔儀將細(xì)胞脈沖四次。通過利用甲醇固定細(xì)胞上的兔抗CAT抗體的IFA和通過利用電穿孔細(xì)胞裂解物和可商購CAT ELISA試劑盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)對CAT表達(dá)進行檢測。
在位于pERK載體中的特有EcoRV位點上將隨機DNA片段克隆于EMCV IRES序列和VEE亞基因組啟動子之間。在26S啟動子和EMCV IRES之間克隆的小DNA片段來自AluI限制酶消化的pCDNA3.1 pCDNA3.1(-)DNA。AluI限制酶在pCDNA3.1(-)DNA內(nèi)頻繁地切割，產(chǎn)生大小706bp到6bp的鈍末端片段。將Alul消化的pCDNA3.1(-)片段連接入EcoRV線性化的pERK/EMCV/CAT、pERK/反EMCV/CAT和pERK/ΔAvr/CAT DNAs中。對單個克隆進行測序以測定什么間隔區(qū)片段已經(jīng)克隆入每個新的載體中。對單個克隆進行測序以測定什么間隔區(qū)片段已經(jīng)克隆入每個新的載體中。由于多個片段連接入這些復(fù)制子的間隔區(qū)，一些在載體中發(fā)現(xiàn)的間隔區(qū)片段的大小比pCDNA3.1(-)Alul片段還大。對每個間隔區(qū)-IRES復(fù)制子進行轉(zhuǎn)錄并如上所述將RNA電穿孔入Vero細(xì)胞中。通過CAT ELISA監(jiān)測CAT蛋白表達(dá)并將結(jié)果總結(jié)于表6中。
表6.由包含EMCV-IRES的復(fù)制子分析CAT表達(dá)
與沒有間隔區(qū)片段的類似載體相比，結(jié)果表明由包含間隔區(qū)片段的pERK/IRES/CAT復(fù)制子進行的CAT表達(dá)強烈并由IRES所指導(dǎo)(大約4-7ngCAT/μg總蛋白)。當(dāng)在26S啟動子和EMCV IRES序列之間導(dǎo)入大于大約200核苷酸的間隔區(qū)片段時，發(fā)生最高水平的基因表達(dá)。
2.由單個復(fù)制子進行的多個NOI表達(dá)在Vero細(xì)胞中進行pERK-BoNT A/B MCS2復(fù)制子的表達(dá)和包裝。如上所述對加帽的pERK-BoNTA/B復(fù)制子RNA進行轉(zhuǎn)錄和純化。用30μg復(fù)制子RNA、30μg殼體輔助RNA和30μg糖蛋白輔助RNA對Vero細(xì)胞(1×108細(xì)胞)進行電穿孔。在收獲VRP以前利用馬抗BoNT A和BoNT B抗體(Perimmune，Rockville，MD)通過IFA電穿孔單元分析電穿孔細(xì)胞。IFA的結(jié)果和產(chǎn)生VRP的滴定的結(jié)果顯示于表7中。
表7
3.HIV gp160表達(dá)對pERK/EMCV/gp160 167復(fù)制子(實施例2D)分析gp160基因的表達(dá)和VRP的產(chǎn)生。如上所述對于復(fù)制子、GP輔助劑和殼體輔助劑制備純化的RNA。電穿孔20-24小時后收集用RNAs和VRP電穿孔的vero細(xì)胞。IFA和VRP滴定的結(jié)果總結(jié)于表8中。為了進行比較，還對直接由26S啟動子表達(dá)gp160的pERK復(fù)制子進行評估。
表8.
4.由S.A.AR86復(fù)制子進行的HIV GAG表達(dá)利用SP6 RiboMax試劑盒(Promega Corporation；Madison，WI；Cat No.P1280)體外轉(zhuǎn)錄pRep89/EMCV/gag 342DNA，以生成加帽的復(fù)制子DNA。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書利用RNeasy純化柱(QiagenCorporation，Germantown，MD)對RNA進行純化。用30μgRep89/EMCV/gag 342RNA對Vero細(xì)胞(1×108細(xì)胞)進行電穿孔并隨后在電穿孔后約18小時分析Ga g蛋白表達(dá)。對Gag蛋白表達(dá)來說，Rep89/EMCV/gag 342電穿孔細(xì)胞的抗Gag IFA分析是陽性的。
B.EV71-MS IRES復(fù)制子表達(dá)在Vero細(xì)胞中進行來自每個包含EV71-MS的復(fù)制子的CAT蛋白的表達(dá)。對加帽復(fù)制子RNA進行轉(zhuǎn)錄并如上所述進行純化。用30μg復(fù)制子RNA對Vero細(xì)胞(2-3×107細(xì)胞)進行電轉(zhuǎn)化。通過利用抗CAT(Cortex Biochem，San Leandro，CA)和抗VEE nsp2抗體(AlphaVax)的IFA在電穿孔后大約18小時對電穿孔細(xì)胞進行分析。此外，如上所述通過ELISA監(jiān)測CAT表達(dá)。將IFA和比較由pERK/EMCV/CAT 342和pERK/MS/CAT 342復(fù)制子檢測的活性的CATELISA的結(jié)果顯示于表9中。
表9.
實施例4.用不同的間隔區(qū)進行的IRES-指導(dǎo)的翻譯A.復(fù)制子構(gòu)建體1.包含EMCV IRES的構(gòu)建體制備編碼EMCV或反義EMCV IRES序列的復(fù)制子構(gòu)建體配對，其包含嚴(yán)格相同的間隔區(qū)。這些比較表明只有有義方向上的EMCV IRES序列(即在5′-3′方向，其中在病毒中發(fā)現(xiàn)所述序列)指導(dǎo)不依賴于帽的翻譯；即在IRES為反義方向時發(fā)生極少的翻譯，提示適當(dāng)定位的IRES元件是在這些構(gòu)建體中獲得顯著CAT表達(dá)所必需的。如上所述制備這些復(fù)制子構(gòu)建體。體外轉(zhuǎn)錄每種間隔區(qū)-IRES復(fù)制子并如上所述將30μg的各種純化RNA電穿孔入約1×107Vero細(xì)胞中。通過CAT ELISA監(jiān)測CAT蛋白表達(dá)并將結(jié)果總結(jié)于表10中。
表10.利用間隔區(qū)-EMCV或間隔區(qū)-反-EMCV IRES復(fù)制子進行的CAT表達(dá)的比較
*相對于有義方向IRES指導(dǎo)的構(gòu)建體，反義方向IRES構(gòu)建體中翻譯的減少％。
#相對于具有反義方向IRES元件的構(gòu)建體的翻譯，有義方向IRES元件的翻譯增加的倍數(shù)。
數(shù)據(jù)顯示當(dāng)復(fù)制子包含CAT基因上游的間隔區(qū)和反義EMCV IRES時，CAT蛋白表達(dá)大大減少了(大多數(shù)情況下＞95％)。另外，數(shù)據(jù)表明IRES指導(dǎo)的蛋白表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化NOI表達(dá)水平的能力。優(yōu)化是NOI特異性的，但是利用本文的教導(dǎo)，間隔區(qū)-IRES組合的鑒定對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是常規(guī)性的，所述間隔區(qū)-IRES組合對于任何給定的NOI都提供所需水平的表達(dá)。
2.源自5’非編碼區(qū)的間隔區(qū)的用途通過利用Cap5′F和3-1.1prl引物(表11)由pH500A/Vcap PCR擴增殼體序列而將一種pERK復(fù)制子進行工程改造以包含全長VEE殼體蛋白基因。將得到的PCR產(chǎn)物插入pERK的EcoRV和SphI限制性位點。利用定點突變AscIF和AscIR引物(表11)使用可商購的試劑盒(Stratagene)將″pERK/殼體″進一步改進以在殼體基因的3’端包含一種特有的AscI限制酶。隨后通過利用在nsP4基因內(nèi)退火的正向引物(13-82.2.16)和已經(jīng)改造為包含AscI限制酶位點的反向引物(表11)PCR擴增來自pERK/殼體的序列生成VEE殼體序列的相鄰截短片段。用ApaI和AscI或SwaI和AscI消化PCR產(chǎn)物并克隆回pERK/殼體中以生成pERK/Cap200，pERK/Cap400和pERK/Cap600。這些復(fù)制子保留來自殼體基因5’末端的增量的序列以作為介于26S啟動子和待插入的下游構(gòu)建體之間的“間隔區(qū)”而起作用。為了將EMCV/CAT盒導(dǎo)入上述各種pERK/Cap載體中，用AscI限制酶消化pCDNA3.3/EMCV/CAT DNA以釋放1303 bp的EMCV/CAT片段。隨后將AscI消化的EMCV/CAT片段連接入AscI線性化的pERK/Cap載體DNAs中，生成pERK/EMCV/CAT Cap 200，pERK/EMCV/CAT Cap 400和pERK/EMCV/CAT Cap600。
表11生成殼體間隔區(qū)復(fù)制子的引物
將這些包含VEE殼體基因5’區(qū)部分的復(fù)制子線性化，體外轉(zhuǎn)錄，電穿孔入Vero細(xì)胞中并通過IFA和ELISA分析CAT蛋白表達(dá)。通過利用CAT特異性抗體的IFA驗證CAT蛋白表達(dá)；不過，免疫熒光強度根據(jù)所用殼體基因間隔區(qū)的長度而變化。這些結(jié)果反映于CAT ELISA中(表12)。
表12由包含殼體基因間隔區(qū)的復(fù)制子進行的Cat蛋白表達(dá)
B.輔助構(gòu)建體1.包含EMCV IRES的構(gòu)建體構(gòu)建輔助構(gòu)建體，其能夠單個表達(dá)VEE糖蛋白基因(″GP″)或VEE殼體基因。開始，制成兩種空輔助構(gòu)建體骨架載體以促進包含殼體和GP輔助構(gòu)建體的間隔區(qū)-IRES的構(gòu)建。通過用ApaI和RsrII限制酶消化pERK載體以除去6989bp的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)來制成一種空輔助構(gòu)建體。在連接缺失了非結(jié)構(gòu)基因的pERK載體以產(chǎn)生pH500G之前用T4DNA聚合酶處理DNA以生成鈍末端。pH500G空輔助構(gòu)建體包含5’非編碼區(qū)(NCR)的大約500個核苷酸。通過用SwaI和RsrII限制酶消化pERK載體以除去6989bp的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)來制成第二種空輔助構(gòu)建體。在連接DNA以產(chǎn)生pH1500G之前用T4DNA聚合酶處理DNA以生成鈍末端。pH1500G空輔助構(gòu)建體包含5’NCR的大約1500個核苷酸，包括緊接26S啟動子上游的nsp4的另外540bp，其不存在于pH500G輔助構(gòu)建體中。制備空輔助構(gòu)建體，其在核苷酸3上編碼一個A而非一個G殘基(pH500A和pH1500A)。通過從殼體輔助構(gòu)建體(pH500A/Vcap)中亞克隆5′NCR區(qū)來制備這些載體，其在核苷酸3上包含一個A，代替pH500A和pH1500A中的同一區(qū)域。這通過用XbaI和SacI限制酶消化pH500A/Vcap，收集430bp的片段，并將它連接入XbaI和SacI消化的pH500A和pH1500A DNAs中，分別生成pH500Aand pH1500A而得以實現(xiàn)。
如上所述將殼體和GP基因作為BamHI和XbaI片段克隆入pCDNA3.3/EMCV和pKS-rep2/反-EMCV中。如上所述將EMCV/殼體，反-EMCV/capsid，EMCV/GP和反-EMCV/GP盒作為AscI片段克隆入pH500G，pH500A，pH1500G和pH1500A空輔助構(gòu)建體中。在起始進一步的實驗之前對每種輔助構(gòu)建體的序列進行確認(rèn)。
如前所述將隨機間隔區(qū)片段在一個特有的EcoRV位點克隆于每種輔助構(gòu)建體中的26S啟動子和EMCV或反-EMCV IRES之間。對每種新的輔助構(gòu)建體測定插入間隔區(qū)片段的序列和長度，間隔區(qū)插入片段的長度包括于構(gòu)建體設(shè)計的末端。未對間隔區(qū)#15，16，和22作進一步特征鑒定。構(gòu)建體pH500A/EMCV/GP和pH500A/anti-EMCV/GP不包含間隔區(qū)。
2.利用包含EMCV IRES的GP和/或殼體輔助構(gòu)建體組合進行包裝和滴定利用多種GP和殼體輔助構(gòu)建體的組合包裝表達(dá)HIV-GAG蛋白的VEE復(fù)制子，pERK-342/EMCV/gag(見實施例7，介紹這種復(fù)制子的構(gòu)建)。對于表13中所給出的結(jié)果，在0.8ml電穿孔皿中，利用580V和25μF上的4次脈沖，將30μg的各種RNA輔助構(gòu)建體和30μg的復(fù)制子RNA共電穿孔入Vero細(xì)胞中，并讓細(xì)胞在室溫恢復(fù)10分鐘。將電穿孔的細(xì)胞接種入含有50ml具有抗生素的EMEM(10％FBS)T-175燒瓶中并于37℃孵育。20-24小時后，通過利用免疫熒光測試(IFA)測量GAG蛋白表達(dá)收集VEE復(fù)制子顆粒(″VRPs″)并滴定于96孔板中的Vero細(xì)胞上。為了比較的目的，基于″IU/ml″表示來自每次電轉(zhuǎn)化的VRP產(chǎn)量(表)。
表13.
在其它實驗中，GP輔助構(gòu)建體RNA的量于電穿孔環(huán)境變化；所有其它的VRP生產(chǎn)條件都如上所述。結(jié)果示于表14中。
表14.
3.沒有間隔區(qū)的26S-IRES GP輔助構(gòu)建體進行這一實驗來看間隔區(qū)是否為GP輔助構(gòu)建體中必需的以將轉(zhuǎn)錄與翻譯分開。用下列每種混合物單獨對Vero細(xì)胞進行電穿孔a.Gag復(fù)制子載體(見實施例6)+pH500A/反-EMCV/GP+pH500A/反-EMCV/Vcap 291b.Gag復(fù)制子載體+pH500A/EMCV/GP+pH500A/EMCV/Vcap 291如前所述孵育細(xì)胞以進行VRP生產(chǎn)，收集VRPs并通過IFA滴定于VERO細(xì)胞上。對于具有有義方向的IRES的輔助構(gòu)建體來說(″b.″混合物)，VRP產(chǎn)量為3.3 e6；而對于以反義方向放置IRES的輔助構(gòu)建體來說，VRP產(chǎn)量為5.3 e2。
4.包含XIAP IRES的VEE輔助構(gòu)建體的生產(chǎn)和應(yīng)用利用PFU pol(Stratagene；LaJolla，CA)和Cap5′F或13-87prl正向引物和3-1.lprl反向引物(表2，見實施例1B)分別由pH500A/Vcap和pH500A/GP PCR擴增VEE殼體(″VCap″)和糖蛋白(″VGP″)基因。將得到的PCR產(chǎn)物克隆入pKS-rep2的EcoRV和Sphl位點。這一策略XIAP基因野生型起點處的VEE結(jié)構(gòu)蛋白起始密碼子。通過自動DNA測序證實每個質(zhì)粒中的VEE結(jié)構(gòu)蛋白序列，并將得到的質(zhì)粒用于體外轉(zhuǎn)錄。利用Qiagen RNeasy柱純化RNA并電穿孔入Vero細(xì)胞用于分析蛋白表達(dá)和包裝。如由IFA所測定的所有的輔助構(gòu)建體都表達(dá)VEE殼體或糖蛋白，對于表達(dá)HIV GAG蛋白的VEE復(fù)制子所回收的滴度為總共1×105到1×107。
還將上述XIAP1007-VEE結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)建體克隆入第二輔助質(zhì)粒pH1500A中，作為ApaI/SphI DNA片段，生成pH1500A/XIAP/Vcap1007和pH1500A/XIAP/GP 1007。這些質(zhì)粒被用于制備RNA并如上電穿孔入Vero細(xì)胞以分析蛋白表達(dá)和VRP包裝。再一次，如由IFA所測定的，得到的輔助構(gòu)建體既表達(dá)VEE殼體也表達(dá)糖蛋白，滴度為1×108到超過1×109總VRP，表明由來自26S啟動子的亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄的所得。
實施例5.
對于由Vero細(xì)胞收集的全部細(xì)胞RNA進行RNA印跡分析，將復(fù)制子RNAs電穿孔入所述Vero細(xì)胞中。如上所述，體外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)-IRES復(fù)制子構(gòu)建體并將30μg的Rneasy柱純化的RNA電穿孔入大約1×107Vero細(xì)胞中。將電穿孔細(xì)胞重懸于10ml的DMEM培養(yǎng)基中，隨后將7ml(大約7×106細(xì)胞)接種入一只25cm2的燒瓶中。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書利用RNAwiz提取試劑盒(Ambion)在電穿孔16小時后從細(xì)胞中收集總細(xì)胞RNA。對RNAs進行量化并在通過被動轉(zhuǎn)移而轉(zhuǎn)移到Brightstar-Plus膜(Ambion)之前將每種10μg在1％乙二醛瓊脂糖凝膠上跑電泳。將RNAs紫外線交聯(lián)到膜上，于45℃用UltraHyb(Ambion)溶液封閉1小時，并于45℃用包含特異于VEE亞基因組RNA 3′UTR(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)的生物標(biāo)記的反義引物(3′UTR4X生物素，表1)進行探針雜交。在過夜雜交后根據(jù)生產(chǎn)商的說明書利用Brightstar Biodetect試劑盒(Ambion)通過化學(xué)發(fā)光RNA檢測處理印跡，并用EpiChemi IIDarkroom(UVP，Inc.，Upland，CA)進行顯影。將來自Vero細(xì)胞的RNA的RNA印跡分析結(jié)果顯示于表1中，所述Vero細(xì)胞用pERK/EMCV/CAT 257，pERK/反-EMCV/CAT 257，pERK/EMCV/CAT 579或pERK/反-EMCV/CAT579進行電穿孔。EMCV和反EMCV復(fù)制子構(gòu)建體都產(chǎn)生接近相同強度的亞基因組轉(zhuǎn)錄，提示來自間隔區(qū)-反-EMCV/CAT復(fù)制子構(gòu)建體的CAT蛋白表達(dá)的缺失并非歸因于亞基因組RNAs的任何實質(zhì)性減少。
實施例6.HIVgag基因IRES-指導(dǎo)的復(fù)制子載體的構(gòu)建如上所述，將HIV亞型C gag基因克隆入包含342 bp間隔區(qū)(pERK-342)的pERKIEMCV載體中。利用引物GAG-F和GAG-R(表1)由pERK/HIVgagDNA PCR擴增gag基因。將引物改造為包含BamHI限制性位點，從而使PCR產(chǎn)物于5’和3’編碼此位點。用BamHI限制酶消化PCR產(chǎn)物并連接入BamHI線性化的pCDNA3.3/EMCV DNA中。通過限制性分析測定gag基因的定向并選擇具有正確定向的基因的構(gòu)建體，生成pCDNA3.3/EMCV/gag。用AscI限制酶由pCDNA3.3/EMCV/gagDNA消化EMCV/gag基因盒并連接入AscI線性化的pERK-342 DNA中。通過限制性分析測定EMCV/gag基因盒的定向并選擇具有正確定向的基因的構(gòu)建體，生成pERK-342/EMCV/gag。在起始進一步的實驗之前確證EMCV/gag區(qū)的序列。
通過IFA和蛋白質(zhì)印跡的gag蛋白表達(dá)分析提示，在pERK-342/EMCV/gag復(fù)制子中的IRES指導(dǎo)下表達(dá)的蛋白質(zhì)與由pERK/HIVgag復(fù)制子表達(dá)的蛋白質(zhì)沒有區(qū)別，在所述pERK/HIVgag復(fù)制子中翻譯和轉(zhuǎn)錄都由26S VEE亞基因組啟動子指導(dǎo)。此外，與26S啟動子指導(dǎo)的系統(tǒng)相比，如通過滴定VRP測量的表達(dá)水平對于IRES指導(dǎo)的系統(tǒng)來說得到了提高(表15)。
表15.用不同復(fù)制子載體生成的VRP滴度的比較
實施例7.用IRES指導(dǎo)的HIVgag復(fù)制子顆粒孵育的小鼠中的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答當(dāng)向動物體內(nèi)進行疫苗接種時，pERK/EMCV/gag 342復(fù)制子引發(fā)強烈的體液和細(xì)胞應(yīng)答。從Charles River獲得四到五周大的雌性BALB/c小鼠并在任何操作之前適應(yīng)一周。對于激發(fā)和加強，在異氟烷麻醉下用5×105IFU靶劑量的VRP在兩只后爪墊中對小鼠組進行接種，所述VRP是在包含具有1％v/v人血清白蛋白和5％w/v蔗糖的PBS的稀釋液中。通過用30.5G針頭和0.100mL Hamilton注射器注射20μL于每只后爪墊中進行爪墊注射。在第0天(即放血)，第21天(開始接種20天后)和第29天(加強7天后)的每一次接種之前于異氟烷麻醉下通過后眼窩取血獲得血清樣品。將疫苗接種程序總結(jié)于表16中。在加強后14天收集脾進行IFN-γELISPOT分析。
表16.IRES指導(dǎo)的復(fù)制子VRP接種程序
1GMP生產(chǎn)的Gag VRP，用未修飾的pERK復(fù)制子載體制備。
2342指IRES/Gag盒上游的間隔區(qū)中的核苷酸數(shù)目。
3對照VRP，由表達(dá)HIV Pol/Nef基因的復(fù)制子組成。
4sc-fp指皮下爪墊。
疫苗接種后進行的免疫測試Gag ELISA將來自HIV-1亞型C分離株DU-422的純化重組組氨酸標(biāo)記(his)-p 55用作抗原包被。通過標(biāo)準(zhǔn)的間接ELISA對血清評估Gag特異性抗體的存在。
Gag ELISPOT測試將從脾中收集的存活淋巴細(xì)胞接種入Multiscreen Immobilon-P ELISPOT板(ELISPOT certified 96-well filtration plate，Millipore，Bedford，MA)中的單個ELISPOTassay孔內(nèi)，并溫育16-20小時，所述MultiscreenImmobilon-P ELISPOT板已經(jīng)用抗IFN-γ單克隆抗體AN18(大鼠IgG1，MabTech，Mariemont，OH)進行預(yù)涂布。通過用緩沖液多次洗滌移除細(xì)胞并用生物素標(biāo)記的抗IFN-γ單克隆抗體R4-6A2(大鼠IgGI，MabTech)對孔進行溫育，隨后進行洗滌并用抗生物素蛋白-過氧化物酶-復(fù)合物(Vectastain ABC Peroxidase Kit，Vector Laboratories，Burlingame，CA)進行溫育。為了形成復(fù)合物，至少在結(jié)束溫育期30分鐘前用二抗制備抗生物素蛋白-過氧化物酶-復(fù)合物并保存于室溫。溫育后，洗滌細(xì)胞并于室溫和底物(AEC片劑，Sigma)一起溫育4分鐘以促進斑點形成，其代表培養(yǎng)過程中單個IFN-γ分泌細(xì)胞的位置。通過蒸餾水漂洗停止斑點顯影。
為了清點來自用HIVgagVRP免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞中Gag-特異性IFN-γ分泌細(xì)胞，用免疫顯性CD8+CTLH-2Kd-限制性HIV-Gag肽AMQMLKETI或不相關(guān)的結(jié)合I類MHC的HA(流感紅血球凝集素)CD8+CTLH-2Kdd-限制性肽IYSTVASSL刺激淋巴細(xì)胞，持續(xù)16-20小時(5％CO2于37℃)。細(xì)胞minus肽作為背景對照而起作用。作為陽性對照，用4μg/mL的Conconavalin A刺激細(xì)胞持續(xù)相似的時期。合成具有游離末端的肽并通過New England Peptide純化至＞90％。
HIVgagVRP效價滴定將HIVgagVRP感染的Vero細(xì)胞的Gag-特異性IFA用于測量效價或疫苗的感染性滴度。將效價測量為感染單位/mL，IFU/mL。在每次注射的當(dāng)天將殘余的疫苗進行回復(fù)滴定以測量每只動物所接受的實際劑量(表17)。
表17.Gag ELISA和ELISPOT結(jié)果的總結(jié)
1SFC/1e6淋巴細(xì)胞指形成斑點的細(xì)胞/1×106淋巴細(xì)胞2GMT，幾何平均滴度如通過抗Gag抗體ELISA和Gag特異性ELISPOT測試所測量的，疫苗接種研究的結(jié)果顯示342/EMCV/gag VRP接種的動物呈現(xiàn)強烈的對HIV-Gag的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
實施例8.
將幾種昆蟲病毒IRES序列的活性與多種昆蟲細(xì)胞系中的哺乳類病毒IRES(EMCV)活性相比較。對復(fù)制子載體進行設(shè)計從而使26S亞基因組轉(zhuǎn)錄為雙順反。26S亞基因組RNA被加帽，意即雙順反RNA(氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶(CAT))上的第一個基因是帽依賴性的，而第二個基因(熒光素酶(LUC))依賴于IRES序列(不依賴于帽的)。將基于辛德比斯病毒的復(fù)制子載體改造為包含下列元件5′NCR，nsp1，2，3，4，26S啟動子，CAT基因，IRES，LUC基因，NCR3′。將兩種昆蟲病毒IRES序列，一種源自豌豆蚜蟲(Acyrthosiphon pisum)病毒，另一種源自小米蚜(Rhopalosiphum padi)病毒(RXPV)，改造于CAT和LUC基因之間。為了進行比較，將在CAT和LUC基因之間將哺乳動物病毒IRES(EMCV)改造入相同的辛德比斯復(fù)制子載體。利用SP6RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄每個復(fù)制子構(gòu)建體的RNA和編碼所有辛德比斯結(jié)構(gòu)蛋白基因(殼體-E3-E2-6K-E1)的RNA輔助構(gòu)建體。通過將輔助RNA和每種雙順反復(fù)制子RNAs電穿孔入8×106BHK-21細(xì)胞來制備辛德比斯復(fù)制子顆粒。收集培養(yǎng)基，澄清，并通過離心過20％蔗糖墊層(于4℃24,000RPM 3小時)純化復(fù)制子顆粒。利用兔抗CAT抗體(CortexBiochem，San Leandro，CA)滴定復(fù)制子顆粒。
為了測定與EMCV IRES相比昆蟲病毒IRES序列的活性，利用純化的辛德比斯復(fù)制子雙順反顆粒感染多個生長于培養(yǎng)基中的不同昆蟲細(xì)胞。用于這些實驗中的昆蟲細(xì)胞為Toxorhynchites amboinensis，白足按蚊(Anopheles albimanus)，岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)，和白紋伊蚊(Aedes albopictus)。用復(fù)制子雙順反顆粒于0.1MOI中感染昆蟲細(xì)胞。感染大約16小時后制備細(xì)胞裂解物并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書利用CAT ELISA試劑盒(Roche，Indianapolis IN)測定存在于裂解物中的CAT蛋白量。同時，利用熒光素酶測試試劑盒(Roche)測定存在于裂解物中的LUC蛋白量。對于每種測試中所用的蛋白質(zhì)的量將每種裂解物中檢測的CAT和LUC量標(biāo)準(zhǔn)化以便兩種值的比較(表17)。無論所用的復(fù)制子是什么，在每種細(xì)胞類型中檢測的CAT蛋白是相似的。這一數(shù)據(jù)提示三種包含IRES的復(fù)制子顆粒每種都在一個細(xì)胞類型內(nèi)取得相似的感染效力，并且因而在每種細(xì)胞類型中檢測到的LUC活性都直接反映在該細(xì)胞類型中IRES序列的活性。在每種所分析的昆蟲細(xì)胞類型中，昆蟲-病毒IRES比EMCV IRES具有更多活性(85-95％多)(表17)。
表17.昆蟲病毒IRES(APV或RhPV)活性與哺乳動物病毒IRES(EMCV)活性在不同昆蟲細(xì)胞類型中的比較
實施例9.在靈長類中對于IRES復(fù)制子的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答在Southern Research Institute in Frederick，MD.，也在獼猴中對于包含VRPs(實施例6)的pERK/EMCV/gag 342的免疫原性進行了研究。通過皮下和肌內(nèi)注射(三只動物/途徑)將每種疫苗都向六只動物給藥。動物在0和1月接受兩次1×108疫苗顆粒的接種。在第二次接種4周后對體液免疫應(yīng)答進行分析(如實施例7中所述)，并在表18中給出。為了進行比較，還對直接由26S啟動子(pERK/gag)表達(dá)gag蛋白的VEE復(fù)制子進行評估。
表18.
盡管已經(jīng)參考某些實施方案中的具體細(xì)節(jié)介紹了本方法，但并不意味著這些細(xì)節(jié)應(yīng)被視為對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍包括在所附權(quán)利要求中。
在整個本申請中，參考多個專利、專利公開物，期刊公開物和其它公開物。將這些公開物的全部內(nèi)容并入本申請作為參考以便更加充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)，并對本申請的這些參考文獻(xiàn)所出現(xiàn)句子的主題提供書面描述。
權(quán)利要求
1.一種重組復(fù)制子核酸，其包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列；至少一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列；至少一個甲病毒亞基因組啟動子；至少一個IRES元件；至少一個異源核酸；和編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中所述第二核酸是一種編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1，nsp2，nsp3和nsp4的連續(xù)核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1的核酸，包含一種起始第二核酸序列，它是編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1，nsp2，和nsp3的連續(xù)核苷酸序列，并且進一步包含另一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp4的第二核酸，它與起始第二核酸序列不連續(xù)。
4.權(quán)利要求1的核酸，其中所述IRES元件選自細(xì)胞IRESs，植物IRESs，哺乳動物病毒IRESs，合成IRESs和昆蟲病毒IRESs。
5.權(quán)利要求1的核酸，其中所述甲病毒亞基因組啟動子是一種最小的或修飾的甲病毒亞基因組啟動子。
6.權(quán)利要求1的核酸，其中所述異源核酸編碼一種蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1的核酸，其中所述異源核酸為反義序列。
8.權(quán)利要求1的核酸，其中所述異源核酸編碼一種核酶。
9.權(quán)利要求1的核酸，其中所述異源核酸編碼一種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
10.權(quán)利要求9的核酸，其中所述甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白來自選自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，羅斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
11.權(quán)利要求1的核酸，其中所述編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列來自選自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，羅斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
12.權(quán)利要求1的核酸，其中所述編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列來自選自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，羅斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
13.權(quán)利要求1的核酸，其中所述甲病毒亞基因組啟動子來自選自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，羅斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
14.權(quán)利要求1的核酸，其中所述編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸來自選自辛德比斯病毒、SFV、VEE、S.A.AR86病毒，羅斯河病毒，EEE和WEE的甲病毒。
15.權(quán)利要求1的核酸，其中所述IRES元件指導(dǎo)由異源核酸編碼的基因產(chǎn)物的翻譯，從而至少80％的由異源核酸編碼的基因產(chǎn)物的翻譯由IRES元件的活性控制。
16.權(quán)利要求1的核酸，其中所述IRES元件指導(dǎo)由異源核酸編碼的基因產(chǎn)物的翻譯，從而至少10％的由異源核酸編碼的基因產(chǎn)物的翻譯由IRES元件的活性控制。
17.權(quán)利要求1的核酸，其中所述核酸為RNA。
18.權(quán)利要求1的核酸，其中所述核酸為DNA。
19.權(quán)利要求1的核酸，進一步包含位于IRES元件上游的間隔區(qū)核酸序列。
20.權(quán)利要求19的核酸，其中所述間隔區(qū)核酸序列長度為至少30個核苷酸。
21.權(quán)利要求19的核酸，其中所述間隔區(qū)核酸序列長度為25至7500個核苷酸。
22.權(quán)利要求19的核酸，其中所述間隔區(qū)核酸序列長度為150至1000個核苷酸。
23.傳染性的有缺陷的甲病毒顆粒群體，其中每個顆粒都包含權(quán)利要求1的核酸，并且如通過細(xì)胞培養(yǎng)物傳代所測量的，所述群體沒有可檢測到的可復(fù)制病毒。
24.傳染性的有缺陷的甲病毒顆粒群體，其中每個顆粒都包含權(quán)利要求19的核酸，并且如通過細(xì)胞培養(yǎng)物傳代所測量的，所述群體沒有可檢測到的可復(fù)制病毒。
25.一種藥物組合物，其在一種可藥用的載體中包含權(quán)利要求23的群體。
26.一種藥物組合物，其在一種可藥用的載體中包含權(quán)利要求24的群體。
27.一種甲病毒顆粒，其包含權(quán)利要求1的重組核酸。
28.一種甲病毒顆粒，其包含權(quán)利要求19的重組核酸。
29.權(quán)利要求27的甲病毒顆粒，包含一種減毒突變。
30.權(quán)利要求29的甲病毒顆粒，包含一種減毒突變。
31.權(quán)利要求1的核酸，包含一種減毒突變。
32.權(quán)利要求19的核酸，包含一種減毒突變。
33.傳染性的有缺陷的甲病毒顆粒群體，其中每個顆粒都包含權(quán)利要求1的核酸。
34.傳染性的有缺陷的甲病毒顆粒群體，其中每個顆粒都包含權(quán)利要求19的核酸。
35.一種組合物，其在一種可藥用的載體中包含權(quán)利要求32的群體。
36.一種組合物，其在一種可藥用的載體中包含權(quán)利要求33的群體。
37.一種制備傳染性的有缺陷的甲病毒顆粒的方法，包括(a)將下列成分導(dǎo)入細(xì)胞中(i)權(quán)利要求1的重組核酸；和(ii)編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的一種或多種輔助核酸；其中一種或多種輔助核酸產(chǎn)生所有的甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白；和(b)在細(xì)胞中生產(chǎn)所述甲病毒顆粒。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述重組核酸包含至少一種編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的異源核酸。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述輔助核酸是一種重組核酸，其包含5’甲病毒復(fù)制識別序列，甲病毒亞基因組啟動子，編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述輔助核酸是一種重組核酸，其包含一個啟動子和編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述輔助核酸為DNA。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述啟動子為CMV啟動子。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述輔助核酸包含編碼全部甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。
43.權(quán)利要求36的方法，其中所述輔助核酸是一種重組核酸，其包含5’甲病毒復(fù)制識別序列，IRES元件，編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列。
44.權(quán)利要求36的方法，其中所述輔助核酸是一種重組核酸，其包含5’甲病毒復(fù)制識別序列，甲病毒亞基因組啟動子，IRES元件，編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列。
45.一種制備傳染性的有缺陷的甲病毒顆粒的方法，包括(a)將下列成分導(dǎo)入細(xì)胞中(i)一種甲病毒復(fù)制子RNA，其包含5’甲病毒復(fù)制識別序列，編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列，甲病毒亞基因組啟動子，異源核酸序列和3’甲病毒復(fù)制識別序列；和(ii)編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的一種或多種輔助核酸，所述輔助核酸包含5’甲病毒復(fù)制識別序列，甲病毒亞基因組啟動子，IRES元件，編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列，由此在細(xì)胞中生產(chǎn)所有的甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白；和(b)在細(xì)胞中生產(chǎn)所述甲病毒顆粒。
46.一種制備傳染性的有缺陷的甲病毒顆粒的方法，包括(a)將下列成分導(dǎo)入細(xì)胞中(i)一種甲病毒復(fù)制子RNA，其包含5’甲病毒復(fù)制識別序列，編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列，至少一個甲病毒亞基因組啟動子，至少一個IRES元件，至少一個異源核酸序列和3’甲病毒復(fù)制識別序列；和(ii)編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的一種或多種輔助核酸，所述輔助核酸包含5’甲病毒復(fù)制識別序列，甲病毒亞基因組啟動子，IRES元件，編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列，由此在細(xì)胞中生產(chǎn)所有的甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白；和(b)在細(xì)胞中生產(chǎn)所述甲病毒顆粒。
47.一種重組核酸，其包含5’甲病毒復(fù)制識別序列，甲病毒亞基因組啟動子，IRES元件，編碼一種或多種甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸和3’甲病毒復(fù)制識別序列。
48.包含權(quán)利要求47的核酸的細(xì)胞。
49.權(quán)利要求1的核酸，進一步包含甲病毒包裝信號。
50.權(quán)利要求1的核酸，進一步包含IRES元件上游的間隔區(qū)核酸序列。
51.權(quán)利要求47的核酸，進一步包含IRES元件上游的間隔區(qū)核酸序列。
52.一種在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用免疫原量的權(quán)利要求23的群體。
53.一種在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用免疫原量的權(quán)利要求24的群體。
54.一種在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用免疫原量的權(quán)利要求33的群體。
55.一種在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者施用免疫原量的權(quán)利要求34的群體。
56.一種重組核酸，其包含指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的啟動子；I RES元件；和編碼序列，其中將所述I RES元件可操作性地進行定位，從而編碼序列的翻譯是通過由IRES元件指導(dǎo)的不依賴于帽的機制。
57.一種重組核酸，其包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列；至少一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列；第一個甲病毒亞基因組啟動子；第一個IRES元件；第一個異源核酸；第二個甲病毒亞基因組啟動子；第二個IRES元件；編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸。
58.權(quán)利要求57的核酸，進一步包含甲病毒包裝信號。
59.權(quán)利要求57的核酸，進一步包含IRES元件上游的間隔區(qū)核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種重組核酸，其包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸序列；至少一個編碼甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸序列；至少一個甲病毒亞基因組啟動子；至少一個IRES元件；至少一個異源核酸；和編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸。另外提供制備包含本發(fā)明重組核酸的甲病毒顆粒的方法以及利用本發(fā)明的組合物的方法。還提供一種重組輔助核酸，其包含編碼5’甲病毒復(fù)制識別序列的第一核酸；甲病毒亞基因組啟動子；IRES元件；編碼甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的第二核酸，以及編碼3’甲病毒復(fù)制識別序列的第三核酸。
文檔編號C07K14/18GK1791678SQ200480013928
公開日2006年6月21日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者J·F·史密斯, K·坎魯?shù)? J·O·雷納 申請人:阿爾法瓦克斯公司