用于病毒生產(chǎn)的細胞系和使用方法
【專利說明】用于病毒生產(chǎn)的細胞系和使用方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年2月5日提交的美國臨時申請序列號61/760, 895和2013年 10月1日提交的序列號61/885, 357的權(quán)益，每份申請通過引用結(jié)合在此。
[0003] 政府資助
[0004]本發(fā)明是在聯(lián)邦預(yù)算線5614A11101 "新發(fā)性傳染病"下由政府支持進行的。政府 具有本發(fā)明中一定的權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及用于增強病毒生產(chǎn)的組合物和方法。具體而言，這些組合物可以包括 基因（基因靶標(biāo)）、所述基因靶標(biāo)的效應(yīng)物、以及其中基因靶標(biāo)已被改變來增強病毒生產(chǎn)的 細胞系和細胞裂解物。
[0006] 背景
[0007] 疫苗是用來預(yù)防人類疾病的主要策略之一。當(dāng)前，2種以上疫苗可用于對抗由病 毒傳染引起的疾?。ɡ?，水痘、乙型肝炎、麻疹、脊髓灰質(zhì)炎）和細菌傳染引起的疾?。ɡ?如，霍亂、破傷風(fēng)、傷寒、白喉）。類似地，疫苗用來預(yù)防家畜的許多疾患，這些家畜包括但不 限于：家禽、馬、豬、以及其他動物。
[0008] 雖然若干疫苗（包括流感疫苗）仍然是產(chǎn)生于受精雞卵（家雞（Gallusgallus domesticus))中，但更多數(shù)量的疫苗是產(chǎn)生于細胞培養(yǎng)物中。在一種情況下，充分表征的細 胞系（例如，維洛細胞（VeroCell))首先感染活病毒或活的減毒病毒。隨后，含有子代病 毒顆粒的上清液被收集和加工來產(chǎn)生之后可以分配到種群中的高度免疫原性劑量的疫苗。
[0009] 盡管疫苗被證明是成功的，但根除或控制疾病爆發(fā)的能力因疫苗生產(chǎn)的成本和制 造局限而重復(fù)受到挑戰(zhàn)。脊髓灰質(zhì)炎疫苗對此作出了最佳說明。脊髓灰質(zhì)炎病毒是一種人 腸道病毒并且是脊髓灰質(zhì)炎的病原體，這種神經(jīng)變性劑的糞-口傳播會導(dǎo)致急性麻痹。此 時，疫苗被產(chǎn)生來限制脊髓灰質(zhì)炎的傳播，并且包括高效（且明顯更為昂貴）的滅活脊髓灰 質(zhì)炎疫苗（IPV)以及效力略低（且更為經(jīng)濟）的口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗（OPV)。出于有關(guān)減 毒的OPV病毒顆粒會回復(fù)到高度傳染性的神經(jīng)毒性脊髓灰質(zhì)炎病毒的技術(shù)原因，成功根除 脊髓灰質(zhì)炎將借助于開發(fā)顯著降低IPV制造成本的新技術(shù)。
[0010] 發(fā)明既述
[0011] 在此提供了可以由脊髓灰質(zhì)炎疫苗制造廠家使用來顯著降低OPV和IPV疫苗的生 產(chǎn)成本的一批基因、試劑以及細胞系。本發(fā)明提供調(diào)節(jié)（下調(diào)或過表達）時增強脊髓灰質(zhì)炎 病毒復(fù)制的一列宿主基因（蛋白編碼基因和非編碼RNA)。因此，鑒別的基因可以被調(diào)節(jié)來 提高脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗生產(chǎn)。另外，諸位發(fā)明人描述了可以被產(chǎn)生來增強脊髓灰質(zhì)炎病 毒生產(chǎn)的一系列細胞系。以上全部可以單獨或組合使用來增強用來對抗脊髓灰質(zhì)炎以及其 他微小核糖核酸病毒感染的疫苗的生產(chǎn)。最后，諸位發(fā)明人描述了可以通過多種手段（例 如，siRNA、miRNA、小分子）調(diào)節(jié)來限制脊髓灰質(zhì)炎病毒生產(chǎn)的一系列基因。
[0012] 在此提供了工程化的細胞系。在一個實施例中，該工程化細胞系的細胞具有選 自表I的與一種對照細胞系相比一個編碼區(qū)的降低的表達，其中該編碼區(qū)選自ZNF205、CNTD2、SEC61G、ETS1、TAF1L、MCCD1、LY6G6C、BTN2A1、GLXP3、GCGR、EP300。在一個實施例 中，該工程化細胞系的細胞具有選自表I的與一種對照細胞系相比一個編碼區(qū)的降低的表 達。與該對照細胞系相比，該降低可以是至少5%。表達的降低可以通過測量細胞中由該編 碼區(qū)編碼的多肽或mRNA的量來確定。在一個實施例中，這些細胞在該編碼區(qū)中或可操作地 連接到該編碼區(qū)上的一個調(diào)節(jié)區(qū)中包括一個突變。在一個實施例中，這些細胞包括降低該 編碼區(qū)的表達的一種外源多核苷酸。該外源多核苷酸可以是RNA多核苷酸如siRNA、shRNA、 或反義多核苷酸。在一個實施例中，這些細胞包括導(dǎo)致降低的表達的一個編輯基因組。例 如，該基因組可以由鋅指核酸酶、大范圍核酸酶或轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物編輯。
[0013] 在一個實施例中，這些細胞進一步包括選自表I的至少一個另外的編碼區(qū)的降 低的表達，與一種對照細胞系相比選自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、 miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9 的一 個miRNA的提高的表達，選自表IV的一個miRNA的降低的表達，或它們的組合。在一個實 施例中，這些細胞包括選自表I的至少五個編碼區(qū)的降低的表達。在一個實施例中，這些 細胞進一步包括至少2個編碼區(qū)的一個組合的降低的表達，其中編碼區(qū)的這些組合選自表 VI。在一個實施例中，這些細胞包括選自表II的與一種對照細胞系相比一個編碼區(qū)的提高 的表達。在一個實施例中，這些細胞進一步包括選自表II的至少一個另外的編碼區(qū)的提 高的表達，與一種對照細胞系相比選自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、miR-513a-5p、 miR-519c-3p、miR-1270-2、miR-3187、miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9 的一個 miRNA的降低的表達，選自表IV的一個miRNA的降低的表達，或它們的組合。在一個實施例 中，這些細胞包括選自表II的至少五個編碼區(qū)的提高的表達。
[0014] 在一個實施例中，該工程化細胞系的細胞包括與一種對照細胞系相比選自 miR_520e、miR-1256、miR-520d_3p、miR-513a_5p、miR-519c_3p、miR-1270-2、miR-3187、 miR-5763p、miR-22、miR-520c-3p以及miR-9的一個miRNA的提高的表達。這些細胞可以 包括充當(dāng)這些miRNA之一的一種miRNA模擬物。在一個實施例中，這些細胞進一步包括至 少兩個miRNA的提尚的表達。
[0015] 在一個實施例中，該工程化細胞系的細胞包括選自表IV的與一種對照細胞系相 比一個內(nèi)源miRNA的降低的表達。在一個實施例中，這些細胞在編碼該miRNA的該編碼區(qū) 中或可操作地連接到該編碼區(qū)上的一個調(diào)節(jié)區(qū)中包括一個突變。在一個實施例中，這些細 胞包括抑制該內(nèi)源miRNA的活性的一種miRNA抑制劑。
[0016] -個工程化細胞系的細胞可以包括一種微小核糖核酸病毒。在一個實施例中，該 微小核糖核酸病毒是一種脊髓灰質(zhì)炎病毒如減毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒，例如，沙賓（Sabin) 1、 沙賓2、沙賓3。在一個實施例中，該脊髓灰質(zhì)炎病毒選自Mahoney、Brunhilde、MEF-1、 Saukett、或它們的組合。在一個實施例中，該細胞系的細胞包括兩種或三種脊髓灰質(zhì)炎病 毒。在一個實施例中，該脊髓灰質(zhì)炎病毒是腸道病毒71。
[0017] 該工程化細胞系可以是哺乳動物細胞系、禽類細胞系、或昆蟲細胞系。在一個實施 例中，該哺乳動物細胞系選自人細胞系、非人靈長動物細胞系、犬細胞系、或倉鼠細胞系。在 一個實施例中，該哺乳動物細胞系是ffip-2或VeroP。在一個實施例中，該禽類細胞系是雞 細胞系，或鴨細胞系。
[0018] 在此進一步提供了一種工程化細胞系的一種裂解物。
[0019] 在此提供了用于產(chǎn)生一種病毒的方法。在一個實施例中，該方法包括提供在此描 述的該工程化細胞系，其中該細胞系的細胞包括一種病毒；在適于通過這些細胞產(chǎn)生該病 毒的條件下孵育該工程化細胞系；任選地收獲由這些細胞產(chǎn)生的該病毒。在一個實施例 中，該方法包括提供一個細胞系，其中該細胞系的細胞包括一種病毒；在適于通過這些細胞 產(chǎn)生該病毒的條件下孵育該細胞系，其中培養(yǎng)基包括抑制選自表I的一個編碼區(qū)的表達的 一種RNA多核苷酸；并且任選地收獲由這些細胞產(chǎn)生的該病毒。在一個實施例中，該RNA 多核苷酸可以是一種siRNA，一種shRNA，或一種反義多核苷酸，選自miR-520e、miR-1256、 miR-520d_3p、miR-513a_5p、miR-519c_3p、miR-1270-2、miR-3187、miR_5763p、miR-22、 miR-520c-3p以及miR-9的一種miRNA，抑制選自表IV的一種miRNA的活性的一種mRNA抑 制劑，或它們的組合。
[0020] 在一個實施例中，該方法包括提供一個細胞系，其中該細胞系的細胞包括一種病 毒，并且其中這些細胞包括會導(dǎo)致選自表I的一個編碼區(qū)的降低的表達的一個編輯基因 組；在適于通過這些細胞產(chǎn)生該病毒的條件下孵育該細胞系；并且任選地收獲由這些細胞 產(chǎn)生的該病毒。在一個實施例中，該基因組是由鋅指核酸酶、大范圍核酸酶或轉(zhuǎn)錄激活因子 樣效應(yīng)物編輯。在一個實施例中，該方法包括提供一個細胞系，其中該細胞系的細胞包括一 種病毒；在適于通過這些細胞產(chǎn)生該病毒的條件下孵育該細胞系，其中培養(yǎng)基包括抑制選 自表I的一個編碼區(qū)的表達的一種小分子；并且任選地收獲由這些細胞產(chǎn)生的該病毒。
[0021] -種方法中所使用的細胞可以包括一種脊髓灰質(zhì)炎病毒。在一個實施例中，該微 小核糖核酸病毒是一種脊髓灰質(zhì)炎病毒如減毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒，例如，沙賓1、沙賓2、沙 賓3。在一個實施例中，該脊髓灰質(zhì)炎病毒選自]\&111〇1167、131'111111；[1(16、]\0^-1、33111^1:1:、或它 們的組合。在一個實施例中，所使用的這些細胞包括兩種或三種脊髓灰質(zhì)炎病毒。在一個 實施例中，該脊髓灰質(zhì)炎病毒是腸道病毒71。
[0022] -種方法中所使用的細胞可以是哺乳動物細胞系、禽類細胞系、或昆蟲細胞系。在 一個實施例中，該哺乳動物細胞系選自人細胞系、非人靈長動物細胞系、犬細胞系、或倉鼠 細胞系。在一個實施例中，該哺乳動物細胞系是ffip-2或VeroP。在一個實施例中，該禽類 細胞系是雞細胞系，或鴨細胞系。
[0023] 還提供了用于治療患有病毒感染、或處于患病毒感染的風(fēng)險中的受試者的方法。 在一個實施例中，該方法包括在受試者的細胞中提高選自表I的一個編碼區(qū)的表達。在 一個實施例中，該方法包括在受試者的細胞中抑制選自表II的一個編碼區(qū)的表達。在一 個實施例中，該方法包括在受試者的細胞中抑制選自miR-520e、miR-1256、miR-520d-3p、 miR-513a_5p、miR-519c_3p、miR-1270-2、miR-3187、miR_5763p、miR-22、miR-520c_3p以及 miR-9的一個內(nèi)源miRNA的表達。在一個實施例中，該方法包括在受試者的細胞中提高選自 表IV的一種miRNA的表達。
[0024] 術(shù)語"和/或"意指所列舉的要素的一個或所有或所列舉的要素的任何兩個或更 多個的組合。
[0025] 詞語"優(yōu)選的"和"優(yōu)選地"指代本發(fā)明的在某些情況下可以提供某些益處的實施 例。然而，在相同或其他環(huán)境下，其他實施例也可以是優(yōu)選的。此外，一個或多個優(yōu)選實施 例的敘述不意味著其他實施例是無用的，并且不意圖將其他實施例排除在本發(fā)明的范圍之 外。
[0026] 術(shù)語"包含"及其變體，在這些術(shù)語在本說明書和權(quán)利要求中出現(xiàn)的情況下，不具 有限制性含義。
[0027] 除非另外說明，"一個"、"一種"、"該"和"至少一個"可互換地使用并且意指一個或 多于一個。
[0028] 而且在此，通過端點敘述的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所包括的所有數(shù)值（例如，1至 5 包括 1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等）。
[0029] 對于在此所披露的包括不連續(xù)的步驟的任何方法來說，可以按任何可行的順序來 進行這些步驟。另外，在適當(dāng)時，可以同時進行兩個或更多個步驟的任何組合。
[0030] 圖和表的簡要說明
[0031] 圖1.初步基因組范圍內(nèi)siRNA篩選的結(jié)果圖示示出了使用一種脊髓灰質(zhì)炎病毒 特異性ELISA篩選> 18, 200個基因的結(jié)果。這些篩選中所使用的病毒是沙賓2。Y軸線提 供標(biāo)準化Z-評分。X軸線表示篩選的基因。
[0032] 圖2.CCHD5ffJi定結(jié)果。圖示示出了維洛細胞中的一批示例性單個基因的敲低如何 影響病毒滴度。Y軸線，標(biāo)準化為非靶向?qū)φ眨∟TC)的病毒滴度。這些篩選中所使用的病毒 是沙賓2。X軸線提供基因名稱。
[0033] 圖3.空斑測定結(jié)果。（A)圖提供了初步篩選中鑒別的靶基因的敲低如何提高總空 斑數(shù)（病毒滴度，即，病毒數(shù)）的實例。對照=非靶向?qū)φ誷iRNA。上清液的稀釋液的范圍 是從KT-4至KT-6。（B)圖示示出了初步ELISA篩選中鑒別的一批命中區(qū)域的結(jié)果。NTC =非靶向?qū)φ?。SiPoli0=靶向脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的siRNA。這些篩選中所使用的病 毒是沙賓2。
[0034] 圖4.抗原等效性研究結(jié)果。對在維洛細胞中產(chǎn)生的用靶向特異性基因的siRNA 未修飾或修飾的病毒進行抗原等效性研究。數(shù)值指示了中和來源于給定基因敲低的病毒的 感染性的一種標(biāo)準化人血清池的稀釋度。
[0035] 圖5. 1型和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒（沙賓株）結(jié)果。用靶向初步（沙賓2)篩選中 鑒別的基因的siRNA轉(zhuǎn)染的維洛細胞隨后感染（A)I型脊髓灰質(zhì)炎病毒（沙賓株）或（B) 3 型脊髓灰質(zhì)炎病毒（沙賓）。使用實例1中描述的脊髓灰質(zhì)炎病毒ELISA評定隨后的上清 液。用靶向初步篩選中鑒別的基因的siRNA轉(zhuǎn)染的維洛細胞隨后感染（C)I型脊髓灰質(zhì)炎 病毒（沙賓株）或（D) 3型脊髓灰質(zhì)炎病毒（沙賓）。使用實例1中描述的空斑測定評定隨 后的上清液。
[0036] 圖6.miRNA模擬物篩選概述。在初步ELISA篩選中測試大于1，200個miRNA模擬 物以鑒別增強和降低脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原的基因。
[0037] 圖7. CCHD5ffI定中各個miRNA模擬物的性能。初步篩選中鑒別的11種miRNA誘 導(dǎo)病毒滴度兩倍或更多倍的增加。
[0038] 圖8.A.示例性基因敲低（KD)數(shù)據(jù)。q-RT-PCR用來評定各個siRNA轉(zhuǎn)染到維洛細 胞中之后的靶基因敲低的水平。9個基因沉默實驗（ZNF205、SEC61G、ETSI、EP300、BTN21A、 611?史3、了4?1、]\10：01以及6061?)的結(jié)果顯示典型地觀察到70%的1(0或更大。8.圖示示出 了單一基因敲低事件對七種不同的脊髓灰質(zhì)炎病毒的影響。使29種單獨的基因分別在維 洛細胞中沉默。隨后，細胞感染七種不同的脊髓灰質(zhì)炎株中的一種，包括沙賓1、沙賓2、沙 賓3、Mahoney(野生型I)、Brunhilde(野生型I)、MEF(野生型2)、以及Saukett(野生型3)。記錄滴度是相對于在將一種非靶向?qū)φ誗iRNA(NTC)轉(zhuǎn)染到細胞中時所觀察到的那些 而言的。另外的對照包括1)祀向脊髓灰質(zhì)炎病毒（siPolio)的siRNA池、模擬感染（mock infections) (Mock)、以及在siRNA不存在（-siRNA)下用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑處理的細胞。實線 指示病毒滴度的4倍增加。點線指示病毒滴度的8倍（或更佳）增加。此數(shù)據(jù)為初步篩選 中鑒別的基因靶標(biāo)的敲低會帶來脊髓灰質(zhì)炎病毒生產(chǎn)的增強提供進一步的支持。
[0039] 圖9A和圖9B.雙基因敲低對多種脊髓灰質(zhì)炎病毒株的滴度的影響的示例性數(shù)據(jù)。 深灰色條表示兩種基因同時沉默時所觀察到的病毒滴度的實際增加。淺灰色條表示基于各 個基因沉默時觀察到的變化總和預(yù)測的滴度。表示觀察到的滴度的增加大于單一事件 總和的事件（incidents)(P<0? 〇5)。
[0040] 圖10. (A)基因沉默對EV71病毒生產(chǎn)的影響。用靶向脊髓灰質(zhì)炎病毒RNAi篩選 過程中鑒別的若干基因中的一種的siRNA轉(zhuǎn)染維洛細胞。在一個適當(dāng)?shù)幕虺聊瑫r間段之 后，將EV71添加到培養(yǎng)物中。隨后，通過檢測細胞病變效應(yīng)（CPE)來評定相對滴度。（B)空 斑測定結(jié)果證實三種不同的基因（ZNF205、CNTD2和M(XDl)沉默如何影響EV71滴度。"RD 細胞"=橫紋肌肉瘤細胞。（C)條形圖量化了空斑測定的結(jié)果。實驗重復(fù)進行三次，并且結(jié) 合一種非靶向?qū)φ誷iRNA(NTC)以及靶向EV71基因組的一種siRNA(siEV71)。
[0041] 表I.提供增加脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原和復(fù)制的124個基因的列表。表提供基因名 稱、KEGG轉(zhuǎn)換編號、以及來自初步脊髓灰質(zhì)炎特異性ELISA的Z-評分值。
[0042] 表II.提供沉默時大大減少脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原和病毒生產(chǎn)的大于100個基因的 列表。
[0043]表III.提供具有誘導(dǎo)脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原和病毒生產(chǎn)增加的兩個或更多個siRNA的68個基因（表I中鑒別的124個命中區(qū)域除外）的列表。表提供基因名稱以及誘 導(dǎo)表型的siRNA的數(shù)目。
[0044] 表IV.提供大大減少脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原和病毒生產(chǎn)的宿主編碼的miRNA的列 表。
[0045] 表V.基因、檢索號、以及用來產(chǎn)生圖8中的數(shù)據(jù)的siRNA序列的列表。
[0046] 表VI.以加合或協(xié)同方式增強脊髓灰質(zhì)炎病毒生產(chǎn)的49個基因組合。
[0047] 展示性實施方式的詳細說明
[0048]現(xiàn)將結(jié)合優(yōu)選實施例來描述本披露。這些實施例被呈現(xiàn)來幫助理解本披露，并且 并不意圖且不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本披露。在閱讀本披露之后對普通技術(shù)人員而言 可能變得顯而易見的所有替代方案、修改以及等效物被包括在本披露的精神和范圍內(nèi)。
[0049] 關(guān)于基因命名，單一基因經(jīng)常由多個符號表示。例如，在文獻中，編碼肽酰脯氨酰 異構(gòu)酶B的親環(huán)蛋白B基因