專利名稱：細(xì)胞系LNCaP和細(xì)胞系C4-2的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞系LNCaP和細(xì)胞系C4_2的新用途。
背景技術(shù)：
在前列腺癌(Prostate Cancer，前列腺癌)治療中，放射治療始終處于重要的地 位。早期前列腺癌的放射治療可以達(dá)到根治的目的，療效與前列腺癌根治性手術(shù)相近。而 對于局部晚期的前列腺癌(尤其是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者)，放療雖然可減輕癥狀，改善生存質(zhì)量，但 其表現(xiàn)出放療抗性，經(jīng)放療治愈的前列腺癌病人中30%會在原照射部位復(fù)發(fā)。腫瘤病人對 電離輻射(IR)的敏感性或抵抗性的個(gè)體間差異是很大的，個(gè)體的輻射敏感性或抵抗性不 能在治療前可靠地預(yù)測，造成放療反應(yīng)不確定。目前對于癌細(xì)胞為什么會從IR敏感發(fā)展到 IR抗性的作用機(jī)制還不清楚，但這無疑是與周期阻滯、凋亡或死亡相關(guān)基因表達(dá)變化相關(guān)。對輻射誘導(dǎo)的相關(guān)基因或信號通路認(rèn)識的提高，有可能幫助開發(fā)出前列腺癌輻射 抗性改變的藥物。通過對前列腺癌進(jìn)展相關(guān)基因的檢測，有可能幫助制訂個(gè)體化的放療方 案，為指導(dǎo)臨床醫(yī)生診斷治療提供依據(jù)。研究與IR敏感發(fā)展成為抗性的相關(guān)基因，首先需 要在細(xì)胞水平開展研究，因此建立能代表對輻射敏感與抗性不同階段的細(xì)胞模型顯得至關(guān) 重要。目前研究輻射敏感與抗性的前列腺癌細(xì)胞系通常是LNCaP和PC3或DU145。其中 LNCaP代表輻射敏感階段，PC3或DU145代表輻射抗性階段。但存在的問題是，LNCaP與PC3 或DU145細(xì)胞的遺傳背景不同。特別重要的是，雄激素受體(Androgen Receptor,AR)信號 通路在前列腺癌發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，LNCaP為AR陽性細(xì)胞，其AR信號通路處于激活 狀態(tài)。然而PC3或DU145細(xì)胞中AR蛋白不表達(dá)，AR信號通路失活。因此它們間的差異表 達(dá)基因就不可能準(zhǔn)確代表前列腺癌細(xì)胞系輻射敏感進(jìn)展相關(guān)的決定性基因。C4-2細(xì)胞具有和LNCaP相同的遺傳背景，具有高惡性、轉(zhuǎn)移和雄激素非依賴生長 的特性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供細(xì)胞系LNCaP和細(xì)胞系C4_2的新用途。本發(fā)明所提供的新用途為細(xì)胞系LNCaP和細(xì)胞系C4_2在制備對輻射敏感和對輻 射產(chǎn)生抗性的前列腺癌細(xì)胞模型中的應(yīng)用。所述輻射為電離輻射。所述對輻射敏感為如下1)、2)、3)和/或4)所示1)在輻射劑量為5Gy和輻射后培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 LNCaP相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系LNCaP的生長率降低了 81% ；2)在輻射劑量為IOGy和輻射后培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞 系LNCaP相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系LNCaP的生長率降低了 88% ； 3)在輻射劑量為5Gy和接種量為4000個(gè)細(xì)胞/孔的條件下，與 未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 LNCaP相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系LNCaP的克隆形成率降低了 85% ；
4)在輻射劑量為5Gy和接種量為6000個(gè)細(xì)胞/孔的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 LNCaP相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系LNCaP的克隆形成率降低了 86% ；所述對輻射產(chǎn)生抗性為如下I、II、III和/或IV所示I、在輻射劑量為5Gy和輻射后培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 C4-2相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系C4-2的生長率降低了 33% ；II、在輻射劑量為IOGy和輻射后培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞 系C4-2相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系C4-2的生長率降低了 35% ；III、在輻射劑量為5Gy和接種量為4000個(gè)細(xì)胞/孔的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞 系C4-2相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系C4-2的克隆形成率降低了 51% ；IV、在輻射劑量為5Gy和接種量為6000個(gè)細(xì)胞/孔的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞 系C4-2相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系C4-2的克隆形成率降低了 47% ；C4-2細(xì)胞具有和LNCaP相同的遺傳背景，具有高惡性、轉(zhuǎn)移和雄激素非依賴生長 的特性。本發(fā)明首先證明了 C4-2細(xì)胞的一個(gè)新的特性，即C4-2細(xì)胞對電離輻射具有抗性。 本發(fā)明的這一發(fā)現(xiàn)使LNCaP/C4-2可以作為代表前列腺癌細(xì)胞由IR敏感發(fā)展到IR抵抗的 細(xì)胞模型。本發(fā)明可以用于篩選出決定前列腺癌從輻射敏感進(jìn)展為抗性的電離輻射誘導(dǎo)基 因，進(jìn)而篩選出參與和決定前列腺癌進(jìn)展的相關(guān)基因，從而為發(fā)現(xiàn)更有效的臨床激素抗性 和輻射抗性的治療靶標(biāo)打下基礎(chǔ)。本發(fā)明還可應(yīng)用于闡明IR抵抗發(fā)生發(fā)展過程，研究與IR抵抗雄激素非依賴發(fā)展 之間的關(guān)系，篩選代表IR不同階段的分子標(biāo)志物分子。本發(fā)明還可用于闡明輻射敏感性 的增強(qiáng)或減弱的分子機(jī)制，開發(fā)出適合于臨床使用的預(yù)測性分析方法；通過對特定基因的 檢測，篩選出可用于制訂個(gè)體化的放療方案和基因治療-放療增敏相關(guān)的電離輻射誘導(dǎo)基 因，為進(jìn)一步研究DNA損傷修復(fù)提供重要線索，同時(shí)也為腫瘤的放射治療提供新的思路和 策略。


圖1為輻射后LNCaP和C4_2的生長曲線分析。圖2為輻射后LNCaP和C4-2的克隆形成分析。圖3為軟瓊脂集落形成試驗(yàn)分析輻射后LNCaP和C4_2細(xì)胞的錨著非依賴生長能 力。圖4為流式細(xì)胞試驗(yàn)分析輻射后LNCaP和C4_2細(xì)胞的S期數(shù)量和G2/M期細(xì)胞阻 滯狀況。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP購自Urocore (Oklahoma City, OK, USA)公司，人前列腺 癌細(xì)胞系 C4-2 購自 Urocore (Oklahoma City, OK, USA)公司。RPMI1640培養(yǎng)基每袋1640 (Gibco，IL裝)加入2g碳酸氫鈉 和4. 8g H印es，調(diào)pH值至7. 4，雙層0. 22 μ m濾紙過濾除菌后使用。下述實(shí)施例中的細(xì)胞培養(yǎng)中均使用RPMI1640
培養(yǎng)基。H印es購自AMRESC0公司，產(chǎn)品目錄號為0511。PBS 向900ml蒸餾水中加入8g氯化鈉，0. 2g氯化鉀，1. 44g磷酸氫二鈉，0. 24g磷
酸二氫鉀，調(diào)PH值至7. 4，定容至1L，高壓滅菌后使用。細(xì)胞培養(yǎng)用胰酶Ig胰酶加入400ml ΡΒ5，*Λ430μ1 0. 5Μ EDTA，雙層濾紙過濾
除菌后使用。下述實(shí)施例中的數(shù)據(jù)分析方法利用SigmapStat 3. 5軟件程序進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析 和處理。MTT、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)利用SigmapStat 3. 5軟件中的t檢驗(yàn)。實(shí)施例1、LNCaP細(xì)胞和C4_2細(xì)胞對電離輻射的抗性檢測一、C4-2細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗電離輻射生長能力為了解LNCaP/C4_2細(xì)胞模型對電離輻射的應(yīng)答反應(yīng)，MTT實(shí)驗(yàn)分析了分別在0、 2. 5、5和IOGy輻射后培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞生長狀況。將LNCaP細(xì)胞和C4-2細(xì)胞分別進(jìn)行0、2. 5、5和IOGy劑量的電離輻射，放置于 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、6、12、24、48、72小時(shí)。向上述培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞中加入 20 μ 1 MTT溶液(MTT溶液是將MTT溶解于PBS中得到的，MTT的濃度為5mg/ml)，在5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后用150 μ 1 DMSO將其溶解，取150 μ 1細(xì)胞懸浮液在酶聯(lián)儀中讀取 490nm波長下的OD49tl數(shù)值，以時(shí)間為橫軸，OD49tl光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。數(shù)據(jù) 用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差來表示。結(jié)果如圖1所示，A表示LNCaP細(xì)胞，B表示C4_2細(xì)胞。細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示， 在5Gy輻射和培養(yǎng)72小時(shí)條件下，LNCaP的生長率是1. 1，而未受輻射的LNCaP的生長率是 5. 9，此時(shí)LNCaP的生長被抑制了 81. 3%。同樣在5Gy輻射和培養(yǎng)72小時(shí)條件下，C4-2的 生長率是4. 2，而未受輻射的C4-2的生長率是6. 4，C4-2的生長被抑制了 34. 4%。在IOGy 輻射和培養(yǎng)72小時(shí)條件下，LNCaP的生長率是0. 7，而未受輻射的LNCaP的生長率是5. 9， LNCaP的生長被抑制了 88. 1% ；在IOGy輻射和培養(yǎng)72小時(shí)條件下，C4-2的生長率是4. 1， 而未受輻射的C4-2的生長率是6.4，C4-2的生長被抑制了 35.9%。這些結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞 遭受電離輻射后，LNCaP和C4-2細(xì)胞的生長均以輻射劑量依賴方式被抑制，然而C4-2細(xì) 胞受電離輻射后較LNCaP細(xì)胞具有更強(qiáng)的生長能力，C4-2細(xì)胞表現(xiàn)出電離輻射的抗性(P < 0. 01)。用MTT溶液處理后細(xì)胞懸液在490nm波長下的數(shù)值表示生長率。活細(xì)胞線粒體中 的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物Formazan并沉積在細(xì)胞 中。DMSO能溶解細(xì)胞中的Formazan，測定上述處理細(xì)胞懸液在490nm波長下的數(shù)值，可代 表細(xì)胞的存活和生長狀態(tài)，即細(xì)胞的生長率。二、C4-2細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗電離輻射錨著依賴和非依賴生長能力為了驗(yàn)證LNCaP/C4_2細(xì)胞在遭受電離輻射后的存活能力，進(jìn)行了 5Gy輻射條件下的平板克隆形成(錨著依賴)和軟瓊脂集落形成(錨著非依賴)實(shí)驗(yàn)。1、平板克隆形成將細(xì)胞按照4000、6000、8000個(gè)細(xì)胞/孔接種6孔培養(yǎng)板，放置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，分別設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，然后將LNCaP細(xì)胞和C4-2細(xì)胞 各自分別進(jìn)行5Gy的電離輻射，然后繼續(xù)培養(yǎng)10 16天，待有明顯克隆形成后，棄上清，用PBS清洗1 2次，甲醇固定10分鐘后用PBS清洗1 2次，加入的結(jié)晶紫染液30分 鐘后清水洗凈，掃描。同時(shí)以未進(jìn)行電離輻射的作對照(記作OGy)。結(jié)果如圖2所示，A表示LNCaP細(xì)胞，B表示C4_2細(xì)胞。結(jié)果顯示，5Gy輻射后與 OGy相比，以4000、6000、8000個(gè)細(xì)胞/孔接種6孔培養(yǎng)板板，3個(gè)梯度接種的LNCaP細(xì)胞都 失去了克隆形成能力，表明LNCaP在上述輻射條件下細(xì)胞不能存活。而C4-2仍然形成很多 肉眼可見細(xì)胞克隆，說明C4-2具有較LNCaP細(xì)胞更強(qiáng)的抗輻射生長能力，而LNCaP則是對 輻射高度敏感的。2、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)將LNCaP細(xì)胞和C4_2細(xì)胞分別進(jìn)行0和5Gy劑量的電離輻射，放置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。先配制并鋪好底層瓊脂(瓊脂濃度0. 5% )。然后常規(guī)消化細(xì) 胞，將細(xì)胞數(shù)懸浮于0. 34%的瓊脂并接種于6孔板中，接種密度分別為4000個(gè)/孔、6000 個(gè)/孔、8000個(gè)/孔，放置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1周后開始觀察，2周后多于50個(gè) 細(xì)胞形成的克隆被計(jì)數(shù)，終止培養(yǎng)。每個(gè)細(xì)胞接種密度重復(fù)3個(gè)孔，數(shù)據(jù)用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差 來表示。同時(shí)以未進(jìn)行電離輻射的作對照(記作OGy)。克隆形成率的計(jì)算公式克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)X 100%。0. 34%的瓊脂溶液向RPMI1640培養(yǎng)基中添加瓊脂和FBS得到的，瓊脂在0. 34% 的瓊脂溶液中的濃度為0. 34% (質(zhì)量百分含量)，F(xiàn)BS在0. 34%的瓊脂溶液中的濃度為 10% (質(zhì)量百分含量)。結(jié)果如圖3所示，A表示LNCaP細(xì)胞，B表示C4_2細(xì)胞。錨著非依賴生長結(jié)果顯 示，在5Gy輻射和接種4000個(gè)細(xì)胞/孔接種6孔板時(shí)，LNCaP細(xì)胞的克隆形成率是0. 3%， 未經(jīng)輻射處理時(shí)其克隆形成率是2.3%，克隆形成率降低了 86.9%。在同樣的輻射條件下， C4-2細(xì)胞的克隆形成率是2. 6%，未經(jīng)輻射處理時(shí)其克隆形成率是5. 4%，克隆形成率降低 了 51. 9%。而在5Gy輻射和接種6000個(gè)細(xì)胞/孔接種6孔板時(shí)，LNCaP細(xì)胞的克隆形成率 是0.4%，未經(jīng)輻射處理時(shí)其克隆形成率是3. l%，LNCaP細(xì)胞的克隆形成率降低了 87. 1%; C4-2細(xì)胞的克隆形成率是2. 6 %，未經(jīng)輻射處理時(shí)其克隆形成率是5. 0 %，C4-2細(xì)胞的克隆 形成率降低了 48. 0% (P < 0. 01)。上述結(jié)果均表明，與LNCaP相比，輻射介導(dǎo)的克隆形成抑 制效率在C4-2細(xì)胞中顯著降低，C4-2細(xì)胞擁有明顯的輻射抵抗性質(zhì)，而其母體細(xì)胞LNCaP 則是輻射敏感的。三、C4-2細(xì)胞更容易克服輻射造成的G2/M細(xì)胞周期阻滯用流式細(xì)胞技術(shù)分析了輻射對LNCaP/C4_2細(xì)胞周期的影響。將LNCaP細(xì)胞和C4_2細(xì)胞分別進(jìn)行5Gy劑量的電離輻射，放置于37°C、5% CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、6、12、24、48、72小時(shí)。利用流式細(xì)胞儀檢測上述培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞周期 分布狀況。具體檢測方法1)先用PBS清洗2 3遍細(xì)胞，而后用0. 25%胰酶(含0. 02% EDTA)消化細(xì)胞。2)用含8%國產(chǎn)胎牛血清1640輕輕懸起細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管里。IOOOrpm 離心，棄上清。3)加入300μ 1含5%國產(chǎn)胎牛血清的PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP管中，再加 入700 μ 1的無水乙醇混勻，置于_20°C冰箱過夜。4) IOOOrpm離心，棄上清，用PBS洗兩次， 每次以IOOOrpm離心，棄上清。用100 μ 1的RNaseA(lmg/ml)重懸，37°C消化30分鐘。5) 加入400 μ IPI染色15 30分鐘，避光。6)利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4所示。圖4中，A表示LNCaP細(xì)胞，B表示C4-2細(xì) 胞，C表示LNCaP細(xì)胞，D表示C4-2細(xì)胞。結(jié)果顯示，在正常條件下，C4-2細(xì)胞S期高于LNCaP(C4-2為33. 275%, LNCaP為 20. 25% )。在5Gy輻射后培養(yǎng)12小時(shí)時(shí)，LNCaP的S期細(xì)胞急劇降低(輻射后3. 49%，未 輻射22. 14% )，48小時(shí)后部分恢復(fù)(輻射后10%，未輻射19. 12% )，在第12小時(shí)可被觀 察到LNCaP細(xì)胞G2\M期細(xì)胞阻滯(輻射后37. 01%，未輻射14. 42 ，可持續(xù)至72小時(shí) (輻射后40. 37%，未輻射16. 84% )0然而C4-2在5Gy輻射后的6小時(shí)S期細(xì)胞比例即明顯提高(輻射后48. 98%，未 輻射35. 85% ),12小時(shí)后急劇下降(輻射后5. 77%，未輻射31. 71% ),48小時(shí)后部分恢 復(fù)(輻射后11. 45%，未輻射32.65% )。第12小時(shí)可觀察到其G2\M期細(xì)胞阻滯(輻射后 56. 08%,未輻射15. 73% )，24小時(shí)時(shí)保持細(xì)胞阻滯(輻射后47. 52%,未輻射15. 24% )，在 48小時(shí)細(xì)胞阻滯基本恢復(fù)(輻射后23. 27%，未輻射10. 46% )。上述細(xì)胞周期結(jié)果顯示， C4-2細(xì)胞可以較快地通過輻射造成的G2/M阻滯，C4-2細(xì)胞中S期的細(xì)胞比例高于LN CaP， 因此促使細(xì)胞繼續(xù)增殖。
權(quán)利要求
細(xì)胞系LNCaP和細(xì)胞系C4-2在制備對輻射敏感和對輻射產(chǎn)生抗性的前列腺癌細(xì)胞模型中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述輻射為電離輻射。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述對輻射敏感為如下1)、2)、3)和/或4)所示1)在輻射劑量為5Gy和輻射后培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 LNCaP相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系LNCaP的生長率降低了 81% ；2)在輻射劑量為10Gy和輻射后培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 LNCaP相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系LNCaP的生長率降低了 88% ；3)在輻射劑量為5Gy和接種量為4000個(gè)細(xì)胞/孔的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 LNCaP相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系LNCaP的克隆形成率降低了 85% ；4)在輻射劑量為5Gy和接種量為6000個(gè)細(xì)胞/孔的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 LNCaP相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系LNCaP的克隆形成率降低了 86% ；所述對輻射產(chǎn)生抗性為如下I、II、III和/或IV所示I、在輻射劑量為5Gy和輻射后培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系C4-2 相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系C4-2的生長率降低了 33% ；II、在輻射劑量為10Gy和輻射后培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 C4-2相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系C4-2的生長率降低了 35% ；III、在輻射劑量為5Gy和接種量為4000個(gè)細(xì)胞/孔的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 C4-2相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系C4-2的克隆形成率降低了 51% ；IV、在輻射劑量為5Gy和接種量為6000個(gè)細(xì)胞/孔的條件下，與未經(jīng)輻射的細(xì)胞系 C4-2相比，經(jīng)輻射的細(xì)胞系C4-2的克隆形成率降低了 47%。
全文摘要
本發(fā)明公開了細(xì)胞系LNCaP和細(xì)胞系C4-2的新用途。該新用途為細(xì)胞系LNCaP和細(xì)胞系C4-2在制備對輻射敏感和對輻射產(chǎn)生抗性的前列腺癌細(xì)胞模型中的應(yīng)用。本發(fā)明首先證明了LNCaP/C4-2細(xì)胞模型的一個(gè)新的特性，即其中的C4-2細(xì)胞對電離輻射具有抗性，LNCaP/C4-2可以是代表前列腺癌細(xì)胞由IR敏感發(fā)展到IR抵抗的細(xì)胞模型。本發(fā)明可以用于篩選出決定前列腺癌從輻射敏感進(jìn)展為抗性的電離輻射誘導(dǎo)基因，進(jìn)而篩選出參與和決定前列腺癌進(jìn)展的相關(guān)基因，從而為發(fā)現(xiàn)更有效的臨床激素抗性和輻射抗性的治療靶標(biāo)打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/09GK101831406SQ20101017304
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日
發(fā)明者周建光, 施慶國 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所