一種p2y1/u2os細(xì)胞株及其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種P2Y1/U20S細(xì)胞株及其制備方法及應(yīng)用，屬于藥物高通量篩選檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]P2Y1受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，在人的心、腦、血管、胎盤、肝、肺等組織中均有表達(dá)。P2Y1受體與Gq蛋白相偶聯(lián)，該受體被活化時，可以激活憐脂酶Cβ (ΡΙΧβ)、蛋白激酶C(PKC)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣動員。近年來的研宄表明，Ρ2Υ1受體在血小板的激活、血管舒張以及動脈粥樣硬化中起著重要作用。例如:ADP與Ρ2Υ1受體結(jié)合后，會觸發(fā)Gq通路，引起胞漿鈣離子水平升高，從而使血小板發(fā)生快速可逆的聚集。在內(nèi)皮細(xì)胞中，Ρ2Υ1受體的激活可以通過一氧化氮依賴的機制導(dǎo)致冠狀血管舒張。溶血磷脂酸(LPA)會導(dǎo)致血小板激活以及血小板-單核細(xì)胞聚合物的形成從而形成血管斑塊，該作用可以被Ρ2Υ1受體拮抗劑阻斷。Ρ2Υ1受體還可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和死亡過程。在黑色素瘤、直腸結(jié)腸腫瘤和腦部腫瘤以及其他細(xì)胞系中，Ρ2Υ1受體激活導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少。在人前列腺癌PC-3細(xì)胞中，Ρ2Υ1受體激活導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制和死亡，提示Ρ2Υ1受體有希望成為前列腺癌的新型治療革巴點。
[0003]目前，抗血小板藥物，如氯吡格雷、普拉格雷，已經(jīng)上市多年，應(yīng)用廣泛，療效確切，但是也存在氯吡格雷抵抗、出血風(fēng)險等問題；近年來，以Ρ2Υ1受體為靶點的抗血小板化合物研宄日漸深入，核苷酸衍生物MRS2179是Ρ2Υ1受體的選擇性拮抗劑，在體內(nèi)、體外均具有抗血栓活性，是最常用的研宄Ρ2Υ1受體的工具藥，但是存在口服生物利用度低的缺陷。本研宄通過構(gòu)建熒光標(biāo)記人Ρ2Υ1蛋白細(xì)胞株，運用高通量篩選的手段，希望發(fā)現(xiàn)一些非核苷酸類、便于口服的Ρ2Υ1受體激動劑或拮抗劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種P2Y1/U20S細(xì)胞株的制備方法，具體包括以下步驟: Cl)構(gòu)建人Ρ2Υ1受體熒光蛋白GFP真核表達(dá)載體P2Y1/PCMV6 ；
(2)按Lipofectamine2000操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U20S細(xì)胞，G418加壓篩選2周，獲得具有抗生素抗性的陽性細(xì)胞克隆，擴增培養(yǎng)即為穩(wěn)定表達(dá)人P2Y1的U20S細(xì)胞系，命明為P2Y1/U20S細(xì)胞株。
[0005]本發(fā)明所述焚光蛋白為GFP (green fluorescence protein)或任何具有焚光性質(zhì)的蛋白，其中GFP是綠色光蛋白。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供所述的P2Y1/U20S細(xì)胞株用于測定P2Y1受體激動劑或拮抗劑生物活性的方法，包括如下步驟:轉(zhuǎn)染了 GFP標(biāo)記的P2Y1受體基因條件下(GFP直接標(biāo)記P2Y1的C末端)，在受體激動劑刺激下誘導(dǎo)P2Y1/U20S細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光斑點，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析測定P2Y1/U20S細(xì)胞內(nèi)熒光斑點數(shù)目，檢測P2Y1受體激動劑或抑制劑的生物活性。
[0007]本發(fā)明所述的受體激動劑為ΑΤΡ，P2Y1受體與配體結(jié)合后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光斑點數(shù)目與受體激動劑的活性呈正相關(guān)，用高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析測定P2Y1/U20S細(xì)胞內(nèi)熒光斑點數(shù)目，測定受體激動劑的生物活性。
[0008]本發(fā)明的有益效果:
(I)本發(fā)明用P2Y1/U20S細(xì)胞株來檢測P2Y1受體激動劑、拮抗劑，所述該檢測方法易標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性好，具有P2Y1受體特異性、成本低、準(zhǔn)確和方便的特點，具有良好的應(yīng)用前景；(2 )本發(fā)明提供了熒光標(biāo)記人P2Y1受體蛋白細(xì)胞株P(guān)2Y1/U20S，相比國內(nèi)的篩選方法如均相時間分辨熒光技術(shù)(HTRF)具有操作簡單，形象直觀，略去了加入Buffer、一抗、二抗的繁瑣步驟，降低了檢測成本。由于本發(fā)明提供的是直接檢測受體與配體作用后的反應(yīng)，所以有著更高靈敏度與特異性，大大降低假陽性的發(fā)生，并且可以針對中草藥混合物進(jìn)行篩選。
【附圖說明】
[0009]圖1 GFP標(biāo)記P2Y1示意圖；
圖2重組真核表達(dá)載體P2Yl/pCMV6示意圖；
圖3高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析細(xì)胞表面P2Y1的表達(dá)情況結(jié)果；
圖4高內(nèi)涵系統(tǒng)觀察分析刺激后細(xì)胞內(nèi)形成熒光斑點；
圖5 P2Y1/U20S細(xì)胞經(jīng)ATP激活后活性反應(yīng)結(jié)果。
【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。
[0011]實施例1
GFP熒光標(biāo)記人P2Y1受體真核表達(dá)載體P2Yl/pCMV6的構(gòu)建，P2Y1/U20S細(xì)胞株的建立，以及P2Y1/U20S細(xì)胞內(nèi)熒光斑點平均數(shù)目變化檢測P2Y1受體激動劑。
[0012]一、GFP熒光標(biāo)記人P2Y1受體(如圖1所示)真核表達(dá)載體P2Yl/pCMV6的構(gòu)建(如圖2所示):
(I)人P2Y1 cDNA (購自O(shè)riGene公司)擴增:以人P2Y1 cDNA為模板，采用PCR的方式擴增全長人P2Y1 cDNA編碼區(qū)，全長1119bp ；
其上游引物:5，-gaggcgatcgccATGACCGAGGTGCTGTGGCCGGC-3，；
下游引物:5 ’ -gcgacgcgtCAGGCTTGTATCTCCATTCTGCTTG-3 ’(引物由碩陽生物科技有限公司合成)。
[0013](2 )回收、純化PCR產(chǎn)物，連接到PMD18-T Vector上，獲得重組質(zhì)粒P2Yl/pMD18_T，利用限制性內(nèi)切酶沒./!和Mlul對質(zhì)粒進(jìn)行酶切。
[0014](3)用限制性內(nèi)切酶 SgfY 和 Mlul 酶切質(zhì)粒 G-D (pCMV6_AC-GFP_DR5)。
[0015](4)回收酶切產(chǎn)物，在16°C連接8小時，獲得重組質(zhì)粒P2Yl/pCMV6，按照OMEGA去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說明書提取P2Yl/pCMV6質(zhì)粒。
[0016]基因序列的克隆PCR反應(yīng)體系為50 yL，由5 μ L 1XEx-Taq buffer U μ LEx-Taq DNA 聚合酶 5 U/yL、3 μ L 2.5 mM dNTP、l μ L 上游引物 10 pmol/ μ LU yL 下游引物 10 pmol/ μ LU μ L 質(zhì)粒(BC113493) 100 ng/yL和 38 μ L 無菌水組成；PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5 min，95°C變性I min，65°C退火0.5 min，72°C延伸I min，共30個循環(huán)，72°C延伸 10 min ;所用的 1XEx -Taq buffer 中含有 Mg2+。
[0017]回收PCR產(chǎn)物連接到PMD18-T Vector反應(yīng)體系為10 μ L，由5 yL回收PCR產(chǎn)物、4.5 yL