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從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法

文檔序號(hào):3542115閱讀:297來源:國知局
專利名稱:從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)物質(zhì)或藥品原料的制造方法,具體涉及一 種以紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液為原料分離紫杉醇的方法。
背景技術(shù)
紫杉醇是一種療效顯著的天然抗腫瘤、抗AID相關(guān)的卡波西肉瘤 (Kaposi's Sarcoma)的活性物質(zhì),屬于紅豆杉屬植物或細(xì)胞產(chǎn)生的二砲 類次生代謝產(chǎn)物,它的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,通過化學(xué)全合成生產(chǎn)很不現(xiàn)實(shí)。 從一開始發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在,人們主要從紅豆杉樹皮或者枝葉中提取紫杉醇, 但由于紫杉醇在紅豆杉中的合成和積累過程漫長且復(fù)雜,即使在公認(rèn)較 高的百年生紅豆杉樹皮中,紫杉醇的含量也在0.06%以下,大量剝?nèi)淦?將對(duì)紅豆杉資源產(chǎn)生毀滅性的破壞;目前組織提取法主要考慮的是采集 紅豆杉可再生的枝葉部分進(jìn)行提取,盡管這條來源暫時(shí)可以緩解紫杉醇 資源的壓力,但紅豆杉枝葉再生周期一般為2 5年,依據(jù)這條途徑仍無 法從根本上解決紫杉醇穩(wěn)定來源問題。相比之下,利用紅豆杉植物細(xì)胞 的大規(guī)模培養(yǎng)方法不受季節(jié)和土地資源的限制,紫杉醇的合成的能力理 論上是可以調(diào)控的,因此,這種方法是徹底解決紫杉醇來源問題的最有 希望的途徑。
植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的一個(gè)顯著特點(diǎn)是培養(yǎng)液體積龐 大,紫杉醇在培養(yǎng)液中的含量比較低, 一般在20mg/L左右,它既有一部 分分泌到培養(yǎng)液中,還有一大部分存留在細(xì)胞中。王君健等提出的細(xì)胞 培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的方法,公開號(hào)為CN1096820,只針對(duì)細(xì)胞內(nèi)的紫杉醇, 將收獲期的細(xì)胞與培養(yǎng)液分離(離心、或過濾),然后將細(xì)胞烘干后供提取,在這種方法中,那些因分泌或部分細(xì)胞破裂流失到培養(yǎng)液中的的紫 杉醇將被丟棄。王國亮等所提出的從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)液濾液中富集提取
紫杉醇的方法,公開號(hào)為CN1305999;以及Wu, J, ; Lin, L. Enhancement of taxol production and release'in Taxus chinensis cell cultures by ultrasound, methyl jasmonate and in situ solvent extraction. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003, 62(2-3): 151-155;針對(duì)分泌到培養(yǎng)液中的紫杉醇進(jìn)行樹脂富集。Yu, Guang'ao; Mei, Xingguo; Ke, Tie; Chen, Jing. Research on different solvent extraction of taxol from Taxus cell. Huazhong Ligong Daxue Xuebao, 2000, 28(11): 83-84.用大量有禾幾溶 劑對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行液-液萃取。這些方法必然會(huì)導(dǎo)致大量有機(jī)溶劑耗費(fèi)和環(huán) 境憂患,還要投入大量資金用于購置大尺寸的液-液萃取設(shè)備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法,目的 在于減少胞外紫杉醇的流失,提高原料利用率,降低成本和環(huán)境污染。
本發(fā)明的一種從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法,包括
(1) 細(xì)胞勻漿步驟將收獲期的紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液過濾,分離 細(xì)胞與培養(yǎng)液,用勻漿機(jī)將細(xì)胞破碎為勻漿,然后加入原培養(yǎng)液中,獲 得紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿;
(2) 膜分離步驟將紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿先通過孔徑小于等于10 Um的濾膜過濾,得到細(xì)胞殘片濾渣和濾液;濾液通過相對(duì)分子質(zhì)量截留 值為15000~25000的超濾膜過濾;流出的濾液再通過相對(duì)分子質(zhì)量截留 值為1000 5000的超濾膜過濾,后兩次超濾膜過濾壓力為O. l-0.4MPa, 溫度為20°C 30°C,后兩次超濾膜過濾后濾液濃縮倍數(shù)10-30倍,將細(xì) 胞殘片濾渣和后兩次超濾膜上濃縮物合并,得到膜分離截留物;(3) 紫杉醇提取步驟將膜分離截留物在30。C 6(TC溫度下烘干至 含水量小于5%,研磨成粉末,加入提取溶劑,在常溫下用超聲波輔助提 取,過濾,回收濾液溶劑,得浸膏;
(4) 大孔吸附樹脂富集步驟用甲醇或乙醇溶解浸膏,加載到大孔 樹脂柱上,用體積百分比含甲醇20% 40%的水溶液沖洗,除去水溶性雜 質(zhì)和色素,用體積百分比含甲醇60% 80%的水溶液洗脫,收集3倍柱體 積的洗脫液,將洗脫液中的甲醇蒸干,加入等體積的萃取溶劑進(jìn)行液-液 萃取,收集有機(jī)溶劑層,蒸干,得到大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品;
(5) 精分離步驟用正相層析和反相層析相結(jié)合對(duì)紫杉醇粗品進(jìn)行 分離,得到純度大于98%的紫杉醇。
所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法,其特征在于, 所述細(xì)胞勻漿步驟的過程為將培養(yǎng)液用砂芯漏斗或工業(yè)板框過濾,分 離細(xì)胞與培養(yǎng)液,用勻漿機(jī)在5000 20000 r/min的轉(zhuǎn)速下將細(xì)胞破碎 為勻漿,破碎時(shí)間1 3min,將勻漿后的糊狀流體加入原培養(yǎng)液中,得到 紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿。
所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法,其特征在于, 所述膜分離步驟中,所述分子量截留值為15000 25000的超濾膜和分子 量截留值1000 5000的超濾膜材料采用聚丙烯中空纖維膜絲材料或者改 性聚砜膜絲材料。
所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法,其特征在于 所述紫杉醇提取步驟中,所述提取溶劑為甲醇、乙腈、乙醇、二氯 甲垸中的一種,或者是體積比為9:1或1:9的甲醇與二氯甲烷的混合物。所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法,其特征在于, 所述大孔吸附樹脂富集步驟中
所述萃取溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一種; 所述大孔樹脂柱內(nèi)的吸附樹脂為國產(chǎn)D-401, DK-110A, HD-2的一
種;
所述大孔樹脂柱徑高比為為l: 10 1:20, 上樣量為60mg 80mg 浸膏/ g干樹脂。
所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法,其特征在于,
所述精分離步驟中
所述用正相層析和反相層析相結(jié)合為氧化鋁層析和C18反相層析的 結(jié)合,正相層析用二氯甲垸甲醇體積比98: 2為流動(dòng)相;反相層析采用 C18預(yù)制柱、用含甲醇80%的醇水溶液作流動(dòng)相。
若需要更高純度可以用結(jié)晶的方法進(jìn)一步純化,最終到達(dá)純度大于 99. 5%的產(chǎn)品。
本發(fā)明先通過過濾方法將細(xì)胞和培養(yǎng)液分離,將細(xì)胞在超聲波輔助 下破碎后回加到原培養(yǎng)液中,用不同分子質(zhì)量截留值的聚合物膜進(jìn)行二 次膜分離,截留物用醇浸提并濃縮后,用大孔吸附樹脂富集產(chǎn)物;再利 用常規(guī)堿性氧化鋁正相層析和C18反相層析相結(jié)合對(duì)富集物進(jìn)一步分離, 得到純度大于98%的產(chǎn)物;本發(fā)明的關(guān)鍵在于分離純化紫杉醇的工藝中引 入了現(xiàn)代膜分離技術(shù),可大幅度縮小用于萃取的有機(jī)溶劑耗費(fèi)及大尺寸 萃取設(shè)備,同時(shí)減少了胞外紫杉醇的流失,降低成本和環(huán)境污染,并且 明顯提高原料的利用率。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l.紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液1L,經(jīng)HPLC檢測培養(yǎng)液中和細(xì)胞 內(nèi)共含紫杉醇25mg,
(1)將培養(yǎng)液用砂芯漏斗過濾,獲得約300ml濾渣,將濾渣用勻漿 機(jī)在5000 r/min的轉(zhuǎn)速下勻漿2min,破碎為勻漿,將勻漿后的糊狀流體 加入原濾液中,得到紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿。
(2)將上述懸浮勻漿通過孔徑10 pm的微孔濾膜,得到細(xì)胞殘片濾 渣和濾液,濾液先通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為20000的聚丙烯中空纖維 膜絲材料的超濾膜,流出的濾液再通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為2000的聚 丙烯中空纖維膜絲材料的超濾膜,操作為壓力0. lMPa,操作溫度為20°C, 濃縮倍數(shù)20倍,將細(xì)胞殘片濾渣和2次超濾膜上濃縮物合并,鮮重約86g 的固形物作為提取紫杉醇用;
(3) 將上述86g固形物放到3(TC溫度下烘干至含水量小于5%,稱 重,得到20.6g烘干品,研磨成粉末,加入甲醇,在常溫下用超聲波輔 助提取,過濾,回收濾液中的溶劑,得浸膏1.6g;
(4) 取國產(chǎn)D-401大孔吸附樹脂,濕法裝成1. 5X30cm的層析柱(徑 高比為1:20),用甲醇溶解上述浸膏,將樣品加載到大孔樹脂色譜柱頂(上 樣量為60mg浸膏/ g干樹脂),用體積百分比含甲醇20%的水溶液沖洗, 除去水溶性雜質(zhì)和色素,用體積百分比含甲醇80%的水溶液洗脫,收集 90ml的洗脫液,將洗脫液中的甲醇蒸干,加入等體積的二氯甲烷進(jìn)行液-液萃取,收集有機(jī)溶劑層,蒸干,得到0. 170g大孔樹脂柱富集紫杉醇粗 品;經(jīng)HPLC分析含紫杉醇14. 0% (23.8mg),紫杉醇收率為95.2%;
(5)將上述0.170g大孔樹脂柱分離粗品,用氧化鋁做填料、二氯甲烷 甲醇體積比為98: 2的洗脫液做流動(dòng)相的正相色譜,制備型C18預(yù)制柱 純化,用含甲醇80%的醇水溶液作流動(dòng)相洗脫,經(jīng)過蒸干溶劑,獲得純度 為98. 3%的精分離紫杉醇20. 6mg,收率,85%;將該品用2ml甲醇結(jié)晶,得到18. 2mg純度為99. 5%的紫杉醇純化品。
實(shí)施例2.紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液5L,經(jīng)HPLC檢測培養(yǎng)液中和細(xì)胞 內(nèi)共含紫杉醇130mg.
(1)將培養(yǎng)液用砂芯漏斗過濾,獲得約1.5L濾渣,將濾渣用勻漿 機(jī)在20000 r/min的轉(zhuǎn)速下勻漿lmin,破碎為勻漿,將勻漿后的糊狀流體 加入原濾液中,得到紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿。
(2)將上述懸浮勻漿通過孔徑10um的微孔濾膜,得到細(xì)胞殘片濾 渣和濾液,濾液先通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為15000的改性聚砜膜絲材 料超濾膜,流出的濾液再通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為1000的改性聚砜膜 絲材料超濾膜,操作為壓力0.4MPa,操作溫度為3(TC,濃縮倍數(shù)30倍, 將細(xì)胞殘片濾渣和2次超濾膜上濃縮物合并,鮮重約370g的固形物作為 提取紫杉醇用;
(3) 將上述370g固形物放到6(TC溫度下烘干至含水量小于5%,稱 重,得到24.5g烘干品,研磨成粉末,加入乙腈,在常溫下用超聲波輔 助提取,過濾,回收濾液中的溶劑,得浸膏8.1g;
(4) 取國產(chǎn)DK-110A大孔吸附樹脂,濕法裝成3.0X30cm的層析 柱(徑高比為l: 10),用乙醇溶解上述浸膏,將樣品加載到大孔樹脂色譜 柱頂,上樣量為80mg浸膏/ g干樹脂,用體積百分比含甲醇30%的水溶 液沖洗,除去水溶性雜質(zhì)和色素,用體積百分比含甲醇60%的水溶液洗 脫,收集600ml的洗脫液,將洗脫液中的甲醇蒸干,加入等體積的乙酸 乙酯進(jìn)行液-液萃取,收集有機(jī)溶劑層,蒸干,得到0. 960 g大孔樹脂柱 富集紫杉醇粗品;經(jīng)HPLC分析含紫杉醇12.2。/。 (117mg),紫杉醇收率為 90. 2%;
(5) 將上述0.960g大孔樹脂柱分離粗品,用堿性氧化鋁做填料、 二氯甲垸甲醇體積比為98: 2的洗脫液做流動(dòng)相的正相色譜,制備型C18預(yù)制柱純化,用含甲醇80%的醇水溶液作流動(dòng)相洗脫,經(jīng)過蒸干溶劑, 獲得純度為98.5%的精分離紫杉醇101.0mg,收率,85%;將該品用2ml 甲醇結(jié)晶,得到80. 8mg純度為99. 5%的紫杉醇純化品。
實(shí)施例3.紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液IOL,經(jīng)HPLC檢測培養(yǎng)液中和細(xì) 胞內(nèi)共含紫杉醇200mg.
(1)將培養(yǎng)液用砂芯漏斗過濾,獲得約3L濾渣,將濾渣用勻漿機(jī) 在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下勻漿2min,破碎為勻漿,將勻漿后的糊狀流體加 入原濾液中,得到紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿。
(2)將上述懸浮勻漿通過孔徑10um的微孔濾膜,得到細(xì)胞殘片濾 渣和濾液,濾液先通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為25000的聚丙烯中空纖維 膜絲材料超濾膜,流出的濾液再通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為5000的改性 聚丙烯中空纖維膜絲材料超濾膜,操作為壓力0. 3MPa,操作溫度為25°C, 濃縮倍數(shù)25倍,將細(xì)胞殘片濾渣和2次超濾膜上濃縮物合并,鮮重約750g 的固形物作為提取紫杉醇用;
(3) 將上述750g固形物放到50'C溫度下烘干至含水量小于5%,稱 重,得到50.1g烘干品,研磨成粉末,加入乙醇,在常溫下用超聲波輔 助提取,過濾,回收濾液中的溶劑,得浸膏16.7g;
(4) 取國產(chǎn)HD-2大孔吸附樹脂,濕法裝成3. 0X42cm的層析柱(徑 高比為l: 14),用甲醇溶解上述浸膏,將樣品加載到大孔樹脂色譜柱頂, 上樣量為70mg浸膏/ g干樹脂,用體積百分比含甲醇40%的水溶液沖洗, 除去水溶性雜質(zhì)和色素,用體積百分比含甲醇70%的水溶液洗脫,收集 700ml的洗脫液,將洗脫液中的甲醇蒸干,加入等體積的氯仿進(jìn)行液-液 萃取,收集有機(jī)溶劑層,蒸干,得到1.68g大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品; 經(jīng)HPLC分析含紫杉醇11.5。/。 (193.2mg),紫杉醇收率為96.6%;
(5) 將上述1.68g大孔樹脂柱分離粗品,用氧化鋁做填料、二氯甲垸甲醇體積比為98: 2的洗脫液做流動(dòng)相的正相色譜,制備型C18預(yù)制 柱純化,用含甲醇80%的醇水溶液作流動(dòng)相洗脫,經(jīng)過蒸干溶劑,獲得純 度為98. 1%的精分離紫杉醇167. 4mg,收率85%。
實(shí)施例4.紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液200L,經(jīng)HPLC檢測培養(yǎng)液中和細(xì) 胞內(nèi)共含紫杉醇5. Og.
(1)將培養(yǎng)液用工業(yè)板框過濾,獲得約67L濾渣,將濾渣用勻漿機(jī) 在5000r/min的轉(zhuǎn)速下勻漿3min,破碎為勻漿,將勻漿后的糊狀流體加入 原濾液中,得到紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿。
(2)將上述懸浮勻漿通過孔徑10Pm的微孔濾膜,得到細(xì)胞殘片濾 渣和濾液,濾液先通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為20000的改性聚砜膜絲材 料超濾膜,流出的濾液再通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為2000的改性聚砜膜 絲材料超濾膜,操作為壓力0.2MPa,操作溫度為3(TC,濃縮倍數(shù)10倍, 將細(xì)胞殘片濾渣和2次超濾膜上濃縮物合并,鮮重約14.8 Kg的固形物
作為提取紫杉醇用;
(3) 將上述14.8Kg固形物放到60°C溫度下烘干至含水量小于5%, 稱重,得到1000.8g烘干品,研磨成粉末,加入體積比為9"甲醇與二 氯甲垸的混合物,在常溫下用超聲波輔助提取,過濾,回收濾液中的溶 劑,得浸膏330g;
(4) 取國產(chǎn)D-401大孔吸附樹脂,濕法裝成18cmX 180cm的層析柱 (徑高比為l: 10),用甲醇溶解上述浸膏,將樣品加載到大孔樹脂色譜柱 頂,上樣量為80mg浸膏/ g干樹脂,用體積百分比含甲醇20%的水溶液 沖洗,除去水溶性雜質(zhì)和色素,用體積百分比含甲醇80%的水溶液洗脫, 收集90ml的洗脫液,將洗脫液中的甲醇蒸干,加入等體積的二氯甲垸進(jìn) 行液-液萃取,收集有機(jī)溶劑層,蒸干,得到32. 8g大孔樹脂柱富集紫杉 醇粗品;經(jīng)HPLC分析含紫杉醇12.9。/0 (4. 23g),紫杉醇收率為85%;(5)將上述32.8g大孔樹脂柱分離粗品,用氧化鋁做填料、二氯甲 烷甲醇體積比為98: 2的洗脫液做流動(dòng)相的正相色譜,制備型C18預(yù)制 柱純化,用含甲醇80%的醇水溶液作流動(dòng)相洗脫,經(jīng)過蒸干溶劑,獲得純 度為98. 0%的精分離紫杉醇3. 67g,收率85%。
實(shí)施例5.紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液500 L,經(jīng)HPLC檢測培養(yǎng)液中和 細(xì)胞內(nèi)共含紫杉醇13g.
(1)將培養(yǎng)液用工業(yè)板框過濾,獲得約170L濾渣,將濾渣用勻漿 機(jī)在5000的轉(zhuǎn)速下勻漿2 min,破碎為勻漿,將勻槳后的糊狀流體加入原 濾液中,得到紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿。 '
(2)按實(shí)施例4的步驟(2)得到鮮重約12. 6 Kg的固形物作為提取 紫杉醇用;
(3) 將上述12.6Kg固形物放到60°C溫度下烘干至含水量小于5%, 稱重,得到烘千品,研磨成粉末,加入體積比為1:9甲醇與二氯甲垸的 混合物,在常溫下用超聲波輔助提取,過濾,回收濾液中的溶劑,得浸 膏840g;
(4) 將浸膏840g分兩次按實(shí)施例4的步驟(4)進(jìn)行大孔吸附樹 脂富集步驟,得到94.5g大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品;經(jīng)HPLC分析含紫 杉醇11.0% (10.4g),紫杉醇收率為80.2%;
(5) 將上述94.5g大孔樹脂柱分離粗品按實(shí)施例4 (5)的步驟,獲 得純度為98. 0%的精分離紫杉醇10. lg,收率,85%;將該品用100ml甲 醇結(jié)晶,得到8. lg純度為99.5。/。的紫杉醇純化品;紫杉醇總收率62.0%。
權(quán)利要求
1.一種從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法,包括(1)細(xì)胞勻漿步驟將收獲期的紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液過濾,分離細(xì)胞與培養(yǎng)液,用勻漿機(jī)將細(xì)胞破碎為勻漿,然后加入原培養(yǎng)液中,獲得紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿;(2)膜分離步驟將紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿先通過孔徑小于等于10μm的濾膜過濾,得到細(xì)胞殘片濾渣和濾液;濾液通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為15000~25000的超濾膜過濾;流出的濾液再通過相對(duì)分子質(zhì)量截留值為1000~5000的超濾膜過濾,后兩次超濾膜過濾壓力為0.1-0.4MPa,溫度為20℃~30℃,后兩次超濾膜過濾后濾液濃縮倍數(shù)10-30倍,將細(xì)胞殘片濾渣和后兩次超濾膜上濃縮物合并,得到膜分離截留物;(3)紫杉醇提取步驟將膜分離截留物在30℃~60℃溫度下烘干至含水量小于5%,研磨成粉末,加入提取溶劑,在常溫下用超聲波輔助提取,過濾,回收濾液溶劑,得浸膏;(4)大孔吸附樹脂富集步驟用甲醇或乙醇溶解浸膏,加載到大孔樹脂柱上,用體積百分比含甲醇20%~40%的水溶液沖洗,除去水溶性雜質(zhì)和色素,用體積百分比含甲醇60%~80%的水溶液洗脫,收集3倍柱體積的洗脫液,將洗脫液中的甲醇蒸干,加入等體積的萃取溶劑進(jìn)行液-液萃取,收集有機(jī)溶劑層,蒸干,得到大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品;(5)精分離步驟用正相層析和反相層析相結(jié)合對(duì)紫杉醇粗品進(jìn)行分離,得到純度大于98%的紫杉醇。
2. 如權(quán)利要求1所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法, 其特征在于,所述細(xì)胞勻漿步驟的過程為將培養(yǎng)液用砂芯漏斗或工業(yè) 板框過濾,分離細(xì)胞與培養(yǎng)液,用勻漿機(jī)在5000 20000 r/min的轉(zhuǎn)速下將細(xì)胞破碎為勻漿,破碎時(shí)間1 3min,將勻漿后的糊狀流體加入原培 養(yǎng)液中,得到紅豆杉細(xì)胞懸浮勻漿。
3. 如權(quán)利要求1所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法, 其特征在于所述膜分離步驟中,所述分子量截留值為15000 25000的 超濾膜和分子量截留值1000 5000的超濾膜材料采用聚丙烯中空纖維膜 絲材料或者改性聚砜膜絲材料。
4. 如權(quán)利要求1所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法, 其特征在于-所述紫杉醇提取步驟中,所述提取溶劑為甲醇、乙腈、乙醇、二氯 甲烷中的一種,或者是體積比為9:1或1:9的甲醇與二氯甲烷的混合物。
5. 如權(quán)利要求1所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法, 其特征在于,所述大孔吸附樹脂富集步驟中.-所述萃取溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚中的一種; 所述大孔樹脂柱內(nèi)的吸附樹脂為國產(chǎn)D-401, DK-110A, HD-2的一種;所述大孔樹脂柱徑高比為為l: 10 1:20,上樣量為60mg 80mg 浸膏/ g干樹脂。
6. 如權(quán)利要求1所述的從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法, 其特征在于,所述精分離步驟中所述用正相層析和反相層析相結(jié)合為氧化鋁層析和C18反相層析的 結(jié)合,正相層析用二氯甲垸甲醇體積比98: 2為流動(dòng)相;反相層析采用 C18預(yù)制柱、用含甲醇80%的醇水溶液作流動(dòng)相。
全文摘要
從紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法,屬于天然藥物化學(xué)物質(zhì)或藥品原料的制造方法,目的在于減少胞外紫杉醇的流失,提高原料利用率,降低成本和環(huán)境污染。本發(fā)明包括(1)細(xì)胞勻漿步驟,(2)膜分離步驟,(3)紫杉醇提取步驟,(4)大孔吸附樹脂富集步驟,(5)精分離步驟,得到純度大于98%的紫杉醇。本發(fā)明在分離純化紫杉醇的工藝中引入了現(xiàn)代膜分離技術(shù),可大幅度縮小用于萃取的有機(jī)溶劑耗費(fèi)及大尺寸萃取設(shè)備,同時(shí)減少了胞外紫杉醇的流失,降低成本和環(huán)境污染,并且明顯提高原料的利用率。
文檔編號(hào)C07D305/14GK101314597SQ20081004827
公開日2008年12月3日 申請日期2008年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者付春華, 余龍江, 李麗琴, 趙春芳, 鄢又玉, 金文聞 申請人:華中科技大學(xué)
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