專利名稱：亞克隆細(xì)胞株tf-1-a2及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一株用于定量檢測(cè)神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性的TF-I亞克隆穩(wěn)定細(xì)胞株TF-1-A2，其制備方法以及其在NGF制品生物學(xué)活性的測(cè)定上的用途。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，大量的基因工程藥物不斷進(jìn)入臨床和生產(chǎn)。由于基因工程藥物不同于一般的化學(xué)藥品，它大多是多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)，來源于活的生物體，具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，在生產(chǎn)過程中容易受到各種理化條件等的影響，因此，對(duì)于此類產(chǎn)品要從各個(gè)方面進(jìn)行全面的、嚴(yán)格的質(zhì)量控制。對(duì)于細(xì)胞因子類生物制品來說，由于其化學(xué)本質(zhì)為多肽或蛋白質(zhì)，其活性由產(chǎn)品的氨基酸序列、氨基酸序列的翻譯后修飾及其空間結(jié)構(gòu)決定，其活性效價(jià)和其絕對(duì)質(zhì)量不一致，所以也就不能按化學(xué)藥品那樣直接用重量單位來決定。此類產(chǎn)品的生物學(xué)活性與藥效學(xué)基本一致，是藥效學(xué)的直觀反映，利用這類制品的特定生物學(xué)活性建立特定的測(cè)定效價(jià)體系，定出其效價(jià)單位，是保證產(chǎn)品藥效的重要手段和質(zhì)量控制的重要組成部分和關(guān)鍵指標(biāo)(王軍志主編，生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制(第二版)，北京科學(xué)出版社，2007)。由于細(xì)胞因子類生物制品的生物學(xué)活性的降低或喪失，通常并不表現(xiàn)為物理化學(xué)性質(zhì)的改變，無法使用常規(guī)檢測(cè)方法來測(cè)定，目前最常用的方法是利用分離的器官和組織、原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞系的體外測(cè)定法。而基于連續(xù)生長(zhǎng)、因子依賴的、克隆化的細(xì)胞系的體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法，由于具有測(cè)定結(jié)果精確、可以定量、重現(xiàn)性好、經(jīng)濟(jì)、容易使用和便于統(tǒng)計(jì)分析的優(yōu)點(diǎn)得到廣泛的應(yīng)用(Kitamura T, Tange T, Terasawa T et al. Establishmentand characterisation of a unique human cell line which proliferates dependentlyon GM-CSF, IL3 and erythropoietin. J. Cell. Physiol. 1989 ；140 323-334.;賈菌，周興軍，王輝，等.MTT法測(cè)定三種基因工程細(xì)胞因子生物學(xué)活性方法研究.中國(guó)生化藥物雜志.2000,21(1) 8-11.;沈世燁.TF-I細(xì)胞饑餓在IL-4生物學(xué)活性測(cè)定中的應(yīng)用.海峽藥學(xué)· 2006，18 (5) =69-70.;袁力勇，饒春明，李響，等· GM-CSF/IL-3融合蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究和建立.藥物分析雜志.2008,28(10) =1605-1608.) ο目前利用體外細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行活性測(cè)定的產(chǎn)品有G-CSF(NFS-60 細(xì)胞)、GM-CSF(TF-1 細(xì)胞)、EGF(3T3 細(xì)胞)、IL-2 (CTLL-2細(xì)胞)、IL-3 和 GM-CSF/IL-3 融合蛋白(Mo7E，TF-1 細(xì)胞)、IL_6(7TD1，B9-11 細(xì)胞)和IL-Il (T-10細(xì)胞)等(國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典.2010年版，三部.附錄X D, E，F(xiàn)，G，H ;王軍志主編.生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制.第二版，北京科學(xué)出版社，2007)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)是一種對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分化、新陳代謝等方面具有重要調(diào)控作用的活性多肽，作為藥品在醫(yī)學(xué)上有著廣泛用途(Sun WJ,Sun CK, Lin H, et al. The effect of collagen-binding NGF-beta on the promotionof sciatic nerve regeneration in a rat sciatic nerve crush injury model.Biomaterials, 2009 ；30(27) =4649-4656.)。NGF已從小鼠頜下腺、豚鼠、兔、牛前列腺、公牛精液、人胎盤和蛇毒等組織器官中分離純化獲得。目前國(guó)內(nèi)NGF藥品質(zhì)量檢測(cè)，其生物活性測(cè)定方法主要為雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法，需要分離雞胚背根神經(jīng)節(jié)，操作繁瑣，且準(zhǔn)確性差，主觀影響因素大(黃玉輝，徐天瑞，龔毅.雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測(cè)定神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性的條件優(yōu)化.細(xì)胞生物學(xué)雜志.2003，25 (4) :251-253.)。而近年來報(bào)道比較多的是PC12細(xì)胞體外培養(yǎng)法，包括PC12細(xì)胞分化法和PC12細(xì)胞增值法，前者根據(jù)NGF誘導(dǎo)PC12分化的陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)的個(gè)數(shù)判斷NGF活性，后者是根據(jù)無血清情況下NGF促進(jìn)PC12細(xì)胞增值能力(董躍偉，徐天瑞，熊郁良，等.PC12細(xì)胞定性及定量測(cè)定神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性的新方法.華西藥學(xué)雜志.1999,14(5-6) :311_314.)。用PC12細(xì)胞培養(yǎng)法，實(shí)驗(yàn)條件要求高，主觀因素影響大，且PC12細(xì)胞較難培養(yǎng)，培養(yǎng)過程會(huì)出現(xiàn)分化情況，很難保證不同代次之間的反應(yīng)性一致；不同的PC12細(xì)胞亞系有不同的生物學(xué)特性，對(duì)NGF的敏感度也不同(駱鵬，譚亞軍，田霖，等.PC12細(xì)胞體外培養(yǎng)法測(cè)定蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性.中國(guó)生物制品學(xué)雜志.2006，19(5) :524-526.)。因此到目前為止，由于沒有合適的生物學(xué)活性測(cè)定方法，小鼠神經(jīng)生長(zhǎng) 因子(Mouse nerve growth factor,mNGF)的生物學(xué)活性測(cè)定方法仍未載入藥典,NGF國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品也仍未建立。TFl細(xì)胞是一種GM-CSF依賴性的人紅系白血病細(xì)胞，在無GM-CSF存在下，不能維持正常的增殖。但其表面表達(dá)GM-CSF、IL-3、EPO等造血生長(zhǎng)因子受體和高親和力NGF受體 TrkA, NGF 能夠與 TrkA 結(jié)合(Kitamura T, Tange T, Terasawa T et al. Establishmentand characterisation of a unique human cell line which proliferates dependentlyon GM-CSF IL3 and erythropoietin. J. Cell. Physiol. 1989 ；140 323-334. ；ChevalierS, Praloran V, Smith C, et al. Expression and functionality of the trk Aproto-oncogene product/NGF receptor in undifferentiated hematopoietic cells.Blood. 1994，83 (6) : 1479-1485.)。TrkA作為NGF的高親和力受體，結(jié)合NGF后形成二聚體，激活受體胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶區(qū)，引起相應(yīng)的酪氨酸磷酸化，繼而激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)執(zhí)行調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的功能，從而誘導(dǎo)TF-I增值。因此，可以利用NGF誘導(dǎo)TFl增值來檢測(cè)NGF生物學(xué)活性(俞萍，趙強(qiáng)，柳川，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子體外生物學(xué)活性測(cè)定國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法的初步建立.中國(guó)生化藥物雜志，1999，20 (4) 196-197.;韓春梅，于雷，范文紅，等.TFl細(xì)胞增殖法測(cè)定鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(mNGF)生物學(xué)活性.2010年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十屆中國(guó)藥師周論文集.)。然而，在應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn)，由于GM-CSF對(duì)GM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞刺激生長(zhǎng)的效應(yīng)很強(qiáng)，在使用GM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞進(jìn)行NGF生物學(xué)活性測(cè)定時(shí)，必須反復(fù)調(diào)整GM-CSF的使用濃度，只有這樣才能在適當(dāng)?shù)腉M-CSF濃度下使NGF促進(jìn)TF-I細(xì)胞的生長(zhǎng)的作用體現(xiàn)出來，但是存在操作復(fù)雜、信噪比低和結(jié)果偏差大的問題。更為重要的是，往往由于GM-CSF活性較強(qiáng)掩蓋了 NGF的促增值效應(yīng)，很難保證結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株檢測(cè)神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性的TF-I單克隆細(xì)胞株及其制備方法和用途，該TF-I單克隆株及該優(yōu)化的檢測(cè)方法能較靈敏地檢測(cè)神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性。一種篩選亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2的方法，包括如下步驟
I)利用NGF對(duì)rhGM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞株進(jìn)行馴化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕾嘚GF維持正常生長(zhǎng)TF-I細(xì)胞株，2)對(duì)NGF依賴的TF-I細(xì)胞株進(jìn)行克隆化，挑選單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，3)繪制各單克隆細(xì)胞株對(duì)NGF的劑量-效應(yīng)曲線，根據(jù)Emax值和信噪比對(duì)得到的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行篩選，獲得TF-1-A2亞克隆細(xì)胞株。所述NGF為小鼠NGF。所述克隆化的方法為半固體培養(yǎng)基克隆化法。所述半固體培養(yǎng)基為甲基纖維素類培養(yǎng)基。所述馴化是在一定濃度的NGF存在下，通過倍比稀釋逐步降低GM-CSF濃度并連續(xù)傳代的方法將GM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞馴化為NGF依賴的TF-I細(xì)胞。所述馴化培養(yǎng)基為終濃度為25ng/ml的mNGF的，含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，調(diào)整活細(xì)胞濃度按IXlO5ceIls/孔接種至培養(yǎng)板，依次向孔板中添加含有按I 2的比例倍比稀釋的濃度梯度的rhGM-CSF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，馴化五代即可。上述方法得到的亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2。所述的亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 5969。所述的亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2在體外定量測(cè)定NGF生物學(xué)活性中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用，所述NGF為小鼠NGF或重組人NGF。所述的應(yīng)用，所述定量測(cè)定方法包括如下步驟A、檢測(cè)起始孔濃度為200ng/ml,進(jìn)行4倍系列稀釋，共9個(gè)稀釋度，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔板中；B、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mNGF依賴的TF-1-A2細(xì)胞，于IOOOrpm離心IOmin收集細(xì)胞，用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌，然后重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度5X IO4個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，孔板中每孔加入100μ I ;C、將細(xì)胞培養(yǎng)板于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)分別培養(yǎng)72h后，每孔加入MTS/PMS溶液20μ 1，于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，D、取出利用BioTek公司的EPOCH超微量微孔板分光光度計(jì)于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度；E、使用GraphPad Prism5軟件分析數(shù)據(jù)，利用四參數(shù)方程繪制劑量_效應(yīng)反應(yīng)曲線，通過待測(cè)制品的吸光度，計(jì)算出待測(cè)NGF的生物學(xué)活性。本發(fā)明利用NGF對(duì)rhGM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞株進(jìn)行馴化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕾嘚GF維持正常生長(zhǎng)TF-I細(xì)胞株，利用半固體培養(yǎng)基對(duì)TF-I依賴NGF混合細(xì)胞株進(jìn)行克隆化，克隆化得到TF-I單克隆細(xì)胞株后對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行篩選，繪制劑量-效應(yīng)曲線，根據(jù)Emax值和信噪比進(jìn)行篩選，并篩選得到了一株亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2，用其檢測(cè)NGF生物學(xué)活性，并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2，可用于NGF生物學(xué)活性的定量檢測(cè)。本發(fā)明得到的TF-I單克隆細(xì)胞株易于培養(yǎng)，傳代穩(wěn)定性好、對(duì)NGF敏感，測(cè)定時(shí)背景較低，信噪比高，對(duì)NGF有陡峭的、可重復(fù)的劑量-效應(yīng)曲線，具有信噪比高、重現(xiàn)性好、操作方便、可精確定量和便于統(tǒng)計(jì)分析比活性等優(yōu)點(diǎn)，可用于建立標(biāo)準(zhǔn)的NGF生物學(xué)活性測(cè)定方法標(biāo)定NGF制品的活性，做為NGF制品生產(chǎn)中進(jìn)行質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)，適合在神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性檢測(cè)中使用。亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 5969。、
分類命名人紅系白血病細(xì)胞株保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)保藏時(shí)間2012年4月12日


圖I.馴化后的NGF依賴的TF-I細(xì)胞對(duì)mNGF的劑量-效應(yīng)曲線，圖2.甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法克隆化NGF依賴的TF-I細(xì)胞(100X)A :培養(yǎng)第4天的細(xì)胞；B :培養(yǎng)第8天的單克隆細(xì)胞團(tuán)；C :培養(yǎng)第10天單克隆細(xì)胞團(tuán)圖3. 5株NGF依賴的TF-I亞克隆細(xì)胞對(duì)鼠NGF的劑量-效應(yīng)曲線，圖4. TF-1-A2細(xì)胞最佳使用密度的優(yōu)化，圖5. TF-1-A2細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化，圖6. TF-1-A2細(xì)胞檢測(cè)鼠NGF和rhNGF制品生物學(xué)活性。具體實(shí)施方法本發(fā)明更詳細(xì)的實(shí)施方法參見實(shí)施例，本實(shí)施例是用于解釋、說明而不是以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的GM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞株、小鼠NGF和化學(xué)試劑均為市售產(chǎn)品，重組人NGF制品為本公司表達(dá)并純化。實(shí)施例I :GM-CSF依賴的TF-1細(xì)胞的馴化I. GM-CSF依賴的TF-1細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)GM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，使用含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，添加終濃度為8ng/ml的rhGM-CSF進(jìn)行維持培養(yǎng)。細(xì)胞濃度保持在3X 104-5X 105cells/ml左右，于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)，2-3天換液I次。2. GM-CSF依賴的TF-1細(xì)胞的馴化在一定濃度的NGF存在下，通過倍比稀釋逐步降低GM-CSF濃度并連續(xù)傳代的方法將GM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞馴化為NGF依賴的TF-I細(xì)胞。具體馴化方法為以添加了終濃度為25ng/ml的mNGF的，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基為馴化培養(yǎng)基，調(diào)整活細(xì)胞濃度按I X IO5Cells/孔接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。然后依次向6孔板的6個(gè)孔中添加含有按I : 2的比例倍比稀釋6個(gè)濃度梯度的rhGM-CSF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使第I孔中的rhGM-CSF的終濃度為lng/ml，第2孔中的rhGM-CSF的終濃度為O. 5ng/ml，余下各孔依此類推。然后，將6孔板置于37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)，于72h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并測(cè)定細(xì)胞活力，調(diào)整活細(xì)胞濃度按IX IO5ceIls/孔接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，馴化過程如表I所示。結(jié)果表明，馴化第一代時(shí)在最低的rhGM-CSF濃度下(O. 03125ng/ml)，即使有高濃度的mNGF存在細(xì)胞活力仍有較大幅度的下降，細(xì)胞活力下降為50%左右。而后，隨著傳代次數(shù)的增多細(xì)胞活力逐漸恢復(fù)。馴化至第5代時(shí)，在最低濃度的rhGM-CSF (O. 03125ng/ml)存在下細(xì)胞活力已恢復(fù)至100%。此時(shí)使用添加了終濃度為25ng/ml的mNGF的，含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基將6孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，完全去掉了培養(yǎng)基中的rhGM-CSF,細(xì)胞也能夠維持正常生長(zhǎng)，此時(shí)rhGM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞已經(jīng)馴化為mNGF依賴的TF-I細(xì)胞。然后，以含25ng/ml的mNGF的，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基連續(xù)傳代2個(gè)月以上，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，對(duì)mNGF維持良好的反應(yīng)性。表IGM-CSF依賴的TF-1細(xì)胞馴化結(jié)果
EjjllrhGM-CSF 濃度(ng/ml) 化10.50.250.1250.06250.03125
細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞ix 密度*活力密度*活力密度*活力密度*活力密度*活力密度*活力
1492.3%492.3%2.492.3%284.6%250%250%
2696%398%396%386%680%961%
3495%495%2.497%295%295%295%
4698.4%398%390%390%695%990%
54100%4100%2.4100%2100%2100%2100%*細(xì)胞密度單位χ105個(gè)細(xì)胞/ml3. mNGF依賴的TF-I細(xì)胞的劑量-效應(yīng)反應(yīng)曲線使用MTS/PMS 法(CellTiter 96 Aqueous 試劑，Promega 公司)測(cè)定 mNGF 依賴的TF-I細(xì)胞對(duì)NGF的劑量-效應(yīng)反應(yīng)曲線，判斷其是否可用于NGF生物活性測(cè)定。具體操作方法為I)樣品的制備取市售注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子I支(規(guī)格30ug，生物學(xué)活性^ 15000AU/支)用2ml PBS溶解作為儲(chǔ)存液，_20°C保存?zhèn)溆谩z測(cè)起始孔濃度為200ng/ml，進(jìn)行4倍系列稀釋，共9個(gè)稀釋度，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔100 μ 1，另選擇3個(gè)孔加入陰性對(duì)照溶液(不含NGF的RPMI 1640完全培養(yǎng)基)。2)加入細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mNGF依賴的TF-I細(xì)胞，于IOOOrpm離心IOmin收集細(xì)胞，用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌2次，然后重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X IO4個(gè)細(xì)胞/ml，向步驟一制備的96孔板中每孔加入100 μ 1，每個(gè)濃度加3個(gè)復(fù)孔；3)測(cè)定法將上述制備的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)72h后，每孔加入MTS/PMS溶液20μ 1，于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，取出利用BioTek公司的EPOCH超微量微孔板分光光度計(jì)于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度；5)數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 5軟件分析數(shù)據(jù)，利用四參數(shù)方程繪制劑量-效應(yīng)反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖I所示。結(jié)果表明，馴化后所獲得的NGF依賴的TF-I細(xì)胞對(duì)NGF敏感，測(cè)定時(shí)背景較低，信噪比(Signal/Noise值，即S/N值)高(> I. 9)，對(duì)NGF有陸峭的、可重復(fù)的劑量-效應(yīng)曲線。而且，該細(xì)胞體外連續(xù)傳代2個(gè)月以上，依然對(duì)NGF保持有良好的反應(yīng)性，測(cè)定NGF活性時(shí)劑量-效應(yīng)曲線良好，表明其易于培養(yǎng)，傳代穩(wěn)定性好，適合進(jìn)一步克隆化挑選單克隆細(xì)胞株。實(shí)施例2 =NGF依賴的TF-I細(xì)胞的克隆化利用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基對(duì)已經(jīng)馴化的mNGF依賴的TF-I細(xì)胞進(jìn)行克隆化，具體方法為I)所使用的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基為METHOCULT H4100(Stem cell公司，Catalog#04100)甲基纖維素濃縮液(濃度為2. 6%，_20°C保存?zhèn)溆?，使用前置4°C充分融化。加入含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液和mNGF與其充分混合進(jìn)行2. 5倍稀釋，使mNGF終濃度為25ng/ml，甲基纖維素終濃度為I. 0% ;2)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mNGF依賴的TF-I細(xì)胞，于IOOOrpm離心IOmin收集細(xì)胞，重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至為2 X IO4個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液；3)取Iml稀釋好的細(xì)胞懸液(2X104個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)入預(yù)混的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，用帶16號(hào)平頭針頭的25ml注射器反復(fù)輕柔吹吸使其完全混勻，然后室溫靜置5-10min,除掉氣泡，此時(shí)NGF依賴的TF-I細(xì)胞終濃度為200個(gè)細(xì)胞/ml ；4)用帶16號(hào)平頭針頭的25ml注射器分裝混有甲基纖維素培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液，每 個(gè)60mm培養(yǎng)皿加入5ml，放入37°C，5% CO2條件下靜置培養(yǎng)，注意平拿平放，不要經(jīng)常移動(dòng)；5)分別在第4天、第8天和第10天時(shí)于倒置生物顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果如圖2所示，第4天時(shí)鏡下便可觀察到單克隆細(xì)胞團(tuán)，第10天時(shí)用肉眼即可觀察到平皿上的單克隆細(xì)胞團(tuán)。于倒置顯微鏡下鏡檢，標(biāo)記分散良好、周圍沒有其它克隆的單克隆細(xì)胞團(tuán)，挑取單個(gè)細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)用含有終濃度為25ng/ml mNGF的10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。待長(zhǎng)滿96孔板的孔底后，依次轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和T75培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)過2次克隆化，共挑選50個(gè)單克隆細(xì)胞團(tuán)至96孔板中，其中15株單克隆細(xì)胞株得到有效擴(kuò)增。待15株單克隆細(xì)胞擴(kuò)增至足夠數(shù)量后，將細(xì)胞株及時(shí)凍存并分別制備這15株亞克隆細(xì)胞株對(duì)NGF的劑量-效應(yīng)曲線，挑選背景較低、信噪比高以及對(duì)NGF有陡峭的、可重復(fù)的劑量-效應(yīng)曲線的細(xì)胞株用于NGF定量測(cè)定。實(shí)施例3 =NGF依賴的TF-I單克隆株的篩選按照實(shí)施例I中所述的方法，分別繪制甲基纖維素半固體培養(yǎng)基克隆化所獲得的15株單克隆細(xì)胞株的劑量-效應(yīng)反應(yīng)曲線，計(jì)算細(xì)胞的最大增值效應(yīng)(Maximal effect,Emax)區(qū)間和信噪比，結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2數(shù)據(jù)和劑量-效應(yīng)反應(yīng)曲線，挑選曲線良好的細(xì)胞株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存建立細(xì)胞庫(kù)。表215株TF-I單克隆細(xì)胞株的篩選結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種篩選亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2的方法，包括如下步驟 4)利用NGF對(duì)rhGM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞株進(jìn)行馴化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕾嘚GF維持正常生長(zhǎng)TF-I細(xì)胞株， 5)對(duì)NGF依賴的TF-I細(xì)胞株進(jìn)行克隆化，挑選單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)， 6)繪制各單克隆細(xì)胞株對(duì)NGF的劑量-效應(yīng)曲線，根據(jù)Emax值和信噪比S/N值對(duì)得到的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行篩選，獲得TF-1-A2亞克隆細(xì)胞株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述NGF為小鼠NGF。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述克隆化的方法為半固體培養(yǎng)基克隆化法。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述半固體培養(yǎng)基為甲基纖維素類培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述馴化是在一定濃度的NGF存在下，通過倍比稀釋逐步降低GM-CSF濃度并連續(xù)傳代的方法將GM-CSF依賴的TF-I細(xì)胞馴化為NGF依賴的TF-I細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述馴化培養(yǎng)基為終濃度為25ng/ml的mNGF的，含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，調(diào)整活細(xì)胞濃度按I X IO5ceIls/孔接種至培養(yǎng)板，依次向孔板中添加含有按I : 2的比例倍比稀釋的濃度梯度的rhGM-CSF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，馴化五代即可。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述方法得到的亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2。
8.權(quán)利要求7所述的亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2，其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 5969。
9.權(quán)利要求7或8所述的亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2在體外定量測(cè)定NGF生物學(xué)活性中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，所述NGF為小鼠NGF或重組人NGF。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，所述定量測(cè)定的方法包括如下步驟:A、檢測(cè)起始孔濃度為200ng/ml，進(jìn)行4倍系列稀釋，共9個(gè)稀釋度，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔板中；B、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mNGF依賴的TF-1-A2細(xì)胞，于IOOOrpm離心IOmin收集細(xì)胞，用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌，然后重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度5X104個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，孔板中每孔加入100μ I ;C、將細(xì)胞培養(yǎng)板于37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)分別培養(yǎng)72h后，每孔加入MTS/PMS溶液20 μ 1，于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，D、取出利用BioTek公司的EPOCH超微量微孔板分光光度計(jì)于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度；E、使用GraphPad Prism5軟件分析數(shù)據(jù)，利用四參數(shù)方程繪制劑量-效應(yīng)反應(yīng)曲線，通過待測(cè)制品的吸光度，計(jì)算出待測(cè)NGF的生物學(xué)活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及“亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2及其制備方法與用途”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。TF-1-A2亞克隆穩(wěn)定細(xì)胞株的制備方法，包括將GM-CSF依賴的TF-1細(xì)胞馴化為NGF依賴株；對(duì)誘導(dǎo)后的NGF依賴的TF-1細(xì)胞進(jìn)行甲基纖維素半固體培養(yǎng)基克隆化；從半固體培養(yǎng)基中挑取單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)；制備各單克隆細(xì)胞株對(duì)NGF的劑量-效應(yīng)曲線，篩選獲得亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2。本發(fā)明得到的TF-1-A2亞克隆細(xì)胞株對(duì)NGF高度敏感且有良好的反應(yīng)性，連續(xù)傳代穩(wěn)定性好。利用TF-1-A2亞克隆細(xì)胞株建立的TF-1細(xì)胞增值法，用于體外定量測(cè)定神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物學(xué)活性，信噪比高，重復(fù)性好，優(yōu)于現(xiàn)有方法。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102660505SQ20121011940
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者樂偉, 劉荷中, 史權(quán)威, 李曼, 霍立紅 申請(qǐng)人:北京華安科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司