穩(wěn)定分泌近紅外熒光標記外泌體的乳腺癌細胞株的制備
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物標記領域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定分泌近紅外熒光標記外泌體的乳腺癌細胞株的制備。
【背景技術】
[0002]1986年，有學者在體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中發(fā)現了一種有膜結構的小囊泡，被稱之為外泌體。至1996年，有學者發(fā)現EB病毒轉化的人B細胞內一些有膜結構的小囊泡表面可表達主要組織相容性復合體(major histocompatibility comp I ex, MHC) Π類分子，能激活T細胞，并與紅細胞內外泌體的形成過程和排出途徑相似(參見Van Niel G,Porto-Carreiro I，Simoes S,Raposo G.Exosomes: a common pathway for aspecialized funct1n.J B1chem2006，140:13?21)，自此之后，人們開始對外泌體展開廣泛的研究。外泌體是由活細胞分泌的來源于晚期核內體(也稱為多囊泡體)的直徑為30?120nm的膜性囊泡(參見Stoorvogel WjKlei jmeer MJ , Geuze HJ , Raposo G.Theb1genesis and funct1ns of exosomes.Traffic 2002，3:321 ?330)。目前的研究方向主要有干細胞、免疫、microRNA和靶向給藥。2013年諾貝爾生物/醫(yī)學獎授予了三位在細胞囊泡方面貢獻突出的科學家，推動外泌體的研究達到全新的高度。
[0003]各種不同種類的細胞、組織、器官和系統(tǒng)相互協調、共同維持著我們復雜機體的正常運行(參見J.Skog，T.Wiirdinger，S.van RijnjD-H-MeijerjL-Gainche,M.Sena-Esteves,ff.T.Curry Jr.,B.S.Carter,A-M-KrichevskyjX-O-BreakefieldjGl1blastomamicrovesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth andprovide diagnostic b1markers,Nat.CelI B1l.2008，10:1470?1476) D這與細胞之間的信息傳遞是密切相關的，而細胞之間的信息傳遞，最主要是由細胞自己制造和釋放的某些特定化學物質來實現的，例如外泌體。當機體處于不正常狀態(tài)，例如疾病(癌癥)發(fā)生時，就會釋放一些信號物質來調節(jié)身體機能來適應變化。這時，外泌體作為這些信號物質中的一員，就起了非常大的作用(參見merican Cancer Society ,Global Cancer Facts&Figures ,2nd Edit1n American Cancer Society ,Atlanta，2011)。外泌體含有蛋白質，mRNA，miRNA等信號分子，它們反映分泌細胞的生理狀態(tài)和功能狀態(tài)，甚至還會包含細胞病態(tài)相關的分子信息，從而提供了豐富的潛在的生物標志物分子源(參見Yu SiCao HiShenB，Feng JTumor-derived exosomes in cancer progress1n and treatmentfailure.0ncotarget.2015,7:10?18)。關于外泌體作為生物標志物來研究細胞之間的信號傳遞已成為細胞生物學、分子生物學和醫(yī)學領域的研究熱點之一.細胞信號傳遞與腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預防直接相關(參見Simons MjRaposo GjExosomes-Vesicularcarriers for intercellular communicat1n.Curr Opin Cell B1l 2009,21:575?581)。因此，外泌體的研究將在癌癥的診斷及治療等領域發(fā)揮重要作用。
[0004]近紅外焚光蛋白(Near-1nfraredfluorescent protein，iRFP)是綠色焚光蛋白同源的一類熒光蛋白，具備綠色熒光蛋白的發(fā)光優(yōu)點(參見Mikhail BalobanjDariaM.Shcherbakova，Vladislav V.Verkhusha,Two-Color Imaging using SpectralVariants of iRFP670 and iRFP682Near_Infrared Fluorescent Proteins,B1physicalJournal，2015，108:624-631)。但是，相比于GFP，它的激發(fā)光和發(fā)射光波長更長，位于近紅外光區(qū)(650?900nm)，在動物組織中光吸收和光散射較低，有較高的穿透性，更適宜于動物活體組織的深層成像，是活體成像更為理想的熒光標記分子(參見Grigory S.Filonov,Vladislav V.Verkhusha1A Near-1nfrared BiFC Reporter for In Vivo Imaging ofProtein-Protein Interact1ns Original Research Article Chemistry&B1logy,2013，20:1078-1086)。近紅外熒光蛋白丨1^?682的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為66311111和682nm，是單體熒光蛋白分子，其發(fā)光性質較為穩(wěn)定，較長的光譜特點使其在活體動物組織成像的應用中更具潛力。
[0005]由此，若能將外泌體的獨特功能和近紅外熒光蛋白在體內體外示蹤的優(yōu)越性結合起來，將能為進一步研究細胞間物質轉移機制提供有力工具。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
[0007]本發(fā)明還有一個目的是提供一種穩(wěn)定分泌近紅外熒光標記外泌體的乳腺癌細胞株的制備方法，其通過將編碼近紅外熒光蛋白iRFP682和外泌體CD63蛋白融合表達的基因整合至乳腺癌細胞基因組中，從而可獲得穩(wěn)定分泌近紅外熒光標記的外泌體的乳腺癌細胞株，最終得到一個可用于乳腺癌腫瘤微環(huán)境體內體外研究的新型生物標志物，為進一步研究細胞間物質轉移機制提供了有力工具，同時也給癌癥的診斷和治療方案提供新的支持和契機。
[0008]為了實現根據本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種穩(wěn)定分泌近紅外熒光標記外泌體的乳腺癌細胞株的制備方法，其包括如下步驟:
[0009]I)編碼外泌體標記蛋白⑶63基因的獲得:
[0010]從人乳腺癌MDA-MB-231細胞中提取總RNA進行逆轉錄得到cDNA，用帶XbaI和ClaI酶切位點，以及Linker序列的引物進行PCR擴增得到目的基因片段⑶63-Linker;
[0011]2)重組質粒載體的構建:
[0012]步驟I)得到的所述CD63-Linker和質粒骨架pAAV-1RFP682經T4DNA連接酶作用得到重組質粒載體 pAAV-CD63-Linker-1RFP682;
[0013]3)重組腺相關病毒的制備:
[0014]使用所述重組質粒載體pAAV-CD63-Linker-1RFP682和輔助質粒體外共轉染AAV-293細胞，包裝重組腺相關病毒rAAV-CD63-Linker-1RFP682 ；
[0015]4)穩(wěn)定分泌近紅外熒光蛋白標記外泌體的乳腺癌細胞株的制備:
[0016]使用所述重組腺相關病毒rAAV-CD63-Linker-1RFP682和輔助腺相關病毒共感染人乳腺癌MDA-MB-231細胞，通過熒光篩選獲得穩(wěn)定分泌近紅外熒光蛋白標記的外泌體的人乳腺癌MDA-MB-231細胞株；
[0017]5)近紅外熒光標記人乳腺癌MDA-MB-231細胞的外泌體提取及鑒定
[0018]采用分步離心法從步驟4)標記成功的MDA-MB-231細胞培養(yǎng)上清液中提取iRFP682標記的外泌體并進行鑒定。
[0019]優(yōu)選的是，其中，所述步驟5)中分步離心法的步驟為:
[0020]首先將所述細胞培養(yǎng)上清液在4°C條件下依次經2000g離心15min、5000g離心15min及12000g離心30min去除細胞碎片，得第一上清液；
[0021 ]其次將所述第一上清液使用孔徑不大于0.2μπι的膜過濾后，于4°C、12000g條件下離心120min，得到外泌體粗沉淀；
[0022]最后用PBS溶液重懸所述外泌體粗沉淀，混合均勻后在4°C和12000g條件下離心90min，得到提純外泌體，將所述提純外泌體使用PBS溶液重懸后置于-80°C條件保存?zhèn)溆谩?br>[0023]在外泌體的提純過程中，外泌體為30?10nm的杯狀膜結構囊泡，易受外界壓力和溫度影響，所以無論是提取過程還是解凍使用過程，都需控制溫度在4 °C左右。解凍需要在冰上進行。此外為避免蛋白酶對外泌體的干擾，凍存前還應加入蛋白酶抑制劑，4°C可保存3周，-80 °C可保存2-3年。
[0024]優(yōu)選的是，其中，所述步驟5)中iRFP682標記的外泌體鑒定的方法為:使用westernblot鑒定所述外泌體的膜表面蛋白，通過透射電鏡觀察所述外泌體結的構，以及通過S頂結構光照明超分辨焚光顯微鏡觀察外泌體的焚光標記。
[0025]優(yōu)選的是，其中，所述Linker序列為:ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg，既能保證近紅外焚光蛋白 iRFP682 與外泌體表面標志CD63融合穩(wěn)定的進行表達，又不會影響兩者各自的生物學活性。
[0026]優(yōu)選的是，其中，步驟3)的所述輔助質粒為pDG質粒，其中所述重組質粒載體pAAV-CD63-Linker-1RFP682可提供AAV-293病毒所必須的ITR序列，輔助質粒pDG可提供AAV-293重組復制、包裝病毒外殼等所必須的Rep和Cap基因，從而包裝攜帶重組腺相關病毒rAAV-CD63-Linker-1RFP682。
[0027]優(yōu)選的是，其中，所述輔助腺相關病毒為rAAVSVAV2，以提高外源基因的整合效率。
[0028]優(yōu)選的是，其中，步驟2)所述CD63-Linker和質粒骨架pAAV-1RFP682的摩爾比例為2?5，以利于重組質粒載體的形成。
[0029]優(yōu)選的是，其中，步驟4)所述所述重組腺相關病毒與所述人乳腺癌MDA-MB-231細胞數目的比例是3000?6000，以保證感染的效率。
[0030]本發(fā)明至少包括以下有益效果:
[0031 ]本發(fā)明制備的基因工程化乳腺癌細胞株能夠穩(wěn)定分泌近紅外熒光蛋白iRFP682標記的外泌體，并通過分步離心的方法對近紅外標記外泌體進行了有效的提純，利用外泌體的獨特功能及近紅外熒光蛋白在體內體外示蹤的優(yōu)越性，可用做乳腺癌腫瘤微環(huán)境體內體外研究的新型生物標記物，為進一步研究細胞間物質轉移機制提供了有力工具，同時也在癌癥的診斷和治療方案中具有重要的應用價值。
[0032]本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
【附圖說明】
[0033]圖1為本發(fā)明制備得到的穩(wěn)定分泌近紅外熒光標記外泌體的乳腺癌細胞株的SM結構光照明超分辨熒光顯微成像；
[0034]圖2為本發(fā)明提純后外泌體膜表面標志性蛋白的Westernblot檢測圖譜；
[0035]圖3為本發(fā)明提純外泌體的TEM高分辨透射電鏡圖；
[0036]圖4為本發(fā)明提純外泌體的S頂結構光照明超分辨熒光顯微成像；
[0037]圖5說明的是標記成功的MDA-MB-231細胞外泌體的分步離心提取過程。
【具體實施方式】
[0038]下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
[0039]應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“