抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域以及乳腺癌技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種可溶性抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明首次以水溶性的超分子有機(jī)框架（SOF）納米粒子為載體，通過(guò)四苯甲烷衍生化得到的四面體分子與CB[8]在水相自組裝獲得，可同時(shí)裝載化療藥物（如中性藥物阿霉素、陰離子型藥物培美曲塞二鈉）、葉酸衍生物、靶向整合素特異性配體如RDG肽衍生物、紅外探針?lè)肿尤鏘R?820等。SOF納米藥物載體具有pH依賴性的釋放特征，并以高濃度蓄積于腫瘤組織，對(duì)腫瘤組織中由于P?糖蛋白過(guò)表達(dá)而產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞具有特異性抑制生長(zhǎng)的作用，可以明顯增加化療藥物在多藥耐藥乳腺癌組織內(nèi)的滯留量，有效抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)，顯著提高對(duì)多藥耐藥乳腺癌的療效。
【專利說(shuō)明】
抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥導(dǎo)致的死亡一直是當(dāng)今世界人類死亡的重要原因之一，雖然科學(xué)家們?cè)诎┌Y治療方面進(jìn)行了長(zhǎng)期深入的研究，但癌癥的完全治愈和消滅仍然是目前人類面臨的最大挑戰(zhàn)之一。眾所周知，由化療引起的多藥耐藥性(MDR，multidrug resistance)導(dǎo)致的癌癥高復(fù)發(fā)率和治療失敗，是目前癌癥臨床治療所遇到的重要障礙?？茖W(xué)家們提出了各種可能機(jī)制解釋MDR的成因，其中包括通過(guò)改變細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從而增加藥物流出且促進(jìn)DNA修復(fù)或改變細(xì)胞代謝周期形成凋亡阻斷機(jī)制同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞解毒等。其中，P-糖蛋白(P-gp)，是一種活性物質(zhì)外排膜蛋白，其可以與藥物結(jié)合并將藥物栗出細(xì)胞外，是引發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生MDR的最重要的機(jī)制之一。而研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑是細(xì)胞的內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)，從而可以避免被P-糖蛋白排出。此外，使用傳統(tǒng)抗癌藥物的化療手段通常會(huì)造成較高全身毒性，這也是導(dǎo)致癌癥臨床效果很差的另一個(gè)重要原因。為了解決這些問(wèn)題，人工合成的納米材料在藥物輸送領(lǐng)域的應(yīng)用為癌癥的治療帶來(lái)了新的希望。
[0003]首先，納米藥物輸送系統(tǒng)(Nano-DDS，Nano_sizeddrug delivery systems)可以規(guī)避許多傳統(tǒng)化療手段的缺點(diǎn)，比如由于藥物穩(wěn)定性、溶解性或非特異性引起的高全身毒性和低生物利用度，這些都將導(dǎo)致治療功效降低。此外，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的Nano-DDS可以通過(guò)腫瘤病灶處的增強(qiáng)滲透性和保留效應(yīng)(EPR，enhanced permeat1n and retent1n)，通過(guò)提高局部藥物濃度來(lái)增加藥物的可達(dá)性和敏感性，從而克服腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。目前，關(guān)于納米藥物輸送系統(tǒng)的研究越來(lái)越多，其中一些甚至已經(jīng)進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。脂質(zhì)體、納米膠束、納米管等納米藥物載體，由于其具有較低的細(xì)胞毒性和較高的腫瘤組織滲透性等優(yōu)勢(shì)而廣泛應(yīng)用于藥物輸送系統(tǒng)中。然而，許多納米藥物輸送系統(tǒng)具有藥物負(fù)載量低以及藥物意外釋放(如藥物載體不穩(wěn)定導(dǎo)致的崩塌、傳輸過(guò)程中藥物泄露等)的缺點(diǎn)，導(dǎo)致腫瘤區(qū)域有效藥物輸送量的降低，從而嚴(yán)重影響治療效果。因此發(fā)展無(wú)毒、高載藥量、高穩(wěn)定性的藥物輸送系統(tǒng)具有重要的意義。
[0004]最近，科學(xué)家們已經(jīng)報(bào)到了具有納米尺寸的金屬有機(jī)框架材料MOF可以被應(yīng)用于藥物輸送和治療多藥耐藥癌細(xì)胞，但由于這類材料通常本身具有較高的細(xì)胞毒性，以及無(wú)法避免的非均相性會(huì)導(dǎo)致的生物體內(nèi)相分離的特性，同時(shí)金屬離子的引入有可能產(chǎn)生在生物體內(nèi)的富集毒性，從而大大限制了 MOF材料作為藥物載體材料的發(fā)展。我們發(fā)現(xiàn)三維超分子有機(jī)框架材料SOF納米顆粒作為藥物載體，具有低毒、高穩(wěn)定性、較高載藥量以及pH可控釋放的優(yōu)點(diǎn)。我們通過(guò)溶液相自組裝的手段，設(shè)計(jì)合成一系列以四苯甲烷作為四面體結(jié)構(gòu)支點(diǎn)，以疏水作用驅(qū)動(dòng)的CB[8]包結(jié)兩分子芳基吡啶鹽基團(tuán)為結(jié)合模式構(gòu)筑新型自組裝3DSOF材料。利用其前面提到的優(yōu)勢(shì)，特別是水溶性的特點(diǎn)，發(fā)展其成為新型的均相超分子自組裝藥物載體材料，從而實(shí)現(xiàn)其在癌癥化療領(lǐng)域以及在客服癌細(xì)胞多藥耐藥性方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性、常規(guī)聚合物膠束過(guò)早釋藥以及腫瘤部位釋放藥物的濃度或藥物的蓄積不夠的問(wèn)題，提供一種抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)，它以水相可溶的超分子有機(jī)框架SOF納米顆粒為載體，載體上裝載有化療藥物和多種功能探針?lè)肿?，記為Nano-SOF-DDS0
[0007]其中，所述的SOF納米粒子具有介孔孔道作為藥物儲(chǔ)納空間，粒徑在10-300nm之間，粒徑大小可調(diào)，形貌為球形等。
[0008]本發(fā)明中，所述的SOF納米粒子，通過(guò)四苯甲烷衍生化得到的四面體分子與葫蘆
[8]脲(CB[8])在水相自組裝獲得。調(diào)節(jié)不同的組成成分、添加試劑及其比例可得到不同尺寸、形貌的SOF納米粒子，形貌為可以為球形、橢球形、圓柱形、立方形等不拘。
[0009]本發(fā)明中，所述的化療藥物為廣譜癌癥化療藥物。
[0010]本發(fā)明中，所述的化療藥物包括但不限于阿霉素、培美曲塞二鈉、葉酸、紫杉醇中的任意一種，或其中幾種的組合，所述功能探針?lè)肿影ǖ幌抻诟蓴_素RNA、靶標(biāo)RGD肽衍生物以及紅外探針?lè)肿覫R820中的任意一種，或其中幾種的組合。
[0011]另外，本發(fā)明的納米給藥系統(tǒng)，還可以包含藥學(xué)上可接受的添加劑。
[0012]所述SOF納米粒子的平均粒徑在200nm以下，優(yōu)選10nm以下。
[0013]上述抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)的制備方法，具體步驟如下:
(1)制備具有不同取代基的四苯甲烷衍生物作為四面體結(jié)構(gòu)支點(diǎn)；
(2)通過(guò)四面體單體分子與CB[8]在水相自組裝制備水相單分散的SOF納米粒子，粒子粒徑為10-300nm，形貌為球形等，用于制備納米SOF給藥系統(tǒng)，記為Nano-SOF-DDS;
(3)將步驟(2)得到的SOF納米粒子與抗癌藥物在磷酸緩沖液中混合，制備得到抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)；
藥物負(fù)載量，相對(duì)于SOF納米粒子來(lái)說(shuō)一般為100-300mg/g。制備條件為:在含有SOF框架的磷酸緩沖溶液中，加入藥物分子的高濃度水溶液，攪拌均勻，在磷酸緩沖溶液中透析3天或以上制得。弱藥物分子本身水溶性差，則可以使用藥物分子的乙醇溶液代替。其中，阿霉素負(fù)載量?jī)?yōu)選130-173 mg/g，培美曲塞負(fù)載量?jī)?yōu)選191-227 mg/g，參見圖5所示；
(4)將步驟(3)得到的抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)在磷酸緩沖液中完成與作為探針?lè)肿拥墓δ苄》肿又苿┑难b載，制備得到具有靶向或治療診斷等功能的抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)。
[0014]此處的小分子制劑通常為非藥物類功能分子，可以是干擾素RNA、靶標(biāo)RGD肽衍生物、紅外探針I(yè)R820等等。量比關(guān)系可以通過(guò)透析實(shí)驗(yàn)，紫外光譜確定。功能探針?lè)肿迂?fù)載量為SOF納米粒子質(zhì)量的5%以下，一般為SOF納米粒子質(zhì)量的1-5%。其負(fù)載過(guò)程與步驟(3)類似。
[0015]步驟(I)中，所述的四苯甲烷衍生化的四面體單體分子可參考文獻(xiàn)Commun.2014，5，5574.來(lái)制備。
[0016]步驟(2)中，所述的SOF納米顆粒通過(guò)四面體單體分子與主體分子CB[8]在室溫水相的自組裝制得。
[0017]步驟(3)、(4)中，利用靜電作用和氫鍵鍵合作用、根據(jù)軟硬酸堿原理實(shí)現(xiàn)對(duì)客體藥物分子、探針?lè)肿拥陌病?br>[0018]本發(fā)明通過(guò)自組裝策略，在常溫下構(gòu)筑了一系列具有水溶性和有序性的超分子有機(jī)框架材料SOF。SOF材料本身對(duì)生物體無(wú)毒，但可以作為納米藥物載體，通過(guò)其框架的多孔性質(zhì)在水相實(shí)現(xiàn)對(duì)中性藥物小分子阿霉素(DOX)和陰離子藥物分子培美曲塞二鈉(Peme)的高效負(fù)載，及在不同PH條件下的高效釋放。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，對(duì)系統(tǒng)組合物進(jìn)行了體外釋放試驗(yàn)、細(xì)胞毒試驗(yàn)、細(xì)胞攝取試驗(yàn)、活體成像試驗(yàn)。體外釋放試驗(yàn)用于說(shuō)明本發(fā)明組合物的PH敏感性，細(xì)胞毒試驗(yàn)和細(xì)胞攝取試驗(yàn)用于說(shuō)明本發(fā)明組合物的抗耐藥性，活體成像試驗(yàn)用于說(shuō)明本發(fā)明組合物的PH敏感性和被動(dòng)腫瘤靶向性。通過(guò)SOF材料載藥對(duì)人乳腺癌多藥耐藥株(MCF-7/Adr)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)載有抗癌小分子藥物的SOF材料可以克服乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥性，其治療效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同等藥物濃度下的單純小分子藥物給藥的控制組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，作為一種對(duì)生物體毒性較低的可溶性多孔材料，具有良好的修飾性和溫和的合成條件。這類SOF材料的可作為一種新型的納米藥物載體應(yīng)用在癌癥化療領(lǐng)域，將在對(duì)小分子藥物特別是陰離子小分子藥物的負(fù)載傳輸和克服多藥耐藥腫瘤的治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。更重要的是，這類新型的溶液相SOF納米藥物載體，可以利用“軟硬酸堿理論”通過(guò)陰離子交換的方法，非常方便的實(shí)現(xiàn)對(duì)材料的后修飾。比如，可以通過(guò)對(duì)SOF分子進(jìn)行后修飾，或者通過(guò)負(fù)載的陰離子型的短肽靶標(biāo)分子(如R⑶環(huán)肽)和紅外探針?lè)肿?如IR 820)構(gòu)筑多功能的納米超分子藥物載體。
[0019]本發(fā)明的納米給藥系統(tǒng)，可用于制備抑制多藥耐藥乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)藥物。本發(fā)明的SOF納米藥物載體具有pH依賴性的釋放特征，并以高濃度蓄積于腫瘤組織，對(duì)腫瘤組織中由于P-糖蛋白過(guò)表達(dá)而產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞具有特異性抑制生長(zhǎng)的作用，為克服耐藥性提供了一種新型的載體和制劑策略，可以明顯增加化療藥物在多藥耐藥乳腺癌組織內(nèi)的滯留量，有效抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)，顯著提高對(duì)多藥耐藥乳腺癌的療效。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1四面體單體分子以及葫蘆[8]脲結(jié)構(gòu)。
[0021 ]圖2組裝體SOF結(jié)構(gòu)在水中動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，(a)Com-l粒徑分布，(b)Com-2粒徑分布，(c)Com_3粒徑分布，(d)Com_4粒徑分布，(e)Com_5粒徑分布，(f)Com-6粒徑分布，[ArPy] = 0.2 mM)，Com_l?6包含于圖1所描述的結(jié)構(gòu)中。
[0022]圖3組裝體SOF結(jié)構(gòu)在水溶液中的同步輻射溶液相X射線衍射圖譜。其中，(a)Com-1，(b)Com_2，(c)Com_3，d)Com_，(e)Com_5，(f)Com_6，[ArPy] = 8 mM)。
[0023]圖4組裝體SOF結(jié)構(gòu)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果。其中，(a)Com-l，(b)Com-2，(c)Com-3，(d)Com-,Ce)Com_5,Cf)Com-6。
[0024]圖5組裝體SOF結(jié)構(gòu)對(duì)兩種抗癌藥物阿霉素(DOX)和培美曲塞二鈉(Peme)的負(fù)載量。
[0025]圖6組裝體SOF結(jié)構(gòu)對(duì)兩種抗癌藥物在酸性和中性條件下的釋放曲線圖7乳腺癌耐藥株細(xì)胞與正常株細(xì)胞的激光共聚焦觀測(cè)結(jié)果，列左至右分別為細(xì)胞核、組裝體SOF材料、阿霉素、溶酶體的共聚焦觀測(cè)圖片以及疊加圖。行上至下為正常株裸藥給藥、正常株材料給藥、耐藥株裸藥給藥以及耐藥株材料給藥。
[0026]圖8對(duì)比中性抗癌藥物阿霉素以及培美曲塞二鈉裸藥給藥以及SOF材料負(fù)載對(duì)乳腺癌耐藥株細(xì)胞的殺傷效果。其中，(a)不同阿霉素濃度下的細(xì)胞存活率，(b)不同培美曲塞二鈉濃度下的細(xì)胞存活率，(C)阿霉素的半數(shù)致死濃度，(d)培美曲塞二鈉的半數(shù)致死濃度。
[0027]圖9中性抗癌藥物阿霉素以及培美曲塞二鈉通過(guò)SOF材料負(fù)載后尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，腿部荷有腫瘤的小鼠的腫瘤區(qū)域阿霉素?zé)晒獬上窠Y(jié)果(A)以及組織切片實(shí)驗(yàn)結(jié)果(B)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，而不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0029]實(shí)施例1:單體四面體型四苯甲烷衍生物的制備。
[0030]四面體單體分子與CB[8]的結(jié)構(gòu)示意圖(見圖1)，其中以D3分子為例說(shuō)明四面體四苯甲烷衍生物制備過(guò)程，Com-1?6包含于圖1所描述的結(jié)構(gòu)中。合成過(guò)程可以參照文獻(xiàn)Λ^?.Commun.2014,5, 5574.。分別稱取四(4-溴甲基-苯基)甲烷(30 mg, 0.043 mmol)和化合物B30(35.7 mg, 0.18 mmol)溶于THF(2 mL)和乙腈(6 mL)中，加熱回流24小時(shí)后自然冷卻至室溫。旋蒸除去溶劑，加入丙酮(10 mL)，將沉淀過(guò)濾并用丙酮(10 mL)洗滌，用乙腈重結(jié)晶，過(guò)濾干燥后得黃色粉末(35.4 mg, 55%)? 匪 R (400 MHz，DMSO): δ 9.19 (d,J =5.3 Hz, 8H)， 8.53 (d，/ = 5.4 Hz， 8H)， 8.04 (d，/ = 7.9 Hz， 8H)， 7.56 - 7.39(m， 16H)， 7.21 (d，/ = 7.4 Hz, 8H)， 5.78 (s， 8H)， 2.58 (s， 12H).13C NMR: (101MHz， DMSO) δ 154.29， 146.64， 145.06， 144.66， 132.45， 130.79， 128.99， 128.46，128.18， 125.94， 123.97， 64.01， 61.48， 13.99.HRMS: Calcd for C77H68N4S4Br2 [M]2+:667.1402.Found: 667.1341。
[0031 ]實(shí)施例2: SOF納米顆粒載藥系統(tǒng)的制備及組裝模式表征。
[0032]根據(jù)我們的前序研究工作的報(bào)道(#a1.Commun.2014，5，5574.)端基具有芳基吡啶鹽基團(tuán)的四面體分子可以在水溶液中形成有序的3D超分子有機(jī)框架(S0F)，將四苯甲烷衍生物與CB[8]分子以化學(xué)計(jì)量比1:2在水中混合，加熱超聲使樣品分散溶解冷卻至室溫，即在水中組裝得到相應(yīng)的組裝體。通過(guò)觀測(cè)熒光光譜的Job plots實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了目標(biāo)分子的苯基吡啶正離子單元與CB[8]以化學(xué)計(jì)量比2:1結(jié)合。通過(guò)Isaacs等人報(bào)道的1HNMR競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)方法，在50 mM的CD3CO2Na為緩沖液(pD = 4.74)的D2O溶液中，我們確定了化合物的苯基吡啶正離子結(jié)構(gòu)單元同CB[8]的表觀結(jié)合常數(shù)分別為1.2 XlO13，8.5 XlO13，1.4 X1014，8.1 X 1013，1.3 X 114和1.7 X 114 M—2等。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前報(bào)道的3D SOF類似，以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了化合物可以在水中以ArPy單元與CB[8]以化學(xué)計(jì)量比2:1結(jié)合的組裝模式形成穩(wěn)定的組裝體。考慮到實(shí)際應(yīng)用時(shí)的材料濃度，我們通過(guò)水相DLS實(shí)驗(yàn)研究了 SOF在低濃度下([ArPy] = 0.2 mM)的組裝體粒徑，我們發(fā)現(xiàn)六種絡(luò)合物的水合粒徑的分布峰值在24.2-51.0 nm之間(圖2)，這說(shuō)明形成了較大的組裝結(jié)構(gòu)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，處于這一粒徑的納米藥物載體通常具有較好的腫瘤組織滲透能力。
[0033]實(shí)施例3:SOF納米顆粒的溶液相有序性表征。
[0034]溶液相同步輻射源(XRD)實(shí)驗(yàn):X射線衍射數(shù)據(jù)通過(guò)上海光源(SSRF)衍射線站81^1481測(cè)試4射線光束波長(zhǎng)為1.2398 A13BLHBl線站通過(guò)偏轉(zhuǎn)磁鐵和Si (111)雙晶單色儀單色化處理X射線光束。光斑聚焦直徑大小為0.5 mm，終端配備Huber 5021型衍射儀，通過(guò)NaI閃爍探測(cè)器收集數(shù)據(jù)。我們利用同步輻射源的XRD實(shí)驗(yàn)對(duì)SOF材料納米顆粒的有序性進(jìn)行了表征，確定了 SOF納米顆粒在溶液相中具有良好的有序性(圖3 )?；衔镏行牡奶荚訕?gòu)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的節(jié)點(diǎn)，通過(guò)CB[8]將兩個(gè)相鄰分子的ArPy基團(tuán)包括在其孔穴中，從而使結(jié)構(gòu)被交聯(lián)起來(lái)?；谖墨I(xiàn)報(bào)道的CB[8]與芳基吡啶鹽形成的1:2絡(luò)合物的晶體結(jié)構(gòu)參數(shù)，利用金剛石的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)3D超分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，我們推測(cè)這一組裝體在溶液相中將同樣具有球狀組裝結(jié)構(gòu)。我們分別觀測(cè)到位于4.5-5.0 nm處較寬的衍射峰，同模擬計(jì)算得到的3D SOF結(jié)構(gòu)中{100}晶面間距(4.9 nm)高度吻合。
[0035]實(shí)施例3: SOF納米顆粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。
[0036]通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒Cell Counting Kit_8(CCK_8)，我們利用正常的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7作為模型研究了載藥前后的SOF材料Com-1?6的體外細(xì)胞毒性(圖4)。結(jié)果顯示在SOF材料樣品含量分別為50、100、150和200 yg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞的存活率在四種濃度下可以分別維持在92.2-97.2%,91.9-96.2%，87.1-92.0%及84.9-90.5%之間。這一研究表明3DSOF結(jié)構(gòu)具有較低的細(xì)胞毒性。
[0037]實(shí)施例4: SOF納米顆粒對(duì)抗癌藥物的負(fù)載量研究。
[0038]我們將分別將混合了1.0 mM阿霉素(DOX)或1.0 mM培美曲塞二鈉鹽(Peme)的框架材料SOF的水溶液，使用截留分子量為1000 KDa的透析袋在I3BS緩沖液中(pH = 7.4)浸泡3天，每5-7小時(shí)更換一次緩沖液。我們利用紫外光譜監(jiān)測(cè)直到浸出液中觀察不到明顯的DOX和Peme的紫外吸收為止(吸光度小于0.005)，由此我們測(cè)得了三維SOF材料對(duì)藥物DOX和Peme的負(fù)載量(圖5 )。我們將預(yù)先負(fù)載了 DOX和Peme的SOF材料的水溶液通過(guò)透析袋(截留分子量為 1000 KDa)浸泡在中性(pH = 7.4, PBS buffer)和酸性(pH = 4.5, CH3⑶OH/CH3⑶ONa buffer)緩沖水溶液中，通過(guò)透析實(shí)驗(yàn)研究溶液相SOF材料的藥物釋放性質(zhì)(圖6) ο在第一組實(shí)驗(yàn)中，我們將負(fù)載了藥物的SOF材料的溶液注入透析袋中并浸泡在37°C的PBS緩沖溶液中(pH = 7.4 )。通過(guò)UV-vi s記錄的釋放曲線，在搖床中時(shí)，DOX和Peme釋放量很小，達(dá)到平衡時(shí)釋放百分比分別為7.8%和4.3%。為了進(jìn)一步證明藥物分子在水中的釋放為酸響應(yīng)的釋放過(guò)程，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道癌細(xì)胞的溶酶體的pH值可以達(dá)到4.5，我們?cè)贑H3CO2H/CH3CO2NaCpH = 4.5 )的緩沖溶液中進(jìn)行了第二組藥物釋放實(shí)驗(yàn)，在60小時(shí)內(nèi)DOX和Peme的釋放百分比可以達(dá)到89%和94%(圖6)。以上實(shí)驗(yàn)證明了，SOF材料在PBS緩沖液中(pH = 7.4)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中性藥物分子DOX和陰離子藥物分子Peme的高效負(fù)載。負(fù)載了藥物DOX和Peme的SOF材料可以選擇性的在相當(dāng)于癌細(xì)胞溶酶體的酸性條件下(pH = 4.5)實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物分子的釋放，而在相當(dāng)于體液的中性條件下(pH = 7.4)幾乎不釋放藥物。
[0039]實(shí)施例5:激光共聚焦顯微鏡對(duì)SOF納米顆粒在耐藥癌細(xì)胞中的行為進(jìn)行研究。
[0040]通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為通過(guò)SOF材料載藥，有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)多藥耐藥癌細(xì)胞的治療，并且通過(guò)pH響應(yīng)性實(shí)現(xiàn)在癌細(xì)胞中的選擇性釋放。我們選擇了人乳腺癌獲得性耐藥株MCF-7/Adr和非耐藥株MCF-7進(jìn)行了研究。首先，利用具有較強(qiáng)綠色熒光的SOF材料，我們通過(guò)激光共聚焦顯微實(shí)驗(yàn)(CLSM)研究了MCF-7/Adr細(xì)胞對(duì)其內(nèi)化的速度，發(fā)現(xiàn)SOF材料可以高效的進(jìn)入癌細(xì)胞。通過(guò)監(jiān)測(cè)SOF的相對(duì)熒光強(qiáng)度變化，我們發(fā)現(xiàn)大概20 min后，其進(jìn)入癌細(xì)胞的量就可以達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。這說(shuō)明MCF-7/Adr癌細(xì)胞對(duì)SOF材料的內(nèi)化效率很高。為了研究負(fù)載了藥物分子的SOF材料DOXOCom-3在MCF-7/Adr細(xì)胞中的攝取行為，我們使用細(xì)胞攝取抑制劑來(lái)逐一抑制細(xì)胞攝取通道，然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DOX的特征熒光，從而得到不同抑制劑條件下細(xì)胞對(duì)D0X@Com-3的攝取量。通過(guò)與控制組即37 °C下不使用抑制劑的細(xì)胞對(duì)DOXOCom-3的攝取量對(duì)比，細(xì)胞通道被氯丙嘆CPZ(chlorpromazine，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑)抑制時(shí)，攝取DOXOCom-3量減少最明顯。使用染料木素GN( gen i ste in，小窩蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑)、阿米洛利AM(ami 1ride，巨胞飲抑制劑)以及秋水仙素CC(co I chi cine，依賴微管的巨胞飲抑制劑)處理的細(xì)胞攝取量幾乎沒(méi)有明顯減少。并且在低溫條件下，細(xì)胞對(duì)D0X@Com-3的攝取量明顯減少。這些結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞對(duì)D0X@Com-3的攝取是能量依賴的攝取過(guò)程，且主要攝取通道是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制。這種由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的攝取通道說(shuō)明SOF材料進(jìn)入細(xì)胞后是先進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)(內(nèi)含體)，然后再進(jìn)入溶酶體的。為了研究載藥SOF材料的MCF-7/Adr細(xì)胞中株的亞細(xì)胞分布情況，我們以負(fù)載DOX前后的SOF材料Com-3為例，使用染料試劑DAPI和Lysotraker Green DND-26對(duì)MCF-7和MCF-7/Adr的細(xì)胞核和溶酶體進(jìn)行了染色，通過(guò)共聚焦實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種細(xì)胞株對(duì)DOX和D0X@Com-3材料的攝入情況進(jìn)行了觀察(圖7 )。結(jié)果表明負(fù)載了 DOX的SOF材料DOXOCom-3具有高效的細(xì)胞內(nèi)輸送效率，MCF-7和耐藥株MCF-7/Adr的細(xì)胞溶酶體區(qū)域與SOF材料Com-3的熒光區(qū)域高度重疊，并且SOF中負(fù)載的DOX被輸送進(jìn)入了 MCF-7/Adr細(xì)胞的細(xì)胞核，而單獨(dú)的DOX給藥并沒(méi)有觀察到MCF-7/Adr細(xì)胞核處明顯的DOX的特征熒光。
[0041]實(shí)施例6:通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)對(duì)比抗癌藥物直接給藥(即裸藥給藥)與裝載有抗癌藥物分子的SOF材料對(duì)乳腺癌耐藥株細(xì)胞的殺傷效果。
[0042]為了研究SOF材料作為藥物載體對(duì)多藥耐藥癌細(xì)胞MCF-7/Adr的治療效果，我們對(duì)六種SOF材料Com-1?6負(fù)載DOX和Peme后的材料進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，并以單獨(dú)給藥DOX和Peme作為對(duì)照組。通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(圖8)，我們發(fā)現(xiàn)只通過(guò)DOX給藥MCF-7/Adr細(xì)胞的藥物半數(shù)致死濃度(IC5q)為107 土 2.0yg/mL，而通過(guò)SOF材料DOXOCom-1?6治療MCF-7/Adr 的 IC5Q分別為8.92 ± 0.95，6.01 ± 0.78，5.36 ± 0.73，7.47 ± 0.87，7.13 土0.85和8.19±0.91yg/mL。通過(guò)Peme給藥的藥物半數(shù)致死濃度IC5Q為51.8± I.7，而PemeOCom-1?6 對(duì) MCF-7/Adr 細(xì)胞的 IC5Q 分別為 6.42 ±0.81，5.14土 0.71，4.47 ±0.65，8.07 土
0.91，5.29±0.72和4.30±0.63。結(jié)果表明，負(fù)載了DOX的SOF材料，其IC5Q相比單獨(dú)DOX給藥顯著提高了大約12?20倍。同樣，負(fù)載了Peme的SOF材料與單獨(dú)Peme給藥相比，其IC5q顯著提高了 6?12倍。這說(shuō)明藥物小分子DOX和Peme可以通過(guò)SOF材料的負(fù)載，顯著提升對(duì)多藥耐藥癌細(xì)胞MCF-7/Adr的藥物治療效果。通過(guò)將不同材料與MCF-7/Adr細(xì)胞孵育培養(yǎng)24小時(shí)，使用Annexin V和PI染料染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)六種負(fù)載Peme的SOF材料PemeOCom-1?6進(jìn)行了研究。以Com-3為例，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)材料組表現(xiàn)出了跟控制組類似的健康細(xì)胞狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)Peme給藥的MCF-7/Adr細(xì)胞大部分處于凋亡早期狀態(tài)即細(xì)胞仍然存活，而實(shí)驗(yàn)組PemeOCom-1?6中大部分的細(xì)胞處于凋亡晚期狀態(tài)即細(xì)胞死亡，這證明了 SOF材料載藥對(duì)多藥耐藥MCF-7/Adr細(xì)胞的治療效果明顯優(yōu)于單純給藥。
[0043]實(shí)施例7:評(píng)價(jià)活體條件下SOF材料作為納米藥物載體對(duì)耐藥型腫瘤治療效果。
[0044]為了評(píng)價(jià)SOF材料作為納米藥物載體在體內(nèi)對(duì)多重耐藥腫瘤治療效果，我們通過(guò)接種有MCF-7/Adr腫瘤的活體小鼠，研究了其在動(dòng)物體內(nèi)的化療效果。通過(guò)對(duì)腿部接種有MCF-7/Adr腫瘤的裸鼠由尾靜脈注射D0X@Com-3，并監(jiān)測(cè)材料DOX特征熒光(600 nm)在腫瘤組織附近的發(fā)光信號(hào)的方式。我們發(fā)現(xiàn)，大約在注射載藥SOF材料2小時(shí)后，小鼠腿部腫瘤區(qū)域的熒光發(fā)射強(qiáng)度達(dá)到了最大值(圖9A)，表明DOXOCom-3在2小時(shí)內(nèi)即可以在腫瘤部位有效富集。我們進(jìn)一步通過(guò)腫瘤組織切片及用H&E和TUNEL染色法來(lái)考察注射后負(fù)載藥物分子的SOF材料D0X@Com-3及Peme@Com-3的抗腫瘤特性(圖9B)。通過(guò)與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，單獨(dú)注射SOF材料Com-3的腫瘤組織并沒(méi)有觀察到明顯的損傷。而注射了 DOXOCom-3及PemeOCom-3材料的腫瘤組織有明顯損傷，且呈現(xiàn)組織細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了 SOF材料作為一種本身對(duì)生物體無(wú)毒的新型水溶性框架材料，通過(guò)負(fù)載藥物小分子有望為多藥耐藥性乳腺癌的有效治療提供新的尚效解決方案。
[0045]以上所述為本發(fā)明的優(yōu)化實(shí)施例而已，并不用以限制發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，以水相可溶的超分子有機(jī)框架SOF納米顆粒為載體，載體上裝載有化療藥物和多種功能探針?lè)肿?所述的SOF納米粒子具有介孔孔道作為藥物儲(chǔ)納空間，粒徑在10-300nm之間，粒徑大小可調(diào)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的SOF納米粒子，由四面體前體分子與主體分子CB[8]通過(guò)水相自組裝制備獲得;形貌為為球形、橢球形、圓柱形或立方形。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的化療藥物為廣譜癌癥化療藥物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的化療藥物選自阿霉素、培美曲塞二鈉、葉酸、紫杉醇，功能探針?lè)肿舆x自干擾素RNA、RGD肽衍生物以及紅外探針?lè)肿覫R820。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，化療藥物負(fù)載量相對(duì)于SOF納米粒子為100-300mg/g;功能探針?lè)肿迂?fù)載量為SOF納米粒子質(zhì)量的1-5%。6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或5所述的納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，還包含藥學(xué)上可接受的添加劑。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述SOF納米粒子的平均粒徑在200nm以下。8.—種權(quán)利要求1所述的抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系的制備方法，其特征在于，具體步驟為: (1)制備具有不同取代基的四苯甲烷衍生物作為四面體結(jié)構(gòu)支點(diǎn)； (2)通過(guò)四面體單體分子與CB[8]在水相自組裝制備水相單分散的SOF納米粒子，粒子粒徑為10-300nm; (3)將步驟(2)得到的SOF納米粒子與抗癌藥物在磷酸緩沖液中混合，制備得到抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)； (4)將步驟(3)得到的抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)在磷酸緩沖液中完成與作為探針?lè)肿拥墓δ苄》肿又苿┑难b載，制備得到具有靶向或治療診斷等功能的抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)。9.權(quán)利要求1所述的抑制多藥耐藥乳腺癌生長(zhǎng)的納米給藥系統(tǒng)在制備抑制多藥耐藥乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK105902498SQ201610390127
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日
【發(fā)明人】黎占亭, 田佳, 姚池, 張丹維
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)