一種基于水稻OsMY1基因降低水稻株高的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于水稻OsMYl基因降低 水稻株高的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上最重要糧食作物之一，世界一半以上的人口以水稻為食物和營(yíng)養(yǎng)來(lái) 源。以矮桿和雜種優(yōu)勢(shì)利用為特征的水稻品種改良使水稻單產(chǎn)發(fā)生了兩次飛躍，為解決我 國(guó)糧食問(wèn)題作出了巨大貢獻(xiàn)。近年來(lái)，隨著水稻基因組研究的進(jìn)展，分子技術(shù)在水稻育種上 的應(yīng)用得到發(fā)展和完善，基因設(shè)計(jì)育種將有望成為水稻育種的第三次飛躍的突破口，遺傳 改良和基因工程手段已經(jīng)成為提高作物產(chǎn)量的最有效手段之一，因此尋找與高產(chǎn)相關(guān)的功 能基因并通過(guò)基因工程技術(shù)培育水稻高產(chǎn)新品種是現(xiàn)代分子育種的發(fā)展方向。
[0003] 然而，近年來(lái)在水稻育種方面以盡可能的提高水稻經(jīng)濟(jì)系數(shù)為目標(biāo)，得到株高和 高產(chǎn)的水稻品種，這就必然面臨株高帶來(lái)易倒伏的風(fēng)險(xiǎn)，從而影響水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和提高成 本，所以控制水稻株高基因的分離鑒定以及通過(guò)分子育種技術(shù)改良水稻具有重要意義。目 前已知的水稻株高控制有關(guān)的基因包括:D1、sdl、sd-n、sd-g、Sd_d(t)、sd_k(t)、sd_h(t)、 Td-l、GIDl、GID2、d-CHAl(t)、d-R955(t)等等，這些基因都與降低水稻株高有關(guān)。水稻矮化 育種始終是品種改良的核心問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供了一種基于水稻OsMYl基因降低水稻株高的方法，即將OsMYl 基因的RNA干擾目的片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到水稻中，然后培育水稻獲得T1代RNA干擾的 OsMYl基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0005] 本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案，一種基于水稻OsMYl基因降低水稻株 高的方法，其特征在于:將OsMYl基因的RNA干擾目的片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到水稻中，然后培 育水稻獲得T1代RNA干擾的OsMYl基因的轉(zhuǎn)基因水稻，其中OsMYl基因序列如SEQ ID NO. 1所 不。
[0006] 本發(fā)明所述的基于水稻OsMYl基因降低水稻株高的方法，其特征在于:選取OsMYl 基因的cDNA序列3 '端250bp的特異性區(qū)段作為OsMYl基因的RNA干擾目的片段，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該 RNA干擾目標(biāo)片段的上游引物F: 5 ' -CACCAGCACCCATAAACAACTAGC-3 '和下游引物R: 5 ' -CATCATCCCAGCCTCGAGTTCGTC-3 '，并根據(jù)Gateway克隆技術(shù)在F引物5 '端加上CACC四個(gè)堿基， 首先把該RNA干擾目的片段連接pENTR/D Gateway入門載體，然后經(jīng)過(guò)LR反應(yīng)連接到植物表 達(dá)載體PANDA的相應(yīng)位點(diǎn)，再通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得T1代RNA干擾 OsMYl基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0007] 本發(fā)明將水稻含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC域)的基因 OsMYl構(gòu)建RNA干擾植物載體，通 過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得T1代RNA干擾的OsMYl基因的轉(zhuǎn)基因水稻，與野 生型水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻的株高降低了26.27%-27.03%。
【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1為對(duì)照水稻和OsMYl基因 RNA干擾的轉(zhuǎn)基因水稻T1代株高的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，其中 WT為對(duì)照水稻日本晴，RNAi-OsMYl為轉(zhuǎn)基因水稻，p < 0.01; 圖2為RNAi-OsMYl轉(zhuǎn)基因水稻T1代的PCR檢測(cè)，圖中：1、DNA Maker(DL 2000)，2、野生型 檢測(cè)，3、陰性對(duì)照，4、陽(yáng)性對(duì)照，5-11、RNAi-〇sMYl轉(zhuǎn)基因水稻T1代的PCR產(chǎn)物，通過(guò)PCR檢測(cè) 可以篩選到陽(yáng)性植株，條帶正確且亮的代表陽(yáng)性植株。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)該將此理解為本 發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā) 明的范圍。
[0010] 實(shí)施例1 1、水稻OsMY 1基因的RNA干擾載體的構(gòu)建 利用gateway技術(shù)構(gòu)建水稻OsMYl基因的RNA干擾載體，選取OsMYl基因的cDNA序列3 '端 250bp的特異性區(qū)段作為OsMYl基因 RNA干擾目的片段，采用軟件primer5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增該RNA 干擾目標(biāo)片段的上游引物F : 5 ' -CACCAGCACCCATAAACAACTAGC-3 '和下游引物R : 5 ' -CATCATCCCAGCCTCGAGTTCGTC-3 '，并根據(jù)Gateway克隆技術(shù)在F引物5 '端加上CACC四個(gè)堿基， 首先把該RNA干擾目的片段連接pENTR/D Gateway入門載體，然后經(jīng)過(guò)LR反應(yīng)連接到植物表 達(dá)載體PANDA的相應(yīng)位點(diǎn)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在含有卡那霉素和潮霉素的LB平板 上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，已經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，再通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈 傷組織獲得T1代RNA干擾OsMYl基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0011] 2、水稻的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選和T1代RNAi-OsMYl轉(zhuǎn)基因水稻性狀的分析 采用農(nóng)桿菌浸染水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法將OsMYl基因 RNA干擾載體轉(zhuǎn)化至水稻愈傷組織(將 去穎殼的水稻種子點(diǎn)播在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6D2上。大約一周后，水稻種子能夠長(zhǎng)出愈傷。除 去芽和根后，將愈傷置于新的N6D2培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)，大約10天能夠形成比較堅(jiān)硬的愈傷 組織，可用于農(nóng)桿菌侵染），利用潮霉素篩選陽(yáng)性愈傷組織，進(jìn)一步誘導(dǎo)培育再生陽(yáng)性轉(zhuǎn)基 因植株，并進(jìn)行分子鑒定。RNAi-OsMYl轉(zhuǎn)基因水稻T1代時(shí)，對(duì)同一批次的對(duì)照水稻和T1代轉(zhuǎn) 基因水稻株高進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)樣本各20株，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示野生型水稻的平均株高為 85.9 ± 2.37cm，RNAi-OsMYl轉(zhuǎn)基因水稻的平均株高為63 ± 1.43cm，與野生型水稻相比，轉(zhuǎn)基 因水稻的株高降低了 26.27%-27.03%。
[0012]表1為對(duì)照水稻和OsMYl基因 RNA干擾的轉(zhuǎn)基因水稻T1代株高的農(nóng)藝學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)比 較，其中WT為對(duì)照水稻日本晴，RNAi-OsMYl為轉(zhuǎn)基因水稻 表1 T1代RNAi-OsMYl轉(zhuǎn)基因水稻株高農(nóng)藝學(xué)性狀統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
綜上所述，本發(fā)明將自主克隆的一個(gè)含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（CC域）的基因 OsMYl (GenBank登錄號(hào)DQ641916.1)，通過(guò)構(gòu)建該基因的植物RNA干擾載體，采用水稻轉(zhuǎn)基因技 術(shù)，下調(diào)其表達(dá)量，獲得了矮化水稻植株，建立了一種改良水稻株高的基因工程方法。
[0013] 以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該 了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原 理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入 本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。
[0014] SEQUENCE LISTING 〈11〇>河南師范大學(xué) 〈120> -種基于水稻OsMYl基因降低水稻株高的方法 <130> 2016 <160> 1 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 1025 <212> DNA 〈213>人工序列 <*400> 1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于水稻OsMYl基因降低水稻株高的方法，其特征在于:將OsMYl基因的RNA干擾 目的片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到水稻中，然后培育水稻獲得T1代RNA干擾的OsMYl基因的轉(zhuǎn)基因 水稻，其中OsMYl基因序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于水稻OsMYl基因降低水稻株高的方法，其特征在于:選取 OsMYl基因的cDNA序列3'端250bp的特異性區(qū)段作為OsMYl基因的RNA干擾目的片段，設(shè)計(jì)擴(kuò) 增該RNA干擾目標(biāo)片段的上游引物F: 5 ' -CACCAGCACCCATAAACAACTAGC-3 '和下游引物R: 5 ' -CATCATCCCAGCCTCGAGTTCGTC-3 '，并根據(jù)Gateway克隆技術(shù)在F引物5 '端加上CACC四個(gè)堿基， 首先把該RNA干擾目的片段連接pENTR/D Gateway入門載體，然后經(jīng)過(guò)LR反應(yīng)連接到植物表 達(dá)載體PANDA的相應(yīng)位點(diǎn)，再通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得T1代RNA干擾 OsMYl基因的轉(zhuǎn)基因水稻。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于水稻<i>OsMY1</i>基因降低水稻株高的方法，將<i>OsMY1</i>基因的RNA干擾目的片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到水稻中，然后培育水稻獲得T1代RNA干擾的<i>OsMY1</i>基因的轉(zhuǎn)基因水稻，與野生型水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻的株高降低了26.27%-27.03%。
【IPC分類】C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00
【公開號(hào)】CN105624189
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610124961
【發(fā)明人】梁衛(wèi)紅, 王高華, 李佳佳, 張靜, 黃俊駿, 閆鑫甜, 杜京堯, 石佳, 葛慧雯
【申請(qǐng)人】河南師范大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年3月7日