轉(zhuǎn)基因水稻pa110-15外源基因純合雜合狀態(tài)的pcr檢測引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因水稻外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)檢測的方法，特別涉 及轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測引物及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是食品、農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分檢測的"金標(biāo)準(zhǔn)"，是依法開展轉(zhuǎn)基因生物 安全監(jiān)管的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因成分檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制對原材料的均勻性、穩(wěn)定性、特征 量值范圍等方面有嚴(yán)格要求。目前，國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因成分檢測普遍采用基于核酸的定性、定量 檢測方法。其中定量檢測通常采用Real Time-PCR方法對樣品中靶標(biāo)核酸序列進(jìn)行絕對定 量，即測定外源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)，并以此為基礎(chǔ)計算樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量。 在轉(zhuǎn)基因成分檢測中，可以將外源DNA看作一個基因座位，一個純合體的2倍體基因組中檢 測靶標(biāo)核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)為2, 一個雜合體的2倍體基因組中外 源DNA插入特征序列的拷貝數(shù)為1，非轉(zhuǎn)基因材料中則為0。因而，轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制 備原材料的均勻性、穩(wěn)定性、特征量值范圍主要體現(xiàn)在外源DNA插入所產(chǎn)生的特征序列的 雜合或純合狀態(tài)。在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過程中，必需對原材料中靶標(biāo)核酸序列的遺傳特性進(jìn) 行確認(rèn)，即確認(rèn)外源DNA插入所產(chǎn)生的特征序列是純合還是雜合狀態(tài)。
[0003] 此外，在轉(zhuǎn)基因作物遺傳育種過程中，往往需要將轉(zhuǎn)基因材料與其它材料進(jìn)行雜 交、轉(zhuǎn)育以獲得適合的栽培品種，利用分子生物學(xué)手段快速、簡便鑒定純合體/雜合體育種 材料，也有利于縮短育種進(jìn)程。
[0004] 目前，已報道的轉(zhuǎn)基因成分檢測方法，主要包括針對外源目的基因、調(diào)控元件的篩 選檢測和基因特異性檢測，針對遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建特征的構(gòu)建特異性檢測，針對外源DNA 插入特征序列的品系特異性檢測等三類。利用以上方法，只能確定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因 成分或含有何種轉(zhuǎn)基因成分，但無法直接鑒別樣品中外源DNA插入的純合或雜合狀態(tài)。迄 今未止，國內(nèi)外目前還沒有針對轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合/雜合狀態(tài)的檢測方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供檢測轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀 態(tài)的PCR檢測引物。
[0006] 本發(fā)明的目的還在于提供轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀態(tài) 的PCR檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的目的還在于提供轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀態(tài) 的PCR檢測試劑盒。
[0008] -種轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測引物，所述引物為： PA110-LA-F，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示；PA110-LA-R，其核苷酸序列如序列 表 SEQ ID No. 2 所示。
[0009] 專利CN201410081893公開的了轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源插入片段旁側(cè)序列及應(yīng) 用。本發(fā)明根據(jù)PA110-15外源插入片段旁側(cè)序列信息，在水稻染色體部分設(shè)計出一對能夠 準(zhǔn)確檢測轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)的PCR檢測引物。
[0010] 一種轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測方法，按照如下步驟 進(jìn)行：
[0011] (1)提取待檢測水稻樣品的DNA ;
[0012] (2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列為擴(kuò) 增引物，建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013] (3)如果僅擴(kuò)增出一條3856bp片段，則待檢測的樣品為純合轉(zhuǎn)基因水稻 PA110-15 ;如果擴(kuò)增出3856bp和751bp的兩條片段，待檢測的樣品為雜合轉(zhuǎn)基因水稻 PA110-15 ;如果只擴(kuò)增出一條751bp片段，待檢測的樣品為非轉(zhuǎn)基因水稻。
[0014] 其中，所述的從待檢測水稻樣品中提取DNA的方法，可以是從植物材料中提取DNA 的各種常用方法，例如可以是CTAB法、SDS法或經(jīng)驗證適用于植物DNA提取的試劑盒等各 種方法。
[0015] 所述PCR擴(kuò)增體系按照以下方式建立：反應(yīng)體系的總體積為25. OyL，其中， 10XLA Taq Buffer II(Mg 2+Plus)緩沖液 2.5yL，5U/yL 的 TaKaRa LA Taq 聚合酶 0.25yL，dNTP Mixture(2.5mM each)4.0yL，10ymol/L SEQ ID No.l 所示的引物 lyL， 10 4!11〇1/13￡0 10吣.2所示的引物11^，25即/1^0嫩模板2 1^，余量為雙蒸水。
[0016] 所述PCR擴(kuò)增的條件為：94°C變性 lmin ;98°(：，1〇8,66°(：，5111111，30個循環(huán)；72°(：延 伸 10min〇
[0017] -種轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測試劑盒，包括： 10XLA Taq Buffer II 緩沖液，TaKaRa LA Taq 聚合酶，dNTP Mixture，引物和雙蒸水；所 述引物的核苷酸序列為序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的序列。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明檢測方法能夠準(zhǔn)確的檢測出 轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)，為轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15成分檢測 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制、轉(zhuǎn)基因定量檢測、樣品鑒定奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 圖1是PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15純合體瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0020] 圖中，M :1Kb plus DNA Marker ;1 :空白對照；2 :PA110-15 受體；3 :PA110-15 純合 體；4 :PA110-15受體和PA110-15純合體混合樣品。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保 護(hù)范圍并不受【具體實施方式】的限制。
[0022] 實施例1轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合/雜合狀態(tài)的PCR檢測方法的建立
[0023] 1、引物設(shè)計及序列
[0024] 該轉(zhuǎn)化體外源整合結(jié)構(gòu)位于水稻基因組4號染色體上，其中，引物PA110-LA-F位 于5'端水稻基因組上；引物PA110-LA-R位于3'端水稻基因組上。
[0025] 引物序列
[0026] PA110-LA-F ：TCGATCAGTGCATCTGCTGTGGCT(SEQ ID No. 1)〇
[0027] PA110-LA-R ：TCATACATAGGAATGCGAAGCCGAAGAT(SEQ ID No. 2)〇
[0028] 2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序：
[0029] 反應(yīng)體系：10XLA Taq Buffer II(Mg 2+Plus)緩沖液2. 5yL，TaKaRa LA Taq(5U/ y L)聚合酶 0? 25 y L，dNTP Mixture (2. 5mM each) 4. 0 y L，10 y mol/L SEQ ID No. 1 所示的 引物11^，10 4111〇1/13￡0 10吣.2所示的引物11^，25即/1^0嫩模板2 1^，用去離子水 補(bǔ)至25yL。
[0030] 由于擴(kuò)增大的基因片段出現(xiàn)假陰性的概率較大，常常將雜合轉(zhuǎn)基因水稻誤認(rèn) 為是非轉(zhuǎn)基因水稻，因此，有必要優(yōu)化一下反應(yīng)體系，使得出現(xiàn)假陰性的概率降低，通 過反復(fù)實驗，摸索出來一套假