陰性出現(xiàn)概率極低的反應(yīng)體系如下：l〇XLA Taq Buffer II (Mg2+Plus)緩沖液2. 5 y L，TaKaRa LA Taq (5U/ y L)聚合酶0? 25 y L，dNTP Mixture (2. 5mM 6&(*)4.0 1^，10 4111〇1/15￡0 10吣.1所示的引物11^，10 4111〇1/15￡0 10吣.2所示的引 物1 yL，25ng/yL DNA模板2yL，牛血清蛋白1 yL(l yg/yL)或槐耳多糖蛋白1 yL(l yg/ yL)，用去離子水補至25 yL。所述槐耳多糖蛋白采用專利201310144971. 9所公開的方法 制備。
[0031] PCR 擴增程序：94°C變性 lmin ; (98°C 10s，66°C 5min)30 個循環(huán)；72°C延伸 10min。
[0032] 3、結(jié)果判定
[0033] 純合轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15中僅能擴增出一條3856bp的片段；雜合轉(zhuǎn)基因水稻 PA110-15同時擴增出兩條片段，一條為3856bp，另一條為751bp ;而非轉(zhuǎn)基因水稻中只能擴 增出一條751bp片段。
[0034] 實施例2轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合/雜合狀態(tài)的PCR檢測的應(yīng)用實驗
[0035] 一、植物材料
[0036] 1、轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15純合體；
[0037] 2、非轉(zhuǎn)基因水稻：PA 110-15受體；
[0038] 3、PA110-15受體和PA110-15純合體混合樣品。
[0039] 二、實驗方法
[0040] (一）、植物基因組DNA的提取與檢測
[0041] 1植物材料DNA提取
[0042] 1. 1試劑盒法提取水稻基因組DNA
[0043] 采用植物基因組DNA提取試劑盒DP305 (天根生化科技有限公司）進行PA110-15 水稻及其受體水稻基因組DNA提取和純化.
[0044] 1. 2提取方法
[0045] 1)取200mg水稻粉末樣品；
[0046] 2)加入800 y L65°C預(yù)熱的GP1緩沖液，迅速顛倒混勾，將離心管放在65°C水浴 lh，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。
[0047] 3)加入等體積酸：氯仿（1:1)，充分混勾，12000rpm離心10min。
[0048] 4)轉(zhuǎn)移上清至一新離心管，加入等體積氯仿，充分混勾，12000rpm離心10min。
[0049] 5)取上清，加入等體積GP2，充分混勻。
[0050] 6)將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12000rpm離心30s，棄掉廢液（吸附柱容積 700 y L，可分次加入離心）。
[0051] 7)向吸附柱CB3中加入500 y L緩沖液⑶，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附 柱CB3放入收集管中。
[0052] 8)向吸附柱CB3中加入600 y L漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附 柱CB3放入收集管中。
[0053] 9)重復(fù)步驟8。
[0054] 10)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3至 于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0055] 11)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位加入60yL 0. 1 X TE緩沖液，室溫放置5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。
[0056] 2DNA 檢測
[0057] 采用紫外分光光度計檢測DNA濃度與純度時，DNA應(yīng)在0D26。處有顯著吸收峰， 0D 26Q/0D比值應(yīng)為 1. 7-1. 9。
[0058] (二）、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序的建立
[0059] 按照實施例1所述的PCR擴增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進行。
[0060] 三、實驗結(jié)果
[0061] 實驗結(jié)果如圖1所示；純合體PA110-15僅能擴增出一條3856bp的片段；PA110-15 受體和PA110-15純合體混合樣品擴增出兩條片段，一條為3856bp，另一條為751bp ;非轉(zhuǎn)基 因水稻只能擴增出一條751bp片段。
[0062] 以上公開的僅為本發(fā)明的具體實施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的 技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測引物，其特征在于，所 述引物為 ：?411〇-1^4，其核苷酸序列如序列表3￡〇10如.1所示；?411〇-1^-1?，其核苷酸 序列如序列表SEQ ID No. 2所示。2. -種轉(zhuǎn)基因水稻PAl 10-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測方法，其特征在于，按 照如下步驟進行： (1) 提取待檢測水稻樣品的DNA ; (2) 以提取的DNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列為擴增引 物，建立PCR擴增體系并進行PCR擴增； (3) 如果僅擴增出一條3856bp片段，則待檢測的樣品為純合轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15 ;如 果擴增出3856bp和751bp的兩條片段，待檢測的樣品為雜合轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15 ;如果只 擴增出一條751bp片段，待檢測的樣品為非轉(zhuǎn)基因水稻。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因水稻PAl 10-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測方 法，其特征在于，所述PCR擴增體系按照以下方式建立：反應(yīng)體系的總體積為25. 0 y L，其 中，10 X LA Taq Buffer II (Mg 2+Plus)緩沖液 2. 5 y L，5U/y L 的 TaKaRa LA Taq 聚合酶 0.25yL，dNTP Mixture(2.5mM each)4.0yL，10ymol/L SEQ ID No.l 所示的引物 lyL， 10 4!11〇1/13￡0 10吣.2所示的引物11^，25即/1^0嫩模板2 1^，余量為雙蒸水。4. 根據(jù)權(quán)利要求2述的轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測方 法，其特征在于，所述PCR擴增的條件為：94°C變性Imin ;98°(：，1〇8,66°(：，5111111，30個循環(huán)； 72°C延伸 IOmin。5. -種轉(zhuǎn)基因水稻PAl 10-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測試劑盒，其特征在于， 包括：10XLA Taq Buffer II 緩沖液，TaKaRa LA Taq 聚合酶，dNTP Mixture，引物和雙蒸 水；所述引物的核苷酸序列為序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因純合雜合狀態(tài)的PCR檢測引物及其檢測方法。所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示。本發(fā)明還公開了其檢測的方法，本發(fā)明檢測方法能夠準(zhǔn)確檢測出轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15外源基因插入的純合/雜合狀態(tài)，為轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15成分檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制、轉(zhuǎn)基因定量檢測、樣品鑒定奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105132582
【申請?zhí)枴緾N201510685232
【發(fā)明人】李亮, 金蕪軍, 安娜, 馬曉嬌, 宛煜嵩, 柳方方, 董美, 苗朝華, 黃衛(wèi)紅
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年10月20日