專利名稱：：在轉(zhuǎn)基因水稻中高效生產(chǎn)木聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域中利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)酶制劑的方法，尤其是涉及利用轉(zhuǎn)基因水稻生產(chǎn)木聚糖酶的方法。
背景技術(shù)：
：我國是世界上飼料原料需求大國，隨著詞料糧總需求量不斷增加，其缺口也逐年增大。我國養(yǎng)殖業(yè)的能量詞料資源十分短缺，而作為我國大宗糧食作物一水稻的秸稈和谷粒由于富含木聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子詞用效率低下。谷物飼料中的木聚糖是一種不能被單胃動(dòng)物消化吸收的抗?fàn)I養(yǎng)因子(Bedford,1995;Choct等，1990)，在動(dòng)物胃腸道的消化吸收過程中與金屬離子、蛋白質(zhì)和一些營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合成不易被吸收利用的物質(zhì)，不僅增加飼料成本還降低了動(dòng)物的生產(chǎn)性能。我國是世界上最大的養(yǎng)殖國之一，動(dòng)物在將詞料營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為畜產(chǎn)品的過程中，有很多食入養(yǎng)分未吸收而被排入到環(huán)境中去，對土壤和水源造成巨大污染(N、P的污然最為嚴(yán)重)。我國每年產(chǎn)生禽畜糞便10多億噸，養(yǎng)殖業(yè)對生態(tài)環(huán)境造成了很大威脅。如何通過飼料改良減輕動(dòng)物糞便造成的污染問題，是農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展需要解決的迫切問題。木聚糖酶(EC3.2丄8)能水解谷物和秸稈中的木聚糖，在半纖維素降解中起著關(guān)鍵作用，可大幅度提高纖維素類物質(zhì)的利用效率，具有廣泛應(yīng)用前景(Biely，1985;孫建義，1998)。研究表明，在肉雞飼料中添加含木聚糖酶的酶制劑能提高飼料轉(zhuǎn)化效率和生長速率10%以上，木聚糖酶能提高稻谷不同養(yǎng)分消化率7.16%-96.46%;肉雞生長速度和詞料轉(zhuǎn)化效率分別提高了17.1-20.0%和15.2-15.9%，并接近玉米飼料水平(李衛(wèi)芬等，1999;2004;王敏奇等，2003)。木聚糖酶主要作用機(jī)理通過有效降解谷物飼料細(xì)胞壁中的木聚糖，使胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來，有利于動(dòng)物消化酶分解；并通過消化酶活性的提高和消化道內(nèi)容物粘度的降低，維持消化道正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高飼料養(yǎng)分的消化吸收率，減少大腸桿菌數(shù)量使畜禽的腹瀉率大幅度降低，促進(jìn)動(dòng)物健康生長；從而提高谷物飼料轉(zhuǎn)化效率，接近玉米相同的飼養(yǎng)效果，并大幅度降低飼料成本，提高養(yǎng)殖業(yè)的飼料報(bào)酬。此外，還具有減少畜禽排泄物中有害物質(zhì)(氮和磷)排放量和代替抗生素的功效，經(jīng)濟(jì)效益十分顯著(Bedford,1995;Choct等，1995)。因此世界各國尤其發(fā)達(dá)國家均普遍使用微生物酶制劑來提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益(Cassen,1996;居乃琥，2000)。目前用于提高飼料利用率的木聚糖酶均來自微生物(Wong等，1988;劉明啟等，2004)，一般采用微生物發(fā)酵系統(tǒng)生產(chǎn)木聚糖酶，但其使用成本仍然較高，從而制約了木聚糖酶的廣泛應(yīng)用(Kimura等，2003)。利用植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)酶制劑是近年發(fā)展起來的生物新技術(shù)，主要是釆用特異啟動(dòng)子誘導(dǎo)外源重組酶基因在農(nóng)作物中高效表達(dá)，使農(nóng)作物的莖、葉或種子等組織富含重組酶。利用該技術(shù)獲得的農(nóng)作物新品種不僅可大規(guī)模生產(chǎn)酶制劑，而且其秸稈和/或種子可加工優(yōu)質(zhì)飼料，從而降低養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)成本，大幅度提高生產(chǎn)效率(Goddijinetal.，1995,Hellwigetal.，2004;Whitelam，1995)。已有的研究表明，利用轉(zhuǎn)基因模式植物一煙草作為生物反應(yīng)器開展的微生物木聚糖酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及表達(dá)研究己經(jīng)獲得成功(Sun等，1997;Herbers等，1995;1996)。Herbers等人(1995，1996)將熱纖梭菌木聚糖酶XynZ和瘤胃微生物木聚糖酶D導(dǎo)入煙草表達(dá)，且沒有危害煙草的生長。微生物木聚糖酶也在油菜籽中獲得了表達(dá)，它定位于油菜種子中的油質(zhì)體膜上，實(shí)現(xiàn)了外源基因與植物油體特異調(diào)控基因的融合表達(dá)(Liu等，1997)。2000年澳大利亞的Patel等人將瘤胃真菌木聚糖酶基因(xynA)導(dǎo)入大麥胚乳中表達(dá)，這些研究表明利用微生物木聚糖酶基因在植物中的高效表達(dá)來生產(chǎn)木聚糖酶是一條可行的技術(shù)途徑。但是有關(guān)微生物木聚糖酶在其它農(nóng)作物中表達(dá)的研究很少。鑒于水稻是我國重要的農(nóng)作物，將來源于微生物并經(jīng)過人工修飾能耐受飼料制粒等高溫加工的木聚糖酶重組基因轉(zhuǎn)移到水稻中表達(dá)，利用農(nóng)作物如水稻的稻葉和秸稈來生產(chǎn)飼用酶有廣泛的應(yīng)用前景，迄今為止，在國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種在轉(zhuǎn)基因水稻中高效生產(chǎn)木聚糖酶的方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種轉(zhuǎn)基因水稻中高效生產(chǎn)木聚糖酶的方法，該方法包括以下步驟(1)構(gòu)建含有木聚糖酶基因的植物表達(dá)載體。(2)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)得到轉(zhuǎn)基因植株，使木聚糖酶基因在轉(zhuǎn)基因植株的種子、莖葉中表達(dá)。進(jìn)一步地，所述步驟(1)具體為將木聚糖酶重組基因atx添加Ru3印片段后，插入到植物表達(dá)載體pXYL06上，獲得Atx-Ru3印-pXYL06載體，將載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105,獲得工程菌Atx-EHA105，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將木聚糖酶基因?qū)胨净蚪M中。所述步驟(2)具體為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將木聚糖酶重組基因?qū)胨净蚪M中，經(jīng)過抗性篩選、分化和生根培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明方法將來源于微生物并經(jīng)過人工修飾能耐受飼料制粒等高溫加工的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)移到水稻中，并在水稻葉片、莖桿和種子中高效表達(dá)，培育富含木聚糖酶的詞料稻品種，可以大量、廉價(jià)生產(chǎn)木聚糖酶。而且轉(zhuǎn)木聚糖酶基因水稻的谷?？捎糜趩挝竸?dòng)物詞料，稻葉和秸稈可以作為反芻動(dòng)物飼料，而無需在詞料中添加通過發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的木聚糖酶添加劑，對于稻谷及其秸稈的開發(fā)利用具有重要意義，不僅提高農(nóng)作物價(jià)值，而且可減少作為"膠囊化木聚糖酶"飼料的轉(zhuǎn)基因作物在單位飼料中的使用量，降低飼料成本。無論從經(jīng)濟(jì)角度還是使用方便的角度來說，都更具優(yōu)勢。優(yōu)勢如下1、原材料通過農(nóng)業(yè)方式獲得，生產(chǎn)成本低廉，水稻的谷粒和秸稈均可以直接飼喂動(dòng)物或加工飼料；2、相對于發(fā)酵的方法，使用植物生物反應(yīng)器，無需發(fā)酵工藝設(shè)備，大大降低資本投資；3、水稻是我國重要的農(nóng)作物，生產(chǎn)規(guī)?？梢匝杆贁U(kuò)大。圖1是表達(dá)載體pXYL06的物理圖譜；圖2是PCR擴(kuò)增得到的木聚糖酶基因電泳圖譜，圖中，l為標(biāo)準(zhǔn)分子量，2為木聚糖酶基因(640bp);圖3是表達(dá)載體的酶切電泳圖，圖中，l為標(biāo)準(zhǔn)分子量，2為pXYL06質(zhì)粒，3為pXYL06質(zhì)粒，4為木聚糖酶基因(640bp)atx-Ru3ep-pXYL06載體BamHl/Pstl雙酶切；圖4是用于轉(zhuǎn)化的目的基因電泳圖譜，圖中，1為marker(100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp、2000bp、3000bp)，2為atx-Ru3ep-pXYL06質(zhì)粒(轉(zhuǎn)化后的EHA105中抽提)，3為atx-Ru3ep-1301EHA105菌液，4為陽性對照atx-Ru3ep-pXYL06質(zhì)粒，5為陰性對照pXYL06質(zhì)粒，6為陰性對照EHA105菌液；圖5是再生植株P(guān)CR檢測木聚糖酶基因的電泳圖，圖中，1為marker,2為陽性質(zhì)粒，3為野生水稻，4-8為轉(zhuǎn)基因水稻；圖6是再生植株RT-PCR檢測木聚糖酶基因的電泳圖，圖中，l為marker,2-3、5-6為轉(zhuǎn)基因水稻，4為野生水稻；圖7是轉(zhuǎn)基因水稻潮霉素快速檢測圖，圖中1為野生水稻，2和4為未轉(zhuǎn)化水稻，3和5-8為轉(zhuǎn)基因水稻；圖8是轉(zhuǎn)基因水稻的形態(tài)及木聚糖酶活性圖，圖中，1-3為轉(zhuǎn)基因水稻，4為野生水稻。具體實(shí)施方式用植物作為反應(yīng)器來生產(chǎn)重要的、有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蛋白質(zhì)是"分子農(nóng)業(yè)"發(fā)展的新趨勢。水稻是我國重要的農(nóng)作物，在已成功構(gòu)建能編碼優(yōu)良性能木聚糖酶的重組基因基礎(chǔ)上(GenBankAccessionNo.AY858101)，根據(jù)植物基因表達(dá)特點(diǎn)，構(gòu)建適合單子葉植物轉(zhuǎn)化的木聚糖酶基因表達(dá)載體，以水稻為轉(zhuǎn)基因材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將已構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入水稻愈傷組織中；經(jīng)HYG抗性來選擇轉(zhuǎn)基因水稻，并采用分子鑒定等技術(shù)進(jìn)行檢測，同時(shí)分析木聚糖酶的表達(dá)水平，獲得利用轉(zhuǎn)基因水稻生產(chǎn)木聚糖酶的方法。本發(fā)明在轉(zhuǎn)基因水稻中高效生產(chǎn)木聚糖酶的方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建含有木聚糖酶基因的植物表達(dá)載體；本發(fā)明的木聚糖酶基因是來源于褐色單孢菌和枯草芽孢桿菌的重組基因，重組基因能較好耐受飼料制粒等的高溫，重組基因GenBank登錄號為AY858101。首先構(gòu)建用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的木聚糖酶基因表達(dá)載體以經(jīng)修飾的重組基因置于組成型啟動(dòng)子(CaMV35S)驅(qū)動(dòng)之下，表達(dá)載體中有報(bào)告基因gus和篩選標(biāo)記基因hyg(潮霉素抗性基因)，攜帶目的基因的雙元表達(dá)載體的酶基因末端插入6個(gè)his序列，便于木聚糖酶表達(dá)產(chǎn)物的純化。上述表達(dá)載體的構(gòu)建是通過如下方法完成木聚糖酶重組基因atx添加Ru3ep片段后(編碼基因序列Nol，Ru3ep片段序列No2)，插入到植物表達(dá)載體pXYL06上，獲得Atx-Ru3ep-pXYL06載體，將載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105,獲得工程菌Atx-EHA105，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將木聚糖酶基因?qū)胨净蚪M中，所選外植體為水稻幼胚或成熟胚誘導(dǎo)形成的愈傷組織。(2)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)得到轉(zhuǎn)基因植株，使木聚糖酶基因在轉(zhuǎn)基因植株的種子、莖葉中表達(dá)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將木聚糖酶重組基因?qū)胨净蚪M中，經(jīng)過抗性篩選、分化和生根培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。通過PCR、Northern雜交對轉(zhuǎn)化水稻植株進(jìn)行分子鑒定，驗(yàn)證外源基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。最后對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行木聚糖酶的活性分析。以下五個(gè)實(shí)施例詳細(xì)闡明了本發(fā)明的具體實(shí)施方式。實(shí)施例l:木聚糖酶表達(dá)載體的構(gòu)建1、材料的準(zhǔn)備木聚糖酶基因使用GenBank登錄號為AY858101的木聚糖酶基因。菌種大腸桿菌Eco//DH5a、根癌農(nóng)桿菌EHA105。各種限制性內(nèi)切酶、pGEM^質(zhì)粒和T-載體購自Promega公司?；瘜W(xué)試劑酵母浸膏和胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司，組織培養(yǎng)用試劑購自Sigma公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成上海博亞生物技術(shù)有限公司，測序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。2、木聚糖酶基因表達(dá)載體構(gòu)建Ru3ep克隆導(dǎo)入到pGElvfT-載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定測序后得到pGEME/H，Xba/和Pst/酶切pGEMRu3印，Bami//和XbaI酶切pGEMAtx，分別回收目的片段，將兩片段加T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定測序后得到pGEMAtxE/H。Bamif/和Pst/酶切pGEMAtxE/H，Bami//和Pst/酶切pXYL06質(zhì)粒，瓊脂糖電泳回收目的片段，兩片段加T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定測序后得到Atx-E/H-pXYL06載體。實(shí)施例2:遺傳轉(zhuǎn)化的前期準(zhǔn)備1.水稻轉(zhuǎn)化起始材料的獲得以水稻幼胚誘導(dǎo)愈傷組織取水稻未成熟種子(灌漿期)消毒，用鑷子夾住種子擠出幼胚，置入N6培養(yǎng)基中，25-28'C暗處培養(yǎng)5天；繼代培養(yǎng)時(shí)，用鑷子剝胚性愈傷組織(去掉芽及膜狀物)，置入繼代培養(yǎng)基中(突起面向上)，25—28"C暗處培養(yǎng)3天。以水稻成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織取水稻成熟種子，人工或者機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子消毒，置入N6培養(yǎng)基中，28'C光照培養(yǎng)3周；繼代培養(yǎng)時(shí)，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織(淡黃色，致密呈球狀)，置入繼代培養(yǎng)基中，在28'C光照培養(yǎng)1周。上述水稻幼胚和成熟胚的胚性愈傷均可作為轉(zhuǎn)化起始材料，培養(yǎng)基的配置參照"PlantCell,TissueandOrganCulture:fimdamentalmethods，，(O丄.Gamborg，G.C.Phillipseds"Springer)。2.農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)制備1)菌單菌落，接種于5mlLB/YEP液體培養(yǎng)基(rif50mg/L)，28°C，200rpm，培養(yǎng)16—24h;2)取2ml培養(yǎng)物于50ml新的培養(yǎng)基種繼續(xù)培養(yǎng)到OD800=0.5左右；3)5000卬m4t;離心5min棄上清，回收菌體；4)10ml預(yù)冷的O.lMNaCl懸浮，5000rpm4。C離心5min，棄上清，回收菌體；5)2ml預(yù)冷的0.05MCaC12(含甘油0.5ml)懸??；6)200ul每管分裝，液氮速凍，-S(TC保存。實(shí)施例3:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化1、Atx-E/H-1301載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA1051)從-80'C冰箱中取出200ul感受態(tài)細(xì)胞農(nóng)桿菌EHA105，冰浴化開；2)往200ul感受態(tài)細(xì)菌中加入3-5ulAtx-Ru3ep-pXYL06Vector質(zhì)粒，快速輕輕混勻，冰浴靜置30min;3)快速浸入液氮，維持5min，再37'C冰浴5min;4)加入4倍無抗生素的液體培養(yǎng)基，混勻，28。C搖2—4h;5)涂布前一般將菌液濃縮為原感受態(tài)細(xì)胞體積，即4000—5000rpm離心5min，取部分上清，再用槍頭吹吸均勻，最后涂布至培養(yǎng)基(rif+，50ug/mhKm+，50ug/ml)表面。培養(yǎng)前，需28。C正放lh至菌液完全吸收，再倒放48h以上；6)挑斑搖菌(rif+，50ug/ml;Km+，50ug/ml),抽質(zhì)粒做PCR驗(yàn)證。2、農(nóng)桿菌培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保存的農(nóng)桿菌菌液100ul于5mlYEP(含50mg/lKm和50mg/lRif)培養(yǎng)液中，28°C，220rpm振蕩培養(yǎng)20-24h至菌液OD600的終濃度為0.1—0.8;3、轉(zhuǎn)化將搖好的適量農(nóng)桿菌菌液置于離心管中，4°C，4000rpm，離心2min，去上清。用含乙酰丁香酮200umol/l的AAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD600的終濃度為0.01;將長到一定大小的水稻胚性愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染約20min;將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上(在培養(yǎng)基上鋪一層無菌濾紙)，25-C暗培養(yǎng)2—3天。4、選擇培養(yǎng)將愈傷組織用無菌水清洗5-6次，轉(zhuǎn)入含500mg/l頭孢拉定(或頭孢噻肟鈉)和50mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上，28'C光照培養(yǎng)2周；將存活的抗性愈傷轉(zhuǎn)到含500mg/l頭孢拉定(或頭孢噻肟鈉)和50mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇，28。C光照培養(yǎng)2周，長出顆粒性的抗性愈傷組織。5、再生挑取顏色鮮黃的抗性愈傷，移入裝有分化培養(yǎng)基，生長迅速，3-4周后分化成苗。待苗長至lcm左右，放入生根培養(yǎng)基中生根壯苗，即得到再生水稻苗。實(shí)施例4再生植株的檢測1、轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA提取參照《植物基因工程》中CTAB法提取(王關(guān)林、方宏筠主編，2002)1)取0.2-0.5g新鮮葉片，于含有液氮的研缽內(nèi)輕輕碾碎冷凍的葉片樣品。一旦組織開始融化，加入700plCTAB提取緩沖液；2)樣品于65。C溫育30-60min;然后加入等體積氯仿異戊醇乙醇混合液混勻的于室溫放置15min;12000r/min離心10min;3)用除去尖端的移液尖頭小心地將上層水相移至另一離心管內(nèi)，務(wù)必避免界面蛋白質(zhì)和底部有機(jī)相葉綠素的污染；4)加入約2/3體積的預(yù)冷的異丙醇(-20°C)，小心混勻，放置5min;5)12000r/min，離心10min，傾去上清，得DNA沉淀；6)沉淀用70%酒精洗滌兩次，離心棄上清；風(fēng)干后溶于500^1含200嗎/LRNase的ddH20中。加入等體積氯仿異戊醇乙醇混合液，混勻，12000r/min，離心10min;7)小心取出上清加入1/10體積的NaAc(pH5.2)和兩倍體積的無水乙醇，混勻。-20。C放置30min;12000r/min，離心5min。去上清；8)沉淀用70%酒精洗滌，室溫干燥后溶于50pl無菌水中，用于PCR檢測。2.再生植株的PCR檢測木聚糖酶基因檢測引物5RX01:5垂AGGATCCAACCATGGCTGTTACATCCAACGAGAC-33RX02(30bp):5畫CCTGCAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAC-3反應(yīng)體系(50W):再生植株DNAl,Ojxl;10xPCRbuffer5.0jnl;MgC12;3.(Vl;dNTP1.0pl;5RX011.0ul;3RX011.0^1;Taq酶0.5^1;加水至50fil。反應(yīng)條件94°C，2min;94。C，50s;62。C，50s;(-0.2。Cpercycle)72。Clmin;35個(gè)循環(huán)；72'C延伸10min。篩選出的陽性植株(如圖5所示)。3、轉(zhuǎn)基因水稻植株總RNA的RT-PCR分析1)水稻總RNA的提取取基因組DNA的PCR驗(yàn)證為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻的葉片50-100mg于研缽中，用液氮浸泡并磨成粉末，轉(zhuǎn)入1.5mleppendorf管中，加入lmlTrizol試劑，劇烈振蕩，放置5min;加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，12000r/min離心30s;取上層水相于一新1.5mleppendorf中，力Q0.5ml異丙醇，于-20。C下放置30min，12000r/min離心10min;棄上清液，力nlml75%乙醇，混合，12000r/min離心2min;棄上清液，室溫或真空干燥沉淀，加20-100lil水，于-2(TC下貯存。2)第一鏈cDNA的合成采用上海生工生物工程有限公司的MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒，在冰浴的試管中加入如下反應(yīng)混合物總RNA1-5|xl01igo(dT)18(0.5嗎1|ilRnase-freeddH206國llj^1Total12(il輕輕混勻后離心3-5s;反應(yīng)混合物在7(TC下水浴5min后，冰浴30s，然后離心3-5s;將試管冰浴，再加入如下組分5xReactionbuffer4jxlRNaseInhibitor(20U/|il)1|ildNTPMix(lOmmol/L)__輕輕混勻后離心3-5s;37。C水浴5min，加入l^ilM-MuLVRT(200U/pl)終體積為200^1;反應(yīng)混合物37'C水浴60min;在70'C加熱lOmin結(jié)束反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或冷凍保存。3)cDNA的PCR分析利用木聚糖酶基因的特異性引物5RX01和3RX02對cDNA進(jìn)行PCR分析，PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上，僅是反應(yīng)的模板換成cDNA。RT-PCR分析檢測結(jié)果見圖6。結(jié)果表明木聚糖酶基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因水稻后代中木聚糖酶活性的檢測轉(zhuǎn)基因水稻TO代植株經(jīng)過分子檢測，木聚糖酶基因?yàn)殛栃缘闹仓曜越皇诜劢Y(jié)實(shí)后，所的種子為T1種子。Tl種子播種后可以正常萌發(fā)、發(fā)育成T1植株。對T1植株進(jìn)行PCR檢測，自交授粉，得到T2種子。選擇PCR檢測木聚糖酶基因?yàn)殛栃缘腡1植株用來進(jìn)行植酸酶活性分析。1)木聚糖酶活力單位定義每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于lpmol還原糖(以木糖計(jì))的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。2)試劑木聚糖和活性亮藍(lán)木聚糖(RemanzolbrilliantblueRXylan,RBB-Xylan)購自美國Sigma公司。pH3-7為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，100ml緩沖液按以下比例混勻。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>提取緩沖液(50mM檸檬酸鈉pH6，含10mMEDTA，lmMDTT，0.1%Triton)1%木聚糖，DNS試劑取50.0(^3，5-二硝基水楊酸溶于400ml水中，邊攪拌邊加入80.0gNaOH讓其溶解，然后漸漸加入150g酒石酸鉀鈉，加熱至45'C,冷卻定容至5000ml,放于棕色瓶中，室溫保存。3)P-l，4-內(nèi)切木聚糖酶活性測定參見文獻(xiàn)Baileyetal.(1989)。用樺木木聚糖為底物，用DNS法測定P-l，4-內(nèi)切木聚糖酶活性。(3-l,4-內(nèi)切木聚糖酶活性測定在試驗(yàn)管和空白管中各加入1.8ml木聚糖底物，在一定溫度下水浴中預(yù)熱5min;在試驗(yàn)管中加20(Hd樣品搖勻；精確反應(yīng)10min后，兩個(gè)管中都加入3.OmlDNS試劑。在空白管中再加入200|nl樣品。將兩個(gè)試管同時(shí)沸水浴5min，取出試管，冷卻至室溫；然后以空白為對照在540nm處測定樣品的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算酶活。4)準(zhǔn)曲線制作配制好10|amol/ml木糖母液(150mg木糖溶解于合適緩沖液中，定容至100ml)。用相應(yīng)緩沖液稀釋母液，使之成為0l(^mol/ml木糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液做三個(gè)重復(fù)，各試管中加入1.8ml底物，再加200pl標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，后面操作步驟和樣品測定相同。空白為加入200nl相應(yīng)緩沖液而代替加入200nl標(biāo)準(zhǔn)液。5)轉(zhuǎn)基因水稻葉片木聚糖酶活性的測定，取0.2g葉片加液氮研磨，加入lml提取緩沖液，15，000g離心l.O分鐘，上清也既為酶的粗提液。6)木聚糖酶活性測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因水稻中木聚糖酶活性比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭叱?0倍，表明木聚糖酶基因在水稻葉片中表達(dá)。進(jìn)一步選育穩(wěn)定遺傳的、高表達(dá)木聚糖酶活性的水稻新種質(zhì)材料，供水稻育種和生產(chǎn)使用。權(quán)利要求1、一種在轉(zhuǎn)基因水稻中高效生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)構(gòu)建含有木聚糖酶基因的植物表達(dá)載體。(2)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)得到轉(zhuǎn)基因植株，使木聚糖酶基因在轉(zhuǎn)基因植株的種子、莖葉中表達(dá)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在轉(zhuǎn)基因水稻中高效生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體為將木聚糖酶重組基因atx添加Ru3印片段后，插入到植物表達(dá)載體pXYL06上，獲得Atx-Ru3印-pXYL06載體，將載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，獲得工程菌Atx-EHA105,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將木聚糖酶基因?qū)胨净蚪M中。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的在轉(zhuǎn)基因水稻中高效生產(chǎn)木聚糖酶的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將木聚糖酶重組基因?qū)胨净蚪M中，經(jīng)過抗性篩選、分化和生根培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。全文摘要本發(fā)明公開了一種在轉(zhuǎn)基因水稻中高效生產(chǎn)木聚糖酶的方法，本發(fā)明的技術(shù)方案是構(gòu)建含有木聚糖酶重組基因的、能在植物中高效表達(dá)的載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻幼胚或成熟胚誘導(dǎo)形成的愈傷組織，得到轉(zhuǎn)基因植株，使木聚糖酶在轉(zhuǎn)基因植株的莖、葉和種子中表達(dá)。采用本發(fā)明方法獲得的轉(zhuǎn)基因水稻是富含木聚糖酶的飼料稻品種，轉(zhuǎn)木聚糖酶基因水稻的谷?？捎糜趩挝竸?dòng)物飼料，稻葉和秸稈可以作為反芻動(dòng)物飼料，可方便直接地用于飼料中而無需在飼料中添加通過發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的木聚糖酶添加劑，提高谷物飼料轉(zhuǎn)化效率，大幅度降低飼料成本，經(jīng)濟(jì)效益十分顯著。文檔編號C12N15/56GK101319206SQ20081006305公開日2008年12月10日申請日期2008年7月8日優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日發(fā)明者孫建義,翁曉燕申請人:浙江大學(xué)