一對高效編輯水稻waxy基因的talen其識別打靶位點(diǎn)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一對高效編輯水稻 WAXY基因的TALEN其識別打祀位點(diǎn)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 稻米在世界上的種植可追溯到10000年前，有著悠久的歷史，同時稻米養(yǎng)活了世 界人口的50%。隨著社會生活水平的提高，人民生活水平的不斷改善，人們對稻米的要求 從量上逐步轉(zhuǎn)向?yàn)橘|(zhì)的要求，所W稻米的品質(zhì)性狀越來越受到人們的關(guān)注。稻米品質(zhì)主要 由碼磨品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)組成。其中蒸煮食味的品質(zhì)是消費(fèi)者最為 關(guān)必的指標(biāo)。稻米食用品質(zhì)的優(yōu)劣很大程度上與稻米胚乳中直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對含 量有關(guān)。直鏈淀粉含量高的稻米，米飯回生性大，米粉難W糊化，其米飯質(zhì)地過硬，巧嚼有渣 感，無彈性，光澤度變差。水稻胚乳中直鏈淀粉的合成主要是由WAXY基因編碼的淀粉顆粒 結(jié)合型淀粉合成酶（Granule-boundstarchsynthase,GBSS)控制的。我國科學(xué)家在863計 劃轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)等項(xiàng)目的資助下利用我國自克隆的水稻蠟質(zhì)（waxy)基因，構(gòu)建了反義WAXY 基因，并將其成功導(dǎo)入水稻，獲得了表現(xiàn)優(yōu)良的含低直鏈淀粉含量的高產(chǎn)梗稻或梗懦新品 系。但是反義干擾技術(shù)是轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，干擾的效果不徹底，后代中也不穩(wěn)定。
[0003]近年興起的TALE(TranscriptionActivator-UkeEffector)基因組編輯 技術(shù)可W對基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行精確修飾。TALE最早發(fā)現(xiàn)于植物病原體黃單胞菌 狂anthomonas)在感染植物的過程中能特異性結(jié)合到DNA上，從而實(shí)現(xiàn)對植物基因的相關(guān) 調(diào)控。TALEN(Transc;riptionActivator-UkeEffectorNucleases),是人工地將帶有不 同C-末端TALE的短片段串聯(lián)起來，并連接到核酸酶化kl的催化結(jié)構(gòu)域上而實(shí)現(xiàn)特異序列 的剪切。TALEN由兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成和中間十幾個串聯(lián)"蛋白模塊"組成， 而送些蛋白模塊能特異性識別某段DNA。每個"蛋白模塊"包含34個氨基酸，第12和第23 位殘基被稱作重復(fù)可變的RVD值i-Resi化es)位點(diǎn)，每個RVDs僅能識別一個堿基，即NG識 別T，皿識別C，NI識別A，順識別G。不同于其他NHEJ通路基因編輯技術(shù)，DSB修復(fù)通常 不夠精確，并且很容易引入突變而干擾基因功能。由于化kl在二聚體的情況下才表現(xiàn)出活 性，所WTALE化很少出現(xiàn)脫祀效應(yīng)，但是仍然具有脫祀的報道。
[0004] 目前TALE化技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、果觸、動物和人類細(xì)胞系、擬南芥、煙草和 水稻中。盡管已經(jīng)應(yīng)用于多種生物，但是由于選擇的識別位點(diǎn)的染色體結(jié)構(gòu)抑制，DNA修飾 或無效表達(dá)或者部分TALE化折疊等因素的影響，很多祀點(diǎn)仍然不能被檢測到基因修飾或 者效率很低，應(yīng)用于個體水平上的基因敲除非常有限。本研究通過設(shè)計一對TALE化識別水 稻waxy基因的特定位點(diǎn)，能夠高效特異性在水稻個體植株中篩選獲得定點(diǎn)敲除waxy基因 的植株，從而降低水稻中的直鏈淀粉含量，通過后代的分離純化，可W進(jìn)一步獲得純和waxy 基因突變的水稻新品系，為提高我國的稻米品質(zhì)奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一對高效編輯水稻W(wǎng)AXY基因的TALEN，其識別打祀位點(diǎn)及 其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的多膚1，所述的多膚1任選自下組：
[0007] (1)具有式la所示氨基酸序列的多膚、具有式Ib所示氨基酸序列的多膚、或其組 合；
[0008] 皿NING順順NG順NING皿NG皿NG皿皿NG,式la;
[0009] 順順NGNING皿皿皿NINI順皿順NG皿皿NGNG,式扣
[0010] 各式中，NI、NG、皿、順分別代表識別A、T、G、C堿基的TALEN短片段；
[0011] (2)與式la或式扣所示氨基酸序列的多膚同源性>90%，較佳地>95%，更佳地 > 98%，最佳地> 99%的多膚，且所述多膚特異性識別水稻W(wǎng)axy基因的核巧酸序列。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，NI的氨基酸序列如SEQIDNO. : 1所示；NG的氨基酸序列如SEQ IDNO. : 2所示；皿的氨基酸序列如SEQIDNO. : 3所示；順的氨基酸序列如SEQIDNO. : 4 所示。
[0013] 優(yōu)選地，所述的多膚1具有選自下組的功能：
[0014] (1)式la多膚特異性地識別序列如SEQIDNO:20所述的多核巧酸，或如SEQID N0:20所述的多核巧酸經(jīng)一個或多個（較佳地2個）核巧酸取代所衍生的多核巧酸；其中， 所述衍生的多核巧酸是其他水稻植株中對應(yīng)于SEQIDNO:20的多核巧酸；或
[001引 似式扣多膚特異性地識別序列如SEQIDNO:21所述的多核巧酸，或如SEQID N0:21所述的多核巧酸經(jīng)一個或多個（較佳地2個）核巧酸取代所衍生的多核巧酸；其中， 所述衍生的多核巧酸是其他水稻植株中對應(yīng)于SEQIDN0:21的多核巧酸。
[0016] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核巧酸1，所述的多核巧酸1選自下組：
[0017] (1)編碼權(quán)利要求1所述多膚1的多核巧酸；
[0018] (2)由SEQIDNO. :5、6、7、8所示核巧酸序列拼接而成的編碼權(quán)利要求1所述多膚 的多核巧酸；
[001引 做與似中所示核巧酸序列的同源性>90%，較佳地>95%，更佳地>98%，最 佳地> 99%的多核巧酸；
[0020] (4)與上述（1)-(3)互補(bǔ)的多核巧酸。
[0021] 本發(fā)明的第Η方面，提供了一種分離的多膚2,所述的多膚2包括；本發(fā)明第一方 面所述的多膚1，和位于所述多膚1兩端的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的Ν端和 C端；
[0022] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的Ν端和C端為天然的或人 工改造的序列；
[002引較佳地，所述的多膚2選自下組：
[0024] (1)具有SEQIDΝ0:9或SEQIDNO: 10所示氨基酸序列的多膚；或
[002引 似與569 10^:9或569 10^:10所示氨基酸序列的多膚同源性>90%，較佳 地> 95%，更佳地> 98%，最佳地> 99%的多膚。
[0026] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種分離的多核巧酸2,所述的多核巧酸2選自下組：
[0027] (1)編碼權(quán)利要求3所述多膚2的多核巧酸；
[0028]似具有SEQIDNO: 11或SEQIDNO: 12所示核巧酸序列的多核巧酸；
[002引 做與SEQIDNO: 11或SEQIDNO: 12所示核巧酸序列的同源性> 90%，較佳地 > 95 %，更佳地> 98 %，最佳地> 99 %的多核巧酸；
[0030] (4)與上述（1)-(3)互補(bǔ)的多核巧酸。
[0031] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種位點(diǎn)特異性的核酸酶，所述的核酸酶包括：
[0032](i)識別元件，所述識別元件選自下組；權(quán)利要求1所述的多膚1，或權(quán)利要求3所 述的多膚2,W及
[003引（ω與上述識別元件ω可操作性相連的DNA切割元件；
[0034] 優(yōu)選地，所述的核酸酶選自下組：
[00對 （1)具有SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 14所示氨基酸序列的多膚；或
[003引 似與SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 14所示氨基酸序列的多膚同源性> 90%，較 佳地> 95%，更佳地> 98%，最佳地> 99%的多膚。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的DNA切割元件為DNA內(nèi)切酶。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的DNA切割元件為天然的或人工改造的化klDNA內(nèi)切酶。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的核酸酶，包括第一核酸酶和第二核酸酶，其中第一核酸酶 的識別元件為式la，而第一核酸酶的識別元件為式扣。
[0040] 本發(fā)明的第走方面，提供了一種分離的多核巧酸3,所述的多核巧酸3選自下組：
[0041] (1)編碼權(quán)利要求5所述核酸酶的多核巧酸；
[0042] 似具有SEQIDNO: 17或SEQIDNO: 18所示核巧酸序列的多核巧酸；
[0043] (3)與沈QIDNO: 17或沈QIDNO: 18所示核巧酸序列的同源性>90%，較佳地 > 95 %，更佳地> 98 %，最佳地> 99 %的多核巧酸；
[0044] (4)與上述（1)-(3)互補(bǔ)的多核巧酸。
[0045] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第二方面所述的多核巧酸1， 和/或本發(fā)明第四方面所述的多核巧酸2,和/或本發(fā)明第走方面所述的多核巧酸3。
[0046] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第八方面 所述的載體或基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核巧酸1，和/或本發(fā)明第四方面 所述的多核巧酸2,和/或本發(fā)明第走方面所述的多核巧酸3。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞來源于禾本科植物，較佳地，所述的宿主細(xì)胞為 水稻細(xì)胞。