一種LLVV-Hemorphin-6肽的制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥化學領域，具體設及一種LLVV-Hemo巧hin-6膚及制備方法及 用途，特別是設及通過具有底物專一性的蛋白酶特異性酶解血紅蛋白的方法制備一種LLVV-Hemorphin-6膚，W及此多膚在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】 陽002] 生物活性膚度iologicalactiveP巧tides)是源于蛋白質的多功能化合物，由蛋 白質中25個天然氨基酸W不同組成和排列方式構成的從二膚到復雜的線性、環(huán)形結構的 多膚的不同膚類。生物活性膚具有設及神經(jīng)、激素W及免疫調節(jié)、抗高血壓、抗細菌、抗癌、 抗氧化、清除自由基和改善食品風味等功能，成為醫(yī)藥W及食品研究的一個熱點。
[0003] 動物血液是生物活性膚的來源之一，通過生物蛋白酶解技術可W將血紅蛋白水解 成小分子膚。研究表明血紅蛋白源生物活性膚具有一系列重要的功能活性，如阿片樣活性、 ACE抑制活性、增強血管舒緩激膚活性、刺激細菌生長活性、鎮(zhèn)痛活性、抗菌活性、W及抗氧 化活性等。
[0004]阿片樣活性膚（opioidpeptide) -般為含有X-Tyr-Phe、Tyr-X-X-Phe或 Tyr-X-X-Tyr的氨基酸片段的小膚，其具有嗎啡樣活性，在鎮(zhèn)痛、調節(jié)人體情緒、脈搏、呼吸 和體溫等方面具有明顯功能。VadimT.Ivanov和VladimirZ.Pletnev等研究發(fā)現(xiàn)在牛下 丘腦、小腦、海馬體等部位發(fā)現(xiàn)了具有阿片活性小膚YPWTQ，運和血紅蛋白β鏈33-40位的 氨基酸序列一致，因此將具有YPWTQ片段的活性膚稱為化morphin膚。近年來，從血紅蛋白 中提取出此種阿片活性樣膚成為了科學家的研究熱點。 陽0化]化mo巧bin是在血液中發(fā)現(xiàn)的一類天然產(chǎn)生的內源性阿片膚，來自于血紅蛋白的β鏈。它通過阿片受體激活具有鎮(zhèn)痛功能，通過對血管緊張素轉換酶（ACE)的抑制作用 具有血壓調節(jié)功能，此外還可W提高腦啡膚的含量。J.Μ.Piot等利用胃蛋白酶和組織蛋 白酶D處理血紅蛋白，利用蛋白凝膠色譜從水解物中提取出兩種具有阿片樣活性的多膚， LVV-Hemo巧hin-7 (LVVYPWTQR巧和VVHemo巧hin-7 (VVYPWTQRF)。利用反向高效液相色譜 檢測了胃蛋白酶水解物中兩種阿片樣活性膚的酶解動力學曲線，發(fā)現(xiàn)酶解時間不同、體系 內產(chǎn)生的活性多膚的結構不同，而且隨著酶解時間的延長會導致已產(chǎn)生的活性膚被再次酶 解，造成了酶解產(chǎn)物的不確定性，為了得到最終的產(chǎn)品，只能通過凝膠色譜分離產(chǎn)品，但是 因為操作麻煩且產(chǎn)量低，無法規(guī)?；a(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明選擇具有高度底物專一性的蛋白酶，特異性酶解血紅蛋白，再通過分離提 純等方法得到結構單一的LLVV-Hemorphin-6膚，并將此多膚聯(lián)合5-氣尿喀晚用于腫瘤類 疾病的治療取得了意想不到的效果，不僅抗腫瘤活性優(yōu)于兩種藥物單獨使用，而且優(yōu)于兩 者的直接加合效果。本發(fā)明的LLVV-Hemorphin-6膚具有制備工藝穩(wěn)定，純度高，重現(xiàn)性好， 與抗腫瘤5-氣尿喀晚聯(lián)合應用協(xié)同增效的特點，有望成為臨床上治療腫瘤類疾病的輔助 用藥。

【發(fā)明內容】
陽007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種LLVV-Hemo巧hin-6膚。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種LLVV-Hemo巧hin-6膚的制備方法，為此本發(fā)明 選用具有高度底物專一性的蛋白酶，蛋白水解過程中只在膚鏈的精氨酸殘基的簇基端斷 裂，特異性酶解血紅蛋白，得到含有目標膚的蛋白水解液，通過分離提純等方法得到結構單 一的LLVV-Hemo巧hin-6 膚。
[0009] 本發(fā)明的第Ξ個目的是提供一種LLVV-Hemo巧hin-6膚作為抗腫瘤輔助用藥的用 途。
[0010] 本發(fā)明的目的主要通過W下技術方案實現(xiàn)：
[0011] 一種LLVV-Hemo巧hin-6膚，具有膚鏈的氨基酸序列見下式： LLVV-Hemorph in-6 Leu-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg
[0012]
[0013] 一種LLVV-Hemorphin-6膚的制備方法是將蛋白酶溶于含有小分子琉基化合物W 及氯化巧的緩沖溶液中活化；血紅蛋白溶于緩沖溶液中，濃度為1~50mg/mL;將血紅蛋白 和經(jīng)過活化的蛋白酶溶液W-定比例混合，4~55°C下酶解反應4~30小時，得到蛋白酶 解液；經(jīng)過一系列分離方法，從蛋白酶解液中分離出目標膚。
[0014] 本發(fā)明中所用的蛋白酶為具有底物專一性特性的蛋白酶，酶解時膚鍵斷裂部位為 膚鏈上精氨酸殘基的簇基端，如clostripain、hlcipain、GingipainR或樹脂固定化的 clostripain酶等。本發(fā)明中蛋白酶的活化是在包含有小分子琉基化合物和氯化巧的緩沖 溶液中進行；酶活化時，濃度為0. 2~lOmg/mL;4~37°C活化一段時間。本發(fā)明中蛋白酶 解時底物蛋白濃度為1~50mg/mL，W2~25mg/mL為最佳。本發(fā)明中蛋白酶解時溫度為 4~55°C，W37~50°C為最佳。經(jīng)過檢測，本發(fā)明得到的LLVV-Hemo巧hin-6膚純度在82~ 95wt%之間，得到的多膚產(chǎn)品分子量為1274化。
[0015] 一種LLVV-Hemo巧hin-6膚在制備抗腫瘤輔助用藥中的應用，特別是與5-氣尿喀 晚聯(lián)用用于治療臨床上的各種腫瘤，如：肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等。
[0016] 本發(fā)明和現(xiàn)有技術相比具有如下突出的技術優(yōu)勢：
[0017] (1)本發(fā)明得到了一種生物活性膚LLVV-Hemo巧hin-6膚，具有重要的醫(yī)用價值。
[0018] (2)本發(fā)明采用蛋白酶酶解血紅蛋白制備生物活性膚，充分開發(fā)和利用了目前利 用度低的血紅蛋白樣品，具有尤為重要的經(jīng)濟效益和社會效益
[0019] (3)與傳統(tǒng)酶解血紅蛋白方法相比，本發(fā)明得到的酶解小膚的分子結構確定，不會 因操作條件的變化而導致膚結構的差異，增強了產(chǎn)物活性膚結構的可控性。
[0020] (4)本發(fā)明目標膚的提取和純化工藝簡單，定向收集LLVV-Hemcxrphin-6膚片段， 多膚純度高達95%，工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實施例1蛋白水解液的高效液相色譜。
[0022] 圖2為本發(fā)明5-氣尿喀晚的抗腫瘤實驗結果。
[0023] 圖3為本發(fā)明實施例1-8制備的LLVV-Hemo巧hin6膚的抗腫瘤實驗結果。
[0024] 圖4為本發(fā)明實施例1-8制備的LLVV-Hemorphin6膚和5-氣尿喀晚聯(lián)用的抗腫 瘤實驗結果。
【具體實施方式】
[0025] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，其目的僅在于更好的理解本發(fā)明的內容 而非限制本發(fā)明的保護范圍： 陽0%] 實施例1
[0027] (1)蛋白酶的活化：蛋白酶clostripain3mg/mL溶于含有二硫蘇糖醇和氯化巧的 Ξ徑甲基氨基甲燒（Tris)緩沖溶液，4°C活化； 陽02引 似血紅蛋白溶于Tris緩沖溶液中，濃度為20mg/mL，將血紅蛋白和經(jīng)過活化的 蛋白酶溶液混合，55°C酶解4小時；HPLC分析酶解液中組分及分子量，確定目標膚的出峰時 間，結果見圖1。