CloningKit說明進行。
[023引實施例8結(jié)果分析
[023引 定點敲除WAXY基因的 5 對TALEN-L和TALEN-R組合中，WAXY-2A、WAXY-3、WAXY-4、 WAXY-7四對組合分別獲得轉(zhuǎn)基因抗性苗55、40、47、62株轉(zhuǎn)基因陽性水稻苗，使用祀位點兩 側(cè)引物測序檢測，均未發(fā)現(xiàn)祀位點發(fā)生突變。
[0237]WAXY-2B識別位點組合獲得了38株具有潮霉素抗性的水稻植株。經(jīng)過WAXY基因 革己位點檢測，發(fā)現(xiàn)在編號0S25和0S18植株（測序峰圖及序列見圖4)中的space區(qū)域出現(xiàn) Ibp和4bp堿基刪除。
[023引突變體檢測結(jié)果如圖4所示（方框內(nèi)表示spacer突變區(qū)域）。
[0239] 野生型目標區(qū)域正常序列如圖4A所示。WAXY-2B位點的TALEN-L和TALEN-R組合 在0S25植株在Spacer區(qū)顯示有1個堿基的敲除，如圖4B所示。WAXY-2B位點的TALEN-L 和TALEN-R組合在0S18植株的Spacer區(qū)顯示有4個堿基的敲除，如圖4C所示。圖4D顯 示了0S25和0S18與WT植株在祀位點的序列比對結(jié)果。
[0240]植株個體水平基因敲除效率為2/38 = 5. 2%，個體水平打祀效率很高。
[0241]利用在線軟件galaxy中的TALENoffer化ttp://galax;y2. informatik. uni-halle. de :8976/)程序預(yù)測了0S25植株的TALEN打祀位點的10個最有可能的潛在脫 祀位點（如下表所示）。經(jīng)過PCR擴增，測序比對，發(fā)現(xiàn)潛在的脫祀位點均未發(fā)生脫祀現(xiàn)象， 表明該位點的特異性很高。
[0242] TALENoffer在水稻基因組中預(yù)測10個得分最高的潛在脫祀位點及檢測引物如圖 5A和圖5B所示。
[0243] 上述實驗結(jié)果表明，識別WAXY-2B位點的一對TALEN組合具非常高的打祀特異性。 為進一步獲得WAXY基因純和突變體，并且不含外源T-DNA成分的的優(yōu)良水稻品系奠定了重 要的基礎(chǔ)。
[0244] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考郝樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W對本發(fā)明作各種改動或修改，送些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種分離的多肽1，其特征在于，所述的多肽1任選自下組： (1) 具有式la所示氨基酸序列的多肽、具有式lb所示氨基酸序列的多肽、或其組合； HDNINGNNNNNGNNNINGHDNGHDNGHDHDNG，式la; NNNNNGNINGHDHDHDNININNHDNNNGHDHDNGNG,式lb 各式中，NI、NG、HD、NN分別代表識別A、T、G、C堿基的TALEN短片段； (2) 與式la或式lb所示氨基酸序列的多肽同源性彡90%，較佳地彡95%，更佳地 彡98%，最佳地彡99%的多肽，且所述多肽特異性識別水稻W(wǎng)axy基因的核苷酸序列。2. -種分離的多核苷酸1，其特征在于，所述的多核苷酸1選自下組： (1) 編碼權(quán)利要求1所述多肽1的多核苷酸； (2) 由SEQIDNO. :5、6、7、8所示核苷酸序列拼接而成的編碼權(quán)利要求1所述多肽的多 核苷酸； (3) 與（2)中所示核苷酸序列的同源性彡90%，較佳地彡95%，更佳地彡98%，最佳地 > 99%的多核苷酸； (4) 與上述（1)-(3)互補的多核苷酸。3. -種分離的多肽2,其特征在于，所述的多肽2包括：權(quán)利要求1所述的多肽1，和位 于所述多肽1兩端的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端； 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子氨基酸序列框架的N端和C端為天然的或人工改 造的序列； 較佳地，所述的多肽2選自下組： ⑴具有SEQIDN0:9或SEQIDN0:10所示氨基酸序列的多肽；或 (2)與SEQIDN0:9或SEQIDNO: 10所示氨基酸序列的多肽同源性彡90%，較佳地 彡95%，更佳地彡98%，最佳地彡99%的多肽。4. 一種分離的多核苷酸2,其特征在于，所述的多核苷酸2選自下組： (1) 編碼權(quán)利要求3所述多肽2的多核苷酸； (2) 具有SEQIDNO: 11或SEQIDNO: 12所示核苷酸序列的多核苷酸； (3) 與SEQIDN0:11或SEQIDN0:12所示核苷酸序列的同源性彡90%，較佳地 彡95 %，更佳地> 98 %，最佳地> 99 %的多核苷酸； (4) 與上述（1)-(3)互補的多核苷酸。5. -種位點特異性的核酸酶，其特征在于，所述的核酸酶包括： (i) 識別元件，所述識別元件選自下組：權(quán)利要求1所述的多肽1，或權(quán)利要求3所述的 多肽2,以及 (ii) 與上述識別元件（i)可操作性相連的DNA切割元件； 優(yōu)選地，所述的核酸酶選自下組： (1) 具有SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 14所示氨基酸序列的多肽；或 (2) 與SEQIDNO: 13或SEQIDNO: 14所示氨基酸序列的多肽同源性彡90%，較佳地 彡95%，更佳地彡98%，最佳地彡99%的多肽。6. 如權(quán)利要求5所述的核酸酶，其特征在于，所述核酸酶包括第一核酸酶和第二核酸 酶，其中第一核酸酶的識別元件為式Ia，而第一核酸酶的識別元件為式lb。7. -種分離的多核苷酸3,其特征在于，所述的多核苷酸3選自下組： (1) 編碼權(quán)利要求5所述核酸酶的多核苷酸； (2) 具有SEQIDNO: 17或SEQIDNO: 18所示核苷酸序列的多核苷酸； (3) 與SEQIDN0:17或SEQIDN0:18所示核苷酸序列的同源性彡90%，較佳地 彡95 %，更佳地> 98 %，最佳地> 99 %的多核苷酸； (4) 與上述（1)-(3)互補的多核苷酸。8. -種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸1，和/或權(quán)利要求4所 述的多核苷酸2,和/或權(quán)利要求7所述的多核苷酸3。9. 一種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞含有權(quán)利要求8所述的載體或基因組 中整合有權(quán)利要求2所述的多核苷酸1，和/或權(quán)利要求4所述的多核苷酸2,和/或權(quán)利 要求7所述的多核苷酸3。10. 權(quán)利要求1的多肽1，和/或權(quán)利要求3所述的多肽2,和/或權(quán)利要求5所述的核 酸酶，和/或權(quán)利要求2所述的多核苷酸1，和/或權(quán)利要求4的多核苷酸2,和/或權(quán)利要 求7所述的多核苷酸3的用途，其特征在于，用于制備試劑，所述試劑用于水稻W(wǎng)AXY基因的 定點突變。11. 一種產(chǎn)生權(quán)利要求5所述核酸酶的方法，其特征在于，包括步驟：在適合表達的條 件下，培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的宿主細胞，從而表達出權(quán)利要求5所述的核酸酶；和分離所述 核酸酶。12. -種制劑組合物，其特征在于，所述組合物含有：(a)活性成分，以及（b)載體，其 中，所述活性成分（a)選自： (i) 權(quán)利要求5所述的核酸酶；或 (ii) 用于表達所述核酸酶的多核苷酸或載體。 優(yōu)選地，所述載體為水。13. -種水稻W(wǎng)AXY基因打靶方法，其特征在于，包括步驟： (1) 將權(quán)利要求2所述的多核苷酸1，和/或權(quán)利要求4所述的多核苷酸2,和/或權(quán) 利要求7所述的多核苷酸3,和/或權(quán)利要求8所述的載體導(dǎo)入水稻靶細胞，獲得轉(zhuǎn)化的細 胞；和 (2) 培養(yǎng)步驟（1)所述的轉(zhuǎn)化的細胞，獲得靶位點發(fā)生突變的水稻細胞，即打靶成功的 細胞。14. 一種水稻植物改良方法，其特征在于，包括步驟： (1) 將權(quán)利要求2所述的多核苷酸1，和/或權(quán)利要求4所述的多核苷酸2,和/或權(quán) 利要求7所述的多核苷酸3,和/或權(quán)利要求8所述的載體導(dǎo)入水稻靶細胞，獲得轉(zhuǎn)化的細 胞；和 (2) 培養(yǎng)步驟（1)所述的轉(zhuǎn)化的細胞，獲得Waxy基因的靶位點發(fā)生突變的水稻細胞； (3) 將上一步驟所述的WAXY基因的靶位點發(fā)生突變的水稻細胞再生成植株，從而獲得 性狀改良的水稻植株。15. -種分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子選自下組： (1) 序列如SEQIDNO. : 20所示的多核苷酸； (2) 序列如SEQIDNO. : 21所示的多核苷酸； (3) 序列如SEQIDNO. : 22所示的多核苷酸； (4)與（1)-(3)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。16.權(quán)利要求15所述核酸分子的用途，其特征在于，用于提供位點特異性的核酸酶識 別位點。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一對高效編輯水稻W(wǎng)AXY基因的TALEN其識別打靶位點及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種可以對水稻內(nèi)源的WAXY基因高效打靶的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)基因的，以及用含有該基因的重組質(zhì)粒進行定向打靶的方法。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶含有一對轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(TALEs)蛋白及分別與其融合的DNA內(nèi)切酶的催化亞基，具有分別識別并切割水稻內(nèi)源的WAXY基因上的兩個相鄰位點的功能。在對TALEs的氨基酸序列進行設(shè)計的基礎(chǔ)上，合成了編碼該TALEN的核苷酸序列及構(gòu)建了包含該核苷酸序列的載體，通過用TALENs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，可以大大地提高細胞打靶的效率。
【IPC分類】C12N15/11, C07K14/00, A01H5/00, C12N9/22, C12N15/55, C12N5/04
【公開號】CN105367628
【申請?zhí)枴緾N201410412179
【發(fā)明人】王磊, 許奇武, 原輝, 劉遠紅
【申請人】深圳華大基因科技有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年8月19日