[0048] 本發(fā)明的第十方面，提供了本發(fā)明第二方面所述的多核巧酸1，和/或本發(fā)明第四 方面所述的多核巧酸2,和/或本發(fā)明第走方面所述的多核巧酸3的用途，用于制備試劑，所 述試劑用于水稻W(wǎng)AXY基因的定點突變。
[0049] 本發(fā)明的第十一方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的多膚1，和/或本發(fā)明第Η方 面所述的多膚2,和/或本發(fā)明第五方面所述的核酸酶的用途，用于制備試劑，所述試劑用 于水稻W(wǎng)AXY基因的定點突變。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述的定點突變包括定點缺失。
[0051] 本發(fā)明的第十二方面，提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明第五方面所述的核酸酶的方法，包 括步驟；在適合表達的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第九方面所述的宿主細胞，從而表達出本發(fā)明第 五方面所述的核酸酶；和分離所述核酸酶。
[0052] 本發(fā)明的第十Η方面，提供了一種制劑組合物，所述組合物含有；(a)活性成分， W及化）載體，其中，所述活性成分（a)選自：
[0053] (i)本發(fā)明第五方面所述的核酸酶；或
[0054] (ii)用于表達所述核酸酶的多核巧酸或載體。
[00巧]優(yōu)選地，所述載體為水。
[0056] 本發(fā)明的第十四方面，提供了一種水稻W(wǎng)AXY基因打祀方法，包括步驟：
[0057] (1)將本發(fā)明第二方面所述的多核巧酸1，和/或本發(fā)明第四方面所述的多核巧酸 2,和/或本發(fā)明第走方面所述的多核巧酸3,和/或本發(fā)明第八方面所述的載體導(dǎo)入水稻祀 細胞，獲得轉(zhuǎn)化的細胞；和
[0058] (2)培養(yǎng)步驟（1)所述的轉(zhuǎn)化的細胞，獲得祀位點發(fā)生突變的水稻細胞，即打革己成 功的細胞。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述水稻W(wǎng)AXY基因打祀的目標序列如SEQIDNO. 或SEQID NO. : 23 所示。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，所述祀位點發(fā)生突變是指在SEQIDNO. : 23中的第9-12位核巧 酸中的一個或多個缺失。
[0061] 優(yōu)選地，在SEQIDNO. : 23中的第9位核巧酸缺失或者第9-12位核巧酸全部缺失。
[0062] 本發(fā)明的第十五方面，提供了一種水稻植物改良方法，包括步驟：
[0063] (1)將本發(fā)明第二方面所述的多核巧酸1，和/或本發(fā)明第四方面所述的多核巧酸 2,和/或本發(fā)明第走方面所述的多核巧酸3,和/或本發(fā)明第八方面所述的載體導(dǎo)入水稻祀 細胞，獲得轉(zhuǎn)化的細胞；和
[0064] 似培養(yǎng)步驟（1)所述的轉(zhuǎn)化的細胞，獲得Waxy基因的祀位點發(fā)生突變的水稻細 胞；
[0065] (3)將上一步驟所述的WAXY基因的祀位點發(fā)生突變的水稻細胞再生成植株，從而 獲得性狀改良的水稻植株。
[0066] 在另一優(yōu)選例中，所述的性狀改良包括提高的稻米的懦性。
[0067] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：
[0068] (4)對上一步驟的再生植株進行選育和傳代，從而選出去除步驟（1)中所述外源 基因的水稻植株。
[0069] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（2)中，包括步驟；對轉(zhuǎn)化的細胞檢測其Waxy基因是否發(fā) 生堿基缺失，并將發(fā)生堿基缺失的細胞作為Waxy基因的祀位點發(fā)生突變的水稻細胞。
[0070] 本發(fā)明的第十六方面，提供了一種分離的核酸分子，所述核酸分子選自下組：
[0071] (1)序列如SEQIDNO. : 20所示的多核巧酸；
[0072] (2)序列如SEQIDNO. : 21所示的多核巧酸；
[007引 （3)序列如SEQIDNO. : 22所示的多核巧酸；
[0074] (4)與（1)-(3)任一所述的多核巧酸互補的多核巧酸。
[0075] 本發(fā)明的第十走方面，提供了本發(fā)明第十六方面所述的核酸分子的用途，用于提 供位點特異性的核酸酶識別位點。
[0076] 在另一優(yōu)選例中，所述核酸酶為本發(fā)明第五方面所述的所述的核酸酶。
[0077] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可w互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0078] 圖1顯示了PTAL3載體圖譜信息。
[0079] 圖2顯示了植物表達載體PCMBIA1301的圖譜信息。
[0080] 圖3顯示了TALE化在載體上的位置信息。
[0081] 圖4顯示了測序峰圖及比對結(jié)果，其中圖4A顯示了野生型（WT)的測序峰圖，圖4B 顯示了 0S25植株的測序峰圖，圖4C顯示了 0S18植株的測序峰圖，圖4D顯示了野生型、 0S25和0S18植株的序列比對結(jié)果。
[0082] 圖5A顯示了TALENoffer在水稻基因組中預(yù)測10個得分最高的潛在脫祀位點及 檢測引物，圖5B續(xù)圖5A。
【具體實施方式】
[0083] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次提供了一種可W對水稻內(nèi)源的WAXY基因 高效打祀的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN)基因的人工合成方法，W及用含有該基 因的重組質(zhì)粒進行定向打祀的方法。
[0084] 本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶含有一對轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子 (TALES)蛋白及分別與其融合的DNA內(nèi)切酶的催化亞基，具有分別識別并切割水稻內(nèi)源的 WAXY基因上的兩個相鄰位點的功能。在對TALES的氨基酸序列進行設(shè)計的基礎(chǔ)上，合成了 編碼該TALEN的核巧酸序列及構(gòu)建了包含該核巧酸序列的載體，通過用TALE化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細 胞，可W大大地提高細胞打祀的效率。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0085] 術(shù)語
[0086] 如本文所用，術(shù)語"核酸酶"和"核酸內(nèi)切酶"可W互換使用，都是指一種人工改造 的核酸內(nèi)切酶。所述核酸內(nèi)切酶為單體形式或二聚體形式，其中所述二聚體由二個核酸內(nèi) 切酶單體所構(gòu)成。
[0087] 較佳地，所述的、核酸內(nèi)切酶包括單體1和單體2,每個單體都具有識別元件和切 割元件。其中，DNA識別元件賦予核酸酶的特異性，使核酸酶在DNA特定位點結(jié)合，而非特 異性核酸內(nèi)切酶元件（切割元件）具有剪切功能，使得核酸酶可在DNA特定位點進行定點 斷裂。
[0088]當識別結(jié)構(gòu)識別并結(jié)合到其特異的祀標位點時，兩個融合核酸酶結(jié)構(gòu)域相互靠 近，當兩個互補的核酸酶分子間相距適當?shù)木嚯x時化~8bp)，對雙鏈進行切割，形成雙鏈 斷裂缺口（doublestrandbreak，DSB)。當細胞內(nèi)源的非同源末端連接或者通過DNA同源 重組對送一損傷進行修復(fù)時，目的基因的有效敲除就可W實現(xiàn)。
[0089] 本發(fā)明提供了一種特異性的介導(dǎo)WAXY祀向敲除的核酸酶單體和二聚體，所 述的核酸內(nèi)切酶單體能夠?qū)Ｒ恍宰R別沈QIDNO: 20 (CATGGTGATCTCTCCT)，和沈QID NO: 21 (GGTATCCCAAGCGTCCTT)，或其反向互補序列。
[0090] 本發(fā)明提供了一種分離的多膚1，所述的多膚1具有選自下組的功能：
[0091] 特異性地識別序列如SEQIDN0:20所述的多核巧酸；特異性地識別序列如SEQID NO:20所述的多核巧酸經(jīng)一個或多個核巧酸取代所衍生的多核巧酸；特異性地識別序列如SEQIDNO:21所述的多核巧酸；特異性地識別序列如SEQIDNO:21所述的多核巧酸經(jīng)一 個或多個核巧酸取代所衍生的多核巧酸。
[0092] 在本方面的一個優(yōu)選例中，所述的多膚1任選自下組；具有式la或式Ib所示氨基 酸序列的多膚；或與式la或式Ib所示氨基酸序列的多膚同源性> 90 %，較佳地> 95 %，更 佳地> 98%，最佳地> 99%的多膚。
[0093] WAXY-2B
[0094] TALEN-L(RVD)
[0095] 皿NING順順NG順NING皿NG皿NG皿皿NG,式la;
[0096] 順順NGNING皿皿皿NINI順皿順NG皿皿NGNG,式扣
[0097] 式中，NI、NG、皿、順分別代表多膚片段，NI的氨基酸序列如SEQIDNO. : 1所示； NG的氨基酸序列如SEQIDNO. : 2所示；皿的氨基酸序列如SEQIDNO. : 3所示；順的氨基 酸序列如沈QIDNO. : 4所示。
[0098] LTPDQVVAIASNIGGKQALETVQ化LP化CQD服（SEQIDNO. :1);
[0099] LTPDQVVAIASNGGGKQALETVQ化LP化CQD服（SEQIDNO. :2);
[0100] LTPDQVVAIAS皿GGKQALETVQ化LP化CQD服（SEQIDNO. :3);
[010" LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQ化LP化CQD服（SEQIDNO. : 4)。
[0102] 在本發(fā)明的另一實施方式中，式la或式Ib中，NI的編碼多核巧酸序列如SEQID NO. : 5所示；NG的編碼多核巧酸序列如SEQIDNO. : 6所示；皿的編碼多核巧酸序列如SEQ IDNO. : 7所示；順的編碼多核巧酸序列如SEQIDNO. :8所示。
[0107] 優(yōu)選地，所述的多膚1具有選自下組的功能：
[0108] (1)特異性地識別序列如SEQIDNO: 20所述的多核巧酸，或如SEQIDNO: 20所述 的多核巧酸經(jīng)一個或多個（較佳地2個）核巧酸取代所衍生的多核巧酸；
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