rook等人，分子克?。粚?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（NewYork:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。
[0163] 材料和方法
[0164] 1、水稻（Oryza sativaL.)WAXY基因序列，〉0s06t0133000-01 class =序列位置 =。虹06:1765622..1770574 (+strand)，如沈Q ID NO. : 19所不。
[0165] 2、四種商業(yè)來(lái)源模塊的編碼序列。
[0166]
[0167]3、pTAL3載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[016引 4、經(jīng)過(guò)改造的植物表達(dá)載體PCMBIA1301結(jié)構(gòu)如圖2所示。
[0169] 5、培養(yǎng)基配制方法。
[0170] MB誘導(dǎo)培養(yǎng)基：
[0171]
[0172]
[017引調(diào)PH值至5. 8
[0174] NB繼代培養(yǎng)基：
[0175]
[0176]調(diào)PH值至 5. 8
[0177] NB-As共培養(yǎng)培養(yǎng)基：
[017 引
[0179]調(diào)PH值至5. 2
[0180] NB-S選擇培養(yǎng)基：
[0181]
[018引調(diào)PH值至5.8
[0183] MS-R分化培養(yǎng)基：
[0184]
[018引調(diào)PH值至5.8
[0186] 1/2MS生根培養(yǎng)基
[0187]
[018引調(diào)PH值至5.8
[0189] AAM培養(yǎng)基
[0190]
[0191]
[0192] (1) IN氨氧化鐘調(diào)節(jié)pH值到5. 2,按常規(guī)方法滅菌，12rC下滅菌20分鐘。
[0193] 似4411113^〇(1〇訝：2.5旨走水硫酸鎮(zhèn)曲拆04.7肥0)，1.5旨二水氯化巧 (CaC12 · 2肥0)，1. 33g二水磯酸二氨鋼（Na肥P04.肥0)，蒸傭水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0194] (3)4411111沈〇(100訝：0.7旨單水硫酸儘曲記04.肥0)，0.2旨走水硫酸鋒 狂nS04 ·7肥0)，0. 075g賄化鐘化1)，0.地測(cè)酸化3B03)，25mg二水鋼酸鋼（化2M〇04. 2肥0)， 2. 5mg五水硫酸銅（化S04.甜20) ,2. 5mg六水氯化鉆（CoC12. 6肥0)，蒸傭水定容至1L，4°C保 存?zhèn)溆谩?br>[0195] (4)甘氨酸Glycine(1000訝；〇. 75g甘氨酸蒸傭水溶解定容至100ml，4°C保存不長(zhǎng) 于1個(gè)月。
[0196]YM液體培養(yǎng)基巧Omg/LKan, 15mg/L化f):
[0197]
[019引 YM固體培養(yǎng)基巧Omg/LKan, 15mg/L化f):
[0199]
[0200] 本發(fā)明實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特殊說(shuō)明均可從市售渠道獲得。
[0201] 實(shí)施例1TALE化祀序列設(shè)計(jì)
[020引 1、從NCBI上下載水稻（亞洲栽培稻）WAXY基因，設(shè)計(jì)了 5對(duì)TALE化組合，WAXY基因序列附件1所示。
[0203] 2、TALE化識(shí)別位點(diǎn)按照W下的一般原則進(jìn)行設(shè)計(jì)：
[0204] (1)第0位堿基為T(mén)，即識(shí)別序列第一位之前的堿基是第0位，為T(mén);
[020引 似兩個(gè)識(shí)別序列之間的間隔序列（Spacer)長(zhǎng)度在15-30之間；
[0206] (3)識(shí)別序列長(zhǎng)度在15-24之間。
[0207] 3、設(shè)計(jì)的TALE化祀序列識(shí)別位點(diǎn)及間隔區(qū)域如下。下劃線為T(mén)ALEN識(shí)別結(jié)合區(qū)， 中間為間隔區(qū)域。
[020引
[0209] 實(shí)施例2TALE化構(gòu)建
[0210] 依照經(jīng)典GoldenGate方法（Cermak,Τ.etal.Efficientdesi即andassemblyof customTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting.Nucleic AcidsResearch，2011，卷.39，No.l2e82doi:10.1093/nar/gkr218)進(jìn)行TALE組裝，NI、 NG、皿、順?biāo)姆N模塊分別識(shí)別A、T、C、G四個(gè)堿基。將組合的模塊構(gòu)建于背景質(zhì)粒pTAL3載 體（購(gòu)自美國(guó)addgene公司）上，測(cè)序驗(yàn)證序列無(wú)誤。PTAL3載體如圖1所示。
[0211] 實(shí)施例3TALE化表達(dá)載體構(gòu)建
[0212] 將測(cè)序正確的PTAL3載體中的TALE化編碼區(qū)使用化nl和SpeI、BglII和Bs巧II 分別連在經(jīng)過(guò)改造的植物表達(dá)載體PCMBIA1301 (PCMBIA1301購(gòu)自中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞 株基因保藏中必，PCMBIA1301改造如下：將ubi+MCS+nos表達(dá)框（序列沈QIDNO. :30)使 用Hindlll和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶加入到PCMBIA1301載體中）上。最終該表達(dá)載體中包 含一個(gè)篩選基因一潮霉素基因，并將一對(duì)TALE化置于CaMV35S(花挪菜花葉病毒）啟動(dòng)子 和化i(玉米泛素1)啟動(dòng)子下，如圖3所示。植物表達(dá)載體質(zhì)粒信息見(jiàn)圖2。
[021引ubi+MCS+nos表達(dá)框序列如沈QIDNO. : 30所示。
[0214] 實(shí)施例4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
[0215] 1、液氮凍融法將TALE化植物載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至EHA105農(nóng)桿菌（北京天恩澤基因科 技有限公司公司）中。
[0216] 2、挑取單克隆菌落，使用潮霉素基因的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物及體系如下：
[0217]

[0218]PCR25ul體系
[0219]
[0220] PCR反應(yīng)條件：
[0221]
[0222] 經(jīng)電泳檢測(cè)，條帶位置與預(yù)期一致。
[0223] 實(shí)施例5愈傷組織誘導(dǎo)及侵染（培養(yǎng)基配制見(jiàn)材料和方法部分）
[0224] 1、水稻種子預(yù)處理。
[0225] 水稻種子去殼，75 %己醇表面消毒2min，滅菌水清洗3次，然后用次氯酸鋼原液 (加1滴吐溫）消毒30min，期間劇烈搖動(dòng)，消毒后用滅菌水清洗8次W上；將種子放置在墊 濾紙的已滅菌的培養(yǎng)皿中將種子表面的水份吸干，轉(zhuǎn)一次干凈的墊濾紙的滅菌培養(yǎng)皿，將 皿蓋打開(kāi)，將種子吹干。
[0226] 2、愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)。
[0227] 將消毒后的種子置于MB誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，用封口膜封口，如遇污染，及時(shí)將未污染 材料轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基上；26Γ暗培養(yǎng)3周，將長(zhǎng)出的靠近盾片部分的愈傷切下轉(zhuǎn)移到新的 ΝΒ培養(yǎng)基上，如遇污染，及時(shí)將未污染材料轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基上；愈傷組織繼續(xù)暗培養(yǎng)2周后 將狀態(tài)較好的愈傷（即顏色呈淡黃、表面光滑結(jié)構(gòu)致密的愈傷）切成2~4mm小塊，接種到 新的NB培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，如果污染，及時(shí)將未污染材料轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基上；挑取單克隆 菌落（中等大小的菌落較好）接種500μ1YM液體培養(yǎng)基（含Kan50mg/l，30mg/L)， 搖菌48小時(shí)，將此菌液4°C保存。
[022引 3、愈傷組織侵染。
[0229] 取保存于4°C的菌液300μ1于裝有30mlYM液體培養(yǎng)基于100ml錐形瓶中，振蕩 過(guò)夜；棄上清，將愈傷轉(zhuǎn)移至大皿中，瞭干；將菌液轉(zhuǎn)入滅菌50ml離必管中離必，棄上清，用 加入了AS的AAM懸浮至ODe。。為0. 6 ;將預(yù)培養(yǎng)5天的愈傷組織（誘導(dǎo)時(shí)間1~2個(gè)月，繼 代2-3次）浸泡到農(nóng)桿菌菌液（在錐形瓶中進(jìn)行）25分鐘左右，每隔3-5分鐘輕微晃動(dòng)錐 形瓶1分鐘W保證愈傷與農(nóng)桿菌懸浮液充分接觸，然后將愈傷組織置于滅菌濾紙上吸干多 余的液體，中途更換一次墊濾紙的平皿，打開(kāi)平皿蓋，吹干愈傷組織（1~化）；轉(zhuǎn)移至共培 養(yǎng)培養(yǎng)基上26Γ暗環(huán)境共培養(yǎng)3天，共培養(yǎng)基上鋪一層濾紙（只需一層即可）。
[0230] 實(shí)施例6愈傷組織篩選、分化、生苗（培養(yǎng)基配制見(jiàn)材料和方法部分）
[0231] 結(jié)束（Η天）后，先用無(wú)菌水清洗愈傷5次，每次2分鐘，需將離必管輕微上下顛 倒，然后用加入頭抱的無(wú)菌水清洗30分鐘，每隔3-5分鐘將離必管輕微上下顛倒1分鐘；將 愈傷組織置于滅菌濾紙上吸干多余的液體，中途更換一次墊濾紙的平皿，打開(kāi)平皿蓋，吹干 愈傷組織（1~化），然后將干燥過(guò)夜的愈傷組織轉(zhuǎn)移到NB-S篩選培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)篩選（在 轉(zhuǎn)移時(shí)可用藥匙輕壓愈傷W保證愈傷與培養(yǎng)基充分接觸）；2~3周后更換一次篩選培養(yǎng) 基，再暗培養(yǎng)2~3周，選擇狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS-R分化培養(yǎng)基上先28°C暗環(huán)境預(yù) 培養(yǎng)3至5天，然后28°C光照（1化/她）培養(yǎng)分化生苗（在轉(zhuǎn)移時(shí)可用藥匙輕壓愈傷W保證 愈傷與培養(yǎng)基充分接觸）；生苗后轉(zhuǎn)移至1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至10cm左右，敞開(kāi)培養(yǎng)瓶培 養(yǎng)2~3天，移栽到±壤中生長(zhǎng)。
[0232] 實(shí)施例7TALE化祀位點(diǎn)敲除驗(yàn)證
[0233] 1、選取水稻轉(zhuǎn)基因植株第二片W上葉子，提取DNA，使用潮霉素基因的引物進(jìn)行 PCR檢測(cè)，鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性水稻幼苗植株，體系同上。選用化mit-m震熱啟動(dòng)II高保真DNA 聚合酶（Thermo)分別擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株DNAWAXY打祀位點(diǎn)序列，進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。
[0234] 2、將PCR產(chǎn)物分別與祀ASYT1載體（購(gòu)自北京全式金公司）連接，單克隆化DNA 片段，送sanger測(cè)序。步驟參照pEASY-Blunt