專利名稱：含npt－ii標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因水稻的快速檢測(cè)方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及快速檢測(cè)含NPT-II選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因水稻的一種方法，此種方法中使用了一種特殊的抗生素，其檢測(cè)臨界濃度能使轉(zhuǎn)基因水稻中的非轉(zhuǎn)化植株葉片黃化死亡而轉(zhuǎn)化植株因含有外源基因能抵抗抗生素的傷害而存活；或者使轉(zhuǎn)基因水稻種子和幼胚中的非轉(zhuǎn)化種子或幼胚芽白化死亡，而轉(zhuǎn)化種子或幼胚因含有外源基因能抵抗抗生素的傷害而正常生長(zhǎng)發(fā)育。公開(kāi)的檢測(cè)方法抗生素臨界濃度有益于水稻基因工程研究者和水稻育種工作者。
2.背景技術(shù)在水稻基因工程中，為了把轉(zhuǎn)化體篩選出來(lái)，最直接的方法是根據(jù)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或目的基因直接對(duì)個(gè)體進(jìn)行分子檢測(cè)，一般有PCR檢測(cè)或分子雜交。但分子檢測(cè)速度慢，耗資大，隨著轉(zhuǎn)基因水稻后代群體的擴(kuò)大，分子檢測(cè)方法受到了一定的限制，因此，探索一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻的方法是很有必要的。
在水稻遺傳轉(zhuǎn)化中，一般在表達(dá)載體中構(gòu)建一個(gè)以上的選擇標(biāo)記基因，通過(guò)相對(duì)應(yīng)的選擇試劑對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行篩選，未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)發(fā)育，而攜帶選擇標(biāo)記基因(攜帶轉(zhuǎn)化質(zhì)粒)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞因?qū)x擇試劑產(chǎn)生抗性而不受其影響，能正常生長(zhǎng)、發(fā)育和分化，從而把轉(zhuǎn)化體選擇出來(lái)。這樣得到的轉(zhuǎn)化植株既攜帶目的基因，同時(shí)也攜帶有選擇基因。
新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因一NPT-II基因是最早引入水稻研究的，也是在植物轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用最為廣泛的選擇標(biāo)記基因之一。它來(lái)源于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5上的aphA2。該基因編碼氨基糖苷-3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminnoglycoside-3′-phosphotransferase II)，又稱Npt-II(neomycinphosphotransferase II)，該酶通過(guò)酶促磷酸化使某些氨基糖苷類抗生素如卡那霉素、新霉素、G418等磷酸化而失活。此類抗生素對(duì)植物細(xì)胞表現(xiàn)毒性的機(jī)理是與植物細(xì)胞葉綠體和線粒體中的核糖體30S亞基結(jié)合，影響70S起始復(fù)合體生成，干擾葉綠體及線粒體的蛋白質(zhì)生物合成，最終導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。Npt-II使ATP分子上的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移到抗生素分子上，影響抗生素與核糖體亞基的結(jié)合，從而使抗生素失活。使用Npt-II基因轉(zhuǎn)化植物，可以使植物細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)上述抗生素的抗性。
由于不同作物對(duì)不同抗生素的敏感程度不一樣，且同一作物不同外植體對(duì)某一抗生素敏感程度不同，因此在基因工程中對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行檢測(cè)所采用的抗生素濃度也有差異。
3.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種快速檢測(cè)含NPT-II轉(zhuǎn)基因水稻的方法，通過(guò)G418溶液或含G418的培養(yǎng)基可實(shí)現(xiàn)該目的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻整個(gè)生育期的檢測(cè)。通過(guò)不同濃度的G418溶液或含G418的培養(yǎng)基可實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻后代的葉片、種子、幼苗和幼胚的快速檢測(cè)。
4.本發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供在轉(zhuǎn)基因水稻整個(gè)生育期各個(gè)階段的檢測(cè)，在對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行檢測(cè)前，首先應(yīng)該確定抗生素篩選的臨界濃度，其濃度一方面可以殺死轉(zhuǎn)基因水稻中的非轉(zhuǎn)化植株，另一方面又能保證轉(zhuǎn)基因水稻中轉(zhuǎn)化株的正常生長(zhǎng)。
用于實(shí)施本發(fā)明的抗生素是G418，其檢測(cè)試劑包括檢測(cè)葉片和種子的溶液和檢測(cè)幼胚和幼苗的培養(yǎng)基，檢測(cè)方法是以轉(zhuǎn)基因水稻和其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化受體為材料，對(duì)G418設(shè)定一系列的濃度梯度，確定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻的最佳臨界濃度。
根據(jù)本發(fā)明中通過(guò)檢測(cè)葉片來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻，將G418濃度設(shè)為0，40，60，80，100，150，200mg/l七個(gè)不同的處理濃度，每處理隨機(jī)分別取含NPT-II轉(zhuǎn)基因水稻材料(以下用R表示)和其轉(zhuǎn)化受體對(duì)照材料(以下用CK表示)大田生長(zhǎng)分蘗期同一部位綠色健康葉片3片，每片葉剪成2cm左右長(zhǎng)的葉段三段(兩端均留有剪刀口)放入裝有G418溶液的培養(yǎng)皿中，每皿中放的3個(gè)葉段均來(lái)源于為同一葉片。將葉片置于室內(nèi)室溫下(光強(qiáng)約為10000μmol.m-2·s-1，光照時(shí)間約為12h·d-1，溫度約為25℃)，定期觀察其變化情況。
水稻葉段用不同濃度的G418處理后，CK的葉段均出現(xiàn)不同程度的褐化、黃化，并且隨著G418濃度和處理時(shí)間的增加，葉段褐化或黃化程度加重。處理4天后，60mg/l以上G418處理的CK葉面全部變黃，80mg/l時(shí)整個(gè)葉面黃化；到200mg/l時(shí)，葉段已枯黃，而R在各個(gè)處理濃度葉面基本上沒(méi)有出現(xiàn)黃化。使用60mg/l以上濃度G418時(shí)，R與CK葉段耐G418的能力開(kāi)始出現(xiàn)明顯差異，故把70-90mg/l的G418作為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻葉片的最適濃度(處理結(jié)果見(jiàn)表1)。
根據(jù)本發(fā)明中通過(guò)檢測(cè)種子來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻，G418濃度分別設(shè)置0，150，200，250，300，350mg/l五個(gè)不同處理，每處理分別取R和CK各20粒種子，設(shè)3次重復(fù)，浸種培養(yǎng)至破胸時(shí)，分放在裝有不同濃度G418溶液的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底覆蓋有兩層濾紙。將種子置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)(光強(qiáng)約為10000μmol.m-2·s-1，光照時(shí)間約為12h·d-1，溫度約為29℃)，定期觀察其發(fā)芽情況，7天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和白化死亡率。
處理后的CK種子發(fā)芽率隨G418濃度的增加而降低，相應(yīng)芽的白化死亡率隨G418濃度的增加而升高；但R種子的發(fā)芽率和芽的白化死亡率在各個(gè)處理濃度基本不受G418的影響。在G418為0mg/l和100mg/l時(shí)，CK的發(fā)芽率和白化死亡率都沒(méi)有受到影響。到150mg/l以上時(shí)，其發(fā)芽率開(kāi)始出現(xiàn)下降，部分發(fā)出的芽開(kāi)始出現(xiàn)白化死亡。對(duì)于CK種子的白化死亡率，G418濃度在300mg/l以上各處理與300mg/l以下各處理呈顯著差異，濃度為350mg/l時(shí)，白化死亡率達(dá)到100％。故把280-320mg/l的G418作為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻種子的最適濃度(處理結(jié)果見(jiàn)表2)。
根據(jù)本發(fā)明中通過(guò)檢測(cè)幼胚來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻，以R和CK開(kāi)花授粉后12～15天的幼胚為材料，G418濃度分別設(shè)置0，100，150，200，250mg/l五個(gè)不同處理，每處理分別取轉(zhuǎn)基因水稻R和CK各20顆幼胚，重復(fù)3次。用0.1％升汞滅菌12分鐘后用無(wú)菌水沖洗3～5次，然后接種于1/2MS+0.5mg/l 6-BA+1.5％蔗糖培養(yǎng)基上，4天后，在無(wú)菌條件下將開(kāi)始萌發(fā)幼胚接種于加有G418的相同培養(yǎng)基上。將幼胚置于光照培養(yǎng)室內(nèi)(光強(qiáng)約為10000μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間約為12h·d-1，溫度約為25℃)，定期觀察其發(fā)芽情況，10天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和白化死亡率。
利用不同濃度的G418對(duì)水稻幼胚進(jìn)行敏感性檢測(cè)。結(jié)果表明R發(fā)芽率基本上不受G418濃度的影響，只是當(dāng)濃度達(dá)到300mg/l時(shí)，有個(gè)別幼胚出現(xiàn)白化死亡。而CK則隨著G418濃度的增加，幼胚發(fā)芽率漸漸下降，相應(yīng)的白化死亡率也逐步上升，到200mg/l以上時(shí)，白化死亡率達(dá)到了85％以上，且200mg/l以上各處理與200mg/l以下各處理呈顯著差異。因此本試驗(yàn)中取180-220mg/l的G418作為篩選轉(zhuǎn)基因水稻幼胚的臨界濃度(處理結(jié)果見(jiàn)表3)。
根據(jù)本發(fā)明中通過(guò)檢測(cè)幼苗來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻，G418濃度分別設(shè)置0，100，150，200，250mg/l五個(gè)不同處理，取R和CK成熟胚在1/2MS+0.5mg/l 6-BA+1.5％蔗糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)成幼苗(約4葉期)，每處理分別取R和CK各60棵幼苗，在無(wú)菌條件下將幼苗接種于加有G418的相同培養(yǎng)基上。將幼苗置于光照培養(yǎng)室內(nèi)(光強(qiáng)約為10000μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間約為12h·d-1，溫度約為25℃)，定期觀察其生長(zhǎng)變化情況。
在G418濃度分別為0和100mg/l時(shí)，培養(yǎng)不同天數(shù)CK幼苗生長(zhǎng)發(fā)育正常；G418濃度為150mg/l和200mg/l時(shí)，CK在4天后葉尖開(kāi)始卷曲，8天后葉片開(kāi)始變黃，12天后整株黃化；當(dāng)G418濃度為250mg/l時(shí)，到第12天幼苗整株枯死。而不同G418濃度處理的R在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中均沒(méi)有明顯變化。第12天，在G418濃度為150mg/1時(shí)，R和CK之間表現(xiàn)出明顯差異，因此把130-170mg/l的G418作為篩選轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的最適濃度(處理結(jié)果見(jiàn)表4)。5本發(fā)明的分子檢測(cè)驗(yàn)證根據(jù)以上發(fā)明方法，取G418篩選陽(yáng)性葉片對(duì)應(yīng)的植株60株(對(duì)R和CK各占60株的混合群體進(jìn)行葉片篩選)、G418篩選發(fā)芽種子后的存活苗65株(對(duì)R和CK種子各60粒混合后進(jìn)行篩選)、幼胚發(fā)芽篩選后的存活苗67株(對(duì)R和CK幼胚各60顆混合后進(jìn)行篩選)和幼苗篩選后的62株(對(duì)R和CK幼苗各60株混合后進(jìn)行篩選)分別提取DNA，根據(jù)NPT-II基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明大部分G418篩選陽(yáng)性株擴(kuò)增出了與NPT-II基因序列長(zhǎng)度完全一致DNA特征帶。
在驗(yàn)證葉片檢測(cè)方法中，通過(guò)對(duì)60株成株所提DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性株為60，跟80mg/l G418條件下的檢測(cè)結(jié)果完全一致。在驗(yàn)證種子篩選方法中，發(fā)現(xiàn)PCR呈陽(yáng)性的種子有60粒，占整個(gè)存活種子的92.31％，適合大批量種子的快速檢測(cè)。在驗(yàn)證幼胚篩選方法中，發(fā)現(xiàn)PCR呈陽(yáng)性的幼胚有60顆，占整個(gè)存活幼胚的89.55％，在驗(yàn)證幼苗篩選方法中，發(fā)現(xiàn)PCR呈陽(yáng)性株幼苗也有60株，占整個(gè)存活幼苗的96.77％，適合室內(nèi)組培苗的快速檢測(cè)(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5)。
本發(fā)明的優(yōu)越性操作簡(jiǎn)便、快速、費(fèi)用低、省時(shí)省力、準(zhǔn)確性高。
6.實(shí)施范例范例一該抗生素對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻葉片的篩選以R為父本，明恢63(MH63)、9311、培矮64s(PA64s)、288、E32為母本，雜交后獲得F1代，再以MH63、9311、PA64s、288和E32為輪回親本，與F1代回交獲得BC1F1代，應(yīng)用本研究建立的標(biāo)記基因葉片快速檢測(cè)技術(shù)，以70～90mg/l濃度的G418對(duì)BC1F1群體中個(gè)體的葉片進(jìn)行篩選，同時(shí)同一群體的各個(gè)個(gè)體提DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，效果非常明顯。到第4天，G418篩選的部分葉片保持正常綠色，而部分葉片黃化死亡。經(jīng)PCR檢測(cè)驗(yàn)證，G418篩選的正確率達(dá)99.32％，因此G418篩選后保持正常綠色的基本上為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6)。
范例二該抗生素對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻種子的篩選以轉(zhuǎn)基因水稻R為父本，明恢63(MH63)、9311、培矮64s(PA64s)、288、E32為母本，雜交后獲得F1代，再以MH63、9311、PA64s、288和E32為輪回親本，經(jīng)兩次回交獲得BC2F1代種子，應(yīng)用本研究建立的標(biāo)記基因種子快速檢測(cè)技術(shù)以280～320mg/l濃度的G418對(duì)BC2F1種子進(jìn)行篩選，同時(shí)取存活苗提DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，效果非常明顯。7天后，部分種子發(fā)出的芽能正常地分化出幼苗，而部分種子發(fā)出的芽白化死亡，經(jīng)PCR驗(yàn)證，G418篩選的正確率達(dá)94.68％。因此G418篩選后的存活苗基本上為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7)。
范例三該抗生素對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻幼胚的篩選將轉(zhuǎn)基因水稻R(父本)分別與明恢63(MH63)和9311(母本)雜交后獲得F1代，以MH63和9311為輪回親本再經(jīng)三次回交獲得BC3F1幼胚；將轉(zhuǎn)基因水稻R(父本)分別與E32、288(母本)雜交后獲得F1代，以E32、288為輪回親本再經(jīng)二次回交獲得BC2F1幼胚。應(yīng)用本研究建立的標(biāo)記基因幼胚快速檢測(cè)技術(shù)以180～220mg/l濃度的G418對(duì)BC3F1和BC2F1群體的幼胚進(jìn)行篩選，同時(shí)取存活苗提DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，效果非常明顯。10天后，部分幼胚發(fā)出的芽能正常地分化出幼苗，而部分幼胚發(fā)出的芽白化死亡。經(jīng)PCR驗(yàn)證，G418篩選的正確率達(dá)93.30％。因此G418篩選后的存活苗基本上為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8)。
范例四該抗生素對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的篩選將轉(zhuǎn)基因水稻R(父本)分別與明恢63(MH63)和9311(母本)雜交后獲得F1代，再經(jīng)三次回交獲得BC3F1種子；將轉(zhuǎn)基因水稻R(父本)分別與E32、288(母本)雜交后獲得F1代，再經(jīng)二次回交獲得BC2F1種子。應(yīng)用本研究建立的標(biāo)記基因幼苗快速檢測(cè)技術(shù)以130-170mg/l濃度的G418對(duì)BC3F1和BC2F1群體的幼苗進(jìn)行抗性鑒定，同時(shí)取存活苗提DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，效果非常明顯。12天后，部分幼苗能正常生長(zhǎng)，而部分幼苗黃化死亡。經(jīng)PCR驗(yàn)證，G418篩選的正確率達(dá)96.36％。因此G418篩選后的存活苗基本上為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表9)。
表1水稻葉片對(duì)G418敏感性的測(cè)定結(jié)果
注“-”無(wú)變化；“+”切口處褐化；“++”葉面淺黃；“+++”整個(gè)葉面黃化；“++++”葉段枯死表2水稻種子對(duì)G418敏感性的測(cè)定結(jié)果
同一性狀不同處理下有相同字母表示無(wú)顯著性差異，字母完全不同表示有顯著性差異(P＜0.01)。
表3水稻幼胚對(duì)G418敏感性的測(cè)定結(jié)果
同一性狀不同處理下有相同字母表示無(wú)顯著性差異，字母完全不同表示有顯著性差異(P＜0.01)表4水稻幼苗對(duì)G418敏感性的測(cè)定結(jié)果
注“-”無(wú)變化；“+”葉尖開(kāi)始卷曲；“++”葉面開(kāi)始變黃；“+++”整株黃化；“++++”整株枯死表5 R和CK的PCR檢測(cè)結(jié)果
表6 G418和PCR檢測(cè)BC1F1葉片結(jié)果
表7 G418和PCR檢測(cè)BC2F1種子結(jié)果
表8 G418和PCR檢測(cè)BC2F1和BC3F1幼胚結(jié)果
表9 G418和PCR檢測(cè)BC2F1和BC3F1幼苗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)含NPT-II標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因水稻的方法，此方法是使用一種抗生素，這種抗生素可以提供在轉(zhuǎn)基因水稻整個(gè)生育期各個(gè)階段的檢測(cè)，其特征在于在對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行檢測(cè)前，首先應(yīng)該確定該抗生素檢測(cè)的臨界濃度，其濃度一方面可以殺死轉(zhuǎn)基因水稻中的非轉(zhuǎn)化植株，另一方面又能保證轉(zhuǎn)基因水稻中轉(zhuǎn)化株的正常生長(zhǎng)。此種方法包括對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻葉片、種子、幼胚和幼苗的檢測(cè)。
2.權(quán)利要求1所述的方法中包括一種抗生素G418的溶液或培養(yǎng)基。
3.權(quán)利要求2所述的溶液中只含有抗生素G418。
4.權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
5.權(quán)利要求4中的MS培養(yǎng)基含有抗生素G418、0.5mg/l 6-BA和1.5％蔗糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻葉片，其特征在于葉片為成株離體葉片，檢測(cè)試劑是臨界濃度為70-90mg/l的G418溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻種子，其特征在于種子為剛破胸的活種子，檢測(cè)試劑是臨界濃度為280-320mg/l的G418溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻幼胚，其特征在于幼胚為剛萌發(fā)的無(wú)菌幼胚，檢測(cè)培養(yǎng)基中含有臨界濃度為180-220mg/l的G418。
9.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻幼苗，其特征在于幼苗為三葉或三葉以上的無(wú)菌苗，檢測(cè)培養(yǎng)基中含有臨界濃度為130-170mg/l的G418。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)含NPT－II標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因水稻的方法，此方法能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻在整個(gè)生育期各個(gè)階段的快速檢測(cè)，此方法包括一種抗生素溶液或含這種抗生素的培養(yǎng)基，此抗生素為G418。水稻不同外植體對(duì)G418的敏感性不同，因此檢測(cè)的濃度有差異。本發(fā)明確定了通過(guò)G418溶液或含G418的培養(yǎng)基檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻的臨界濃度，其濃度一方面可以殺死轉(zhuǎn)基因水稻中的非轉(zhuǎn)化植株，另一方面又能保證轉(zhuǎn)基因水稻中轉(zhuǎn)化株的正常生長(zhǎng)。本發(fā)明的優(yōu)越性在于操作簡(jiǎn)便、快速、費(fèi)用低、省時(shí)省力、準(zhǔn)確性高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1706965SQ20041002329
公開(kāi)日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2004年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月10日
發(fā)明者易自力, 王紫萱, 蔣建雄, 覃靜萍, 張昊, 譚炎寧 申請(qǐng)人:易自力, 王紫萱, 蔣建雄