專利名稱：轉(zhuǎn)基因水稻事件17314及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因水稻事件17314。包含該事件的植物顯示對(duì)于草甘膦除草劑的耐受性。本發(fā)明還涉及核酸分子、植物、植物部分、植物種子、植物細(xì)胞、農(nóng)產(chǎn)品及涉及事件 17314的方法。本發(fā)明提供該事件獨(dú)特的核苷酸分子，且所述核苷酸分子是通過(guò)轉(zhuǎn)基因DNA 插入水稻基因組中而產(chǎn)生的。
背景技術(shù)：
水稻是世界許多地區(qū)的一種重要的作物。生物技術(shù)方法已應(yīng)用于水稻，以生產(chǎn)具有改良性狀的水稻。一種這樣的改良的性狀是除草劑耐受性。除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)可用于生產(chǎn)具有理想的除草劑耐受性的性狀的植物。轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)可能會(huì)受轉(zhuǎn)基因的染色體位置影響，可能是由于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(如異染色質(zhì))或靠近整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如增強(qiáng)子)的接近性。基于這個(gè)原因，通常需要篩選大量的單個(gè)植物轉(zhuǎn)化事件，以判斷具有轉(zhuǎn)基因的最佳表達(dá)的事件，進(jìn)而判斷特定的需要的特征。例如，在植物中已觀察到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平在事件之間差異很大。在表達(dá)的空間或時(shí)間模式上也有差異，例如，在不同植物組織中的相對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的差異，這可能不符合從引入的基因構(gòu)建體中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件預(yù)期的模式?；谶@個(gè)原因，可能必須產(chǎn)生數(shù)百至數(shù)千個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因事件，并對(duì)這些事件進(jìn)行篩選，以選擇具有所需轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和用于商業(yè)目的的模式的事件。這種具有理想的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平或模式的事件然后可以用于使用植物育種方法通過(guò)有性雜交將轉(zhuǎn)基因滲入其他遺傳背景中。這種雜交的后代具有原轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。這可以用來(lái)確保適當(dāng)?shù)剡m應(yīng)當(dāng)?shù)靥囟ㄉL(zhǎng)條件的許多不同品種中的可靠的基因表達(dá)。發(fā)明概述本發(fā)明提供包含事件17314的轉(zhuǎn)基因水稻，其顯示商業(yè)上可接受的對(duì)于草甘膦除草劑的應(yīng)用的耐受性，其代表性種子以保藏號(hào)PTA-9844保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (ATCC)。本發(fā)明還提供包含事件17314的水稻的種子、后代、植物部分、細(xì)胞和商品。本發(fā)明還提供與包含事件17314的水稻的基因組相關(guān)的新的DNA分子及使用這些分子的方法。 本發(fā)明還提供使用轉(zhuǎn)基因水稻事件17314和包含該事件的植物的方法及生產(chǎn)耐受草甘膦的水稻的方法。
本發(fā)明提供與水稻事件17314相關(guān)的DNA分子。這些DNA分子可以包含代表或衍生自以下的核苷酸序列水稻事件17314的轉(zhuǎn)基因插入與側(cè)翼基因組DNA之間的連接點(diǎn)，和 /或位于插入DNA側(cè)翼的基因組DNA的區(qū)域，和/或位于插入位點(diǎn)側(cè)翼的整合轉(zhuǎn)基因DNA的區(qū)域，和/或整合轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的區(qū)域，和/或任何這些區(qū)域的連續(xù)序列。本發(fā)明還提供用作判斷水稻事件17314的引物和探針的DNA分子。本發(fā)明還公開包含這些分子的水稻、植物細(xì)胞、植物部分、商品、后代和種子。本發(fā)明提供用于檢測(cè)由水稻事件17314衍生的DNA的存在的方法、組合物和試劑盒。本發(fā)明提供一種檢測(cè)事件17314的方法，該方法包括將包含DNA的樣品與引物組接觸， 所述引物組在用于來(lái)自水稻事件17314的基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生能夠判斷水稻事件17314的擴(kuò)增的DNA，進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增的DNA，并檢測(cè)擴(kuò)增的DNA。 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)事件17314的方法，該方法包括將包含DNA的樣品與探針接觸，所述探針在用于來(lái)自水稻事件17314的基因組DNA的雜交反應(yīng)時(shí)，與水稻事件17314特異性的 DNA分子雜交，進(jìn)行雜交反應(yīng)，并檢測(cè)探針與DNA分子的雜交。本發(fā)明還提供包括本發(fā)明的方法和組合物的試劑盒，用于檢測(cè)衍生自水稻事件17314的DNA的存在。本發(fā)明提供包含事件17314的水稻、種子、植物細(xì)胞、后代植物、植物部分或衍生自水稻的植物、植物細(xì)胞或種子的商品。本發(fā)明還提供包含具有選自SEQ ID NO :1-6及其互補(bǔ)序列和片段的核苷酸序列的DNA分子或包含與SEQ ID NO :6至少90%序列一致的DNA 分子的水稻、種子、植物細(xì)胞、后代植物、植物部分或商品。本發(fā)明還提供包含事件17314并且包含一種DNA分子的水稻、種子、植物細(xì)胞、后代植物、植物部分或衍生自該植物或種子的商品，所述DNA分子例如在DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生包含SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2 的擴(kuò)增的DNA分子。本發(fā)明提供用于在田地中控制雜草的方法，該方法是通過(guò)種植包含事件17314的水稻，然后應(yīng)用有效劑量的能夠控制雜草而不損害包含事件17314的植物的草甘膦除草劑。本發(fā)明提供生產(chǎn)耐受草甘膦除草劑的應(yīng)用的水稻和/或種子的方法，該方法是通過(guò)有性雜交包含事件17314或包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的水稻與第二水稻，從而產(chǎn)生種子，種植種子以產(chǎn)生后代植物，用草甘膦處理后代植物，并選擇耐受草甘膦的后代植物。該方法也可以包括使選定的后代植物自交以產(chǎn)生多個(gè)第二代后代植物，并從其中選擇耐受草甘膦的植物。該方法還可以包括有性雜交選定的后代植物與另一種水稻以產(chǎn)生種子，種植種子以產(chǎn)生第二代后代植物，用草甘膦處理第二代后代植物，并選擇耐受草甘膦的第二代后代植物。本發(fā)明提供生產(chǎn)耐受草甘膦除草劑的應(yīng)用的水稻和/或種子的方法，該方法是通過(guò)自交包含事件17314和包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的耐受草甘膦的植物， 從而產(chǎn)生種子，種植種子以產(chǎn)生后代植物，用草甘膦處理后代植物，并選擇耐受草甘膦的后代植物。通過(guò)下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的上述和其他方面將變得更加明顯。


圖1為水稻事件17314的圖解表示[A]對(duì)應(yīng)于5，連接區(qū)(提供為SEQ ID NO 1) 的相對(duì)位置，這是水稻基因組和插入的轉(zhuǎn)基因DNA的5’部分之間的連接區(qū)域；[B]對(duì)應(yīng)于3，連接區(qū)(提供為SEQ ID NO 2)的相對(duì)位置，這是水稻基因組和插入的轉(zhuǎn)基因DNA的3， 部分之間的連接區(qū)域；[C]對(duì)應(yīng)于插入的轉(zhuǎn)基因DNA的5’側(cè)翼區(qū)域和5’末端一部分(提供為SEQ ID NO 3)的相對(duì)位置，這包括位于事件17314的整合表達(dá)盒側(cè)翼的5’水稻基因組序列和轉(zhuǎn)基因DNA的5’端的區(qū)域；[D]對(duì)應(yīng)于插入的轉(zhuǎn)基因DNA的3’側(cè)翼區(qū)域和3’末端一部分(提供為SEQ ID NO 4)的相對(duì)位置，這包括位于事件17314的整合表達(dá)盒側(cè)翼的 3’水稻基因組序列和轉(zhuǎn)基因DNA的3’端的區(qū)域；[E]代表插入到事件17314的基因組中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒(提供為SEQ ID NO 5) ； [F]代表包含如圖中從左至右示出的SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 4的側(cè)翼序列和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒(提供為SEQ ID NO 6)的連續(xù)序列，其中，如上所示，包含有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，因?yàn)檫@些序列代表事件17314 的連接序列。序列簡(jiǎn)要說(shuō)明SEQ ID NO 代表水稻基因組DNA與整合的表達(dá)盒之間的5，連接序列的20個(gè)核苷酸的序列。該核苷酸序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :3([C]，見圖1)的283至302位和SEQ ID NO 6 的 283 至 302 位。SEQ ID NO :2_代表整合的表達(dá)盒與水稻基因組DNA之間的3，連接序列的20個(gè)核苷酸的序列。該核苷酸序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:4([D]，見圖1)的666至685位，SEQ ID NO 2的反向互補(bǔ)序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 6的3397至；3416位。SEQ ID NO :3_位于事件17314的插入DNA側(cè)翼的5，序列直至并包括轉(zhuǎn)基因DNA 的區(qū)域。SEQ ID NO 3的核苷酸283至302位對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的核苷酸1至20位，SEQ ID NO 3的核苷酸293至302位對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 5的核苷酸1至10位。SEQ ID NO :4_位于事件17314的插入DNA側(cè)翼的3，序列直至并包括轉(zhuǎn)基因DNA 插入的區(qū)域。SEQ ID NO :4的核苷酸666至685位對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2的核苷酸1至20 位，SEQ ID NO 4的核苷酸666至685位的反向互補(bǔ)鏈對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 5的核苷酸3105 至3114位。SEQ ID NO :5-賦予草甘膦除草劑耐受性的整合的表達(dá)盒的序列。SEQ ID N0:5對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 6的核苷酸293至3046位。SEQ ID NO :6_代表位于事件17314的插入DNA側(cè)翼的5，序列(SEQ ID NO 3)、整合的表達(dá)盒的序列(SEQ ID NO 5)和位于事件17314的插入DNA側(cè)翼的3，序列(SEQ ID NO :4的反向互補(bǔ)序列)的疊連群的核苷酸序列。SEQ ID NO :7_引物SQ4183，用來(lái)識(shí)別事件17314。引物SQ4183與位于插入表達(dá)盒的5’區(qū)域側(cè)翼的基因組區(qū)域互補(bǔ)，接近右側(cè)轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界。使用引物SQ4183和 SQ4191(SEQ ID NO 8)的組合產(chǎn)生的擴(kuò)增子表明17314事件的存在。SEQ ID NO :8_引物SQ4191，用來(lái)識(shí)別事件17314。引物SQ4191與插入表達(dá)盒的 5，區(qū)域互補(bǔ)，接近轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界。使用引物SQ4183(SEQ ID NO :7)和SQ4191的組合產(chǎn)生的擴(kuò)增子表明17314事件的存在。SEQ ID NO :9_PB1491探針，用來(lái)識(shí)別事件17314，且與5，連接序列的片段互補(bǔ)。 該探針可以連接可檢測(cè)的標(biāo)簽，如6FAMTM。使用引物(如SQ4183和SQ4191)在TAQMAN (ΡΕ Applied Biosystems, Foster City, CA)檢測(cè)中釋放熒光信號(hào)，與探針(如 6FAMTM 標(biāo)記的探針PB1491)組合，用于判斷事件17314的存在。
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SEQ ID NO 10-引物SQ1875，用來(lái)識(shí)別事件17314。引物SQ1875與插入表達(dá)盒的 3，區(qū)域互補(bǔ)，接近轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界。使用引物SQ1875和SQ36^(SEQ ID NO :11)的組合產(chǎn)生的擴(kuò)增子表明17314事件的存在。SEQ ID NO :11_引物SQ3628，用來(lái)識(shí)別事件17314。引物SQ36^與位于插入表達(dá)盒的3’末端側(cè)翼的基因組區(qū)域互補(bǔ)，接近轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界。使用引物SQ1875(SEQ ID NO 10)和SQ36^的組合產(chǎn)生的擴(kuò)增子表明17314事件的存在。SEQ ID NO :12_引物SQ1871，用來(lái)識(shí)別位于基因組DNA側(cè)翼的事件17314。引物 SQ1871與插入表達(dá)盒的5’區(qū)域互補(bǔ)，接近轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界。SEQ ID NO 13-引物SQ1869，用來(lái)識(shí)別位于基因組DNA側(cè)翼的事件17314。引物 SQ1869與插入表達(dá)盒的5，區(qū)域互補(bǔ)，接近轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界。SEQ ID NO :14-引物SQ1880，用來(lái)識(shí)別位于基因組DNA側(cè)翼的事件17314。引物 SQ1880與插入表達(dá)盒的3，區(qū)域互補(bǔ)，接近轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界。SEQ ID NO :15-引物SQ36^，用來(lái)識(shí)別位于基因組DNA側(cè)翼的事件17314。引物 SQ3626與位于插入表達(dá)盒的5’末端側(cè)翼的基因組區(qū)域互補(bǔ)，接近轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界。SEQ ID NO 16-引物SQ3627，用來(lái)識(shí)別位于基因組DNA側(cè)翼的事件17314。引物 SQ3627與位于插入表達(dá)盒的3’末端側(cè)翼的基因組區(qū)域互補(bǔ)，接近轉(zhuǎn)基因DNA插入邊界。發(fā)明詳述提供下面的定義和方法以更好地定義本發(fā)明并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除非另有說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來(lái)理解術(shù)語(yǔ)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“包括(包含)”指“包括但不限于”。本發(fā)明提供事件17314和包含17314事件的轉(zhuǎn)基因水稻，其顯示商業(yè)上可接受的對(duì)于草甘膦除草劑應(yīng)用的耐受性。該事件包括轉(zhuǎn)基因DNA單插入到水稻種質(zhì)的染色體/基因組內(nèi)。包含事件的植物可以通過(guò)以下步驟產(chǎn)生(i)用包括目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(ii)再生由向植物基因組中插入轉(zhuǎn)基因而產(chǎn)生的植物群體；和(iii)選擇以在植物基因組中的特定位置插入轉(zhuǎn)基因?yàn)樘卣鞯奶囟ㄖ参铩Ｐg(shù)語(yǔ)“事件”指目標(biāo)基因向基因組中特定位置的特定的轉(zhuǎn)基因插入。包含事件的植物可以指原始的轉(zhuǎn)化體，其包括插入到植物基因組中的特定位置的轉(zhuǎn)基因。包含事件的植物也可以指轉(zhuǎn)化體的后代，該轉(zhuǎn)化體包括插入到植物的基因組中的特定位置的轉(zhuǎn)基因。這種后代可以通過(guò)該轉(zhuǎn)化體或其后代與另一種植物之間的有性遠(yuǎn)交產(chǎn)生。這樣的其他植物可以是包含相同或不同的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物和/或非轉(zhuǎn)基因植物，如不同的品種中的一種。即使經(jīng)過(guò)與回交親本的反復(fù)回交，來(lái)自轉(zhuǎn)化的親本的插入DNA和側(cè)翼DNA仍然存在于雜交后代中的相同的基因組位置。本文使用的術(shù)語(yǔ)“水稻”是指水稻(Oryza sativa)，包括所有可與水稻繁殖的植物品種，包括野生稻種以及那些屬于稻屬的允許物種間繁殖的植物。術(shù)語(yǔ)“事件”也指來(lái)自包含插入DNA和緊鄰插入DNA任一側(cè)的側(cè)翼水稻基因組DNA 的原始轉(zhuǎn)化體的DNA分子。這種DNA分子通過(guò)將轉(zhuǎn)基因DNA插入水稻的基因組(即轉(zhuǎn)化) 來(lái)產(chǎn)生。因此，這種DNA分子包含對(duì)于事件為特異性的且對(duì)于已向其中插入轉(zhuǎn)基因DNA的水稻基因組獨(dú)特的核苷酸序列，因?yàn)檫@種核苷酸序列包含水稻基因組DNA和轉(zhuǎn)基因DNA插入的特定區(qū)域的序列。插入DNA在水稻事件17314中相對(duì)于周圍水稻基因組DNA的排列因此對(duì)于水稻事件17314是特異性且獨(dú)特的。這種DNA分子也是包含事件17314的植物的水稻染色體的組成部分，因此在植物中是靜態(tài)的，并且可以傳遞到該植物的后代。事件17314賦予對(duì)應(yīng)用于水稻的草甘膦除草劑的耐受性?！安莞熟ⅰ敝窷-磷?；谆拾彼峒捌潲}。N-磷?；谆拾彼崾且环N對(duì)于廣譜植物種類具有活性的除草劑。當(dāng)施用到植物表面時(shí)，草甘膦可在整個(gè)植物中移動(dòng)。由于它抑制可提供用于合成芳族氨基酸的前體的莽草酸途徑，草甘膦具有植物毒性。本文使用的術(shù)語(yǔ)“重組”指通常在自然界不被發(fā)現(xiàn)的DNA和/或蛋白質(zhì)和/或有機(jī)體的形式，其是通過(guò)人工干預(yù)創(chuàng)造的。這種人工干預(yù)可以產(chǎn)生重組DNA分子和/或重組植物。本文使用的“重組DNA分子”是包含在自然界不會(huì)一起出現(xiàn)的DNA分子的組合的DNA分子，是人工干預(yù)的結(jié)果，例如，包括至少兩個(gè)彼此異源的DNA分子的組合的DNA分子，和/或包含與在自然界通常存在的多核苷酸序列不同的多核苷酸序列的人工合成DNA分子，和/ 或包含人工摻入宿主細(xì)胞基因組DNA內(nèi)的轉(zhuǎn)基因和宿主細(xì)胞基因組的相關(guān)側(cè)翼DNA的DNA 分子。重組DNA分子的一個(gè)例子是本文所述的由轉(zhuǎn)基因插入水稻基因組產(chǎn)生的DNA分子， 這可能最終導(dǎo)致重組RNA和/或蛋白質(zhì)分子在該生物體中的表達(dá)。本文使用的“重組植物” 是一種植物，其通常不會(huì)存在于自然界，是人工干預(yù)的結(jié)果，并包含摻入其基因組中的轉(zhuǎn)基因和/或異源DNA分子。由于這種基因組改變，重組植物與相關(guān)的野生型植物明顯不同。重組植物的一個(gè)例子是本文所述的包含事件17314的水稻。本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指人工摻入宿主細(xì)胞基因組的多核苷酸分子。這種轉(zhuǎn)基因可以對(duì)于宿主細(xì)胞是異源的。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因植物”指包括這種轉(zhuǎn)基因的植物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“異源的”指在自然界中通常不會(huì)與第二分子一同出現(xiàn)的第一分子。例如，分子可以來(lái)自第一物種，并插入到第二物種的基因組內(nèi)。該分子因此對(duì)于宿主是異源的，且人工摻入宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“嵌合的”指通過(guò)將第一 DNA分子與第二 DNA分子融合產(chǎn)生的單個(gè)DNA分子，其中，第一 DNA分子和第二 DNA分子通常不會(huì)以該構(gòu)型出現(xiàn)，即與另一個(gè)融合。 因此嵌合DNA分子是通常不會(huì)在自然界中發(fā)現(xiàn)的新的DNA分子。本發(fā)明提供DNA分子及其相應(yīng)的核苷酸序列。本文使用的術(shù)語(yǔ)“DNA”、“DNA分子”、 “多核苷酸分子”指基因組或合成來(lái)源的雙鏈DNA分子，S卩，脫氧核糖核苷酸堿基的聚合物或多核苷酸分子，從5’(上游)末端向3’(下游)末端閱讀。本文使用的術(shù)語(yǔ)“DNA序列”、 “核苷酸序列，，或“多核苷酸序列，，指DNA分子的核苷酸序列。本文使用的命名法是按照美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)§ 1.822第37條的規(guī)定和WIPO標(biāo)準(zhǔn)ST. 25(1998)附錄2的表1和3所要求的。 本發(fā)明的公開只是關(guān)于插入轉(zhuǎn)基因DNA位置處轉(zhuǎn)基因事件17314的基因組中存在的兩個(gè)核苷酸序列鏈中的一條鏈，特別是SEQ ID NOS 1-60因此，通過(guò)隱含和推導(dǎo)，互補(bǔ)序列(在本領(lǐng)域中也被稱為完整的互補(bǔ)序列或反向互補(bǔ)序列)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，因此也意圖在要求保護(hù)的主題的范圍內(nèi)。對(duì)應(yīng)于插入轉(zhuǎn)基因DNA的完整核苷酸序列和位于插入轉(zhuǎn)基因DNA任一端側(cè)翼的水稻基因組DNA的大部分片段的核苷酸序列在此以SEQ ID N0:6提供。該序列的小部分為以 SEQ ID NO 5提供的插入轉(zhuǎn)基因DNA。通過(guò)磷酸二酯鍵物理連接至插入轉(zhuǎn)基因DNA (SEQ ID NO 5)的5，末端因而位于其側(cè)翼的水稻基因組DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。通過(guò)磷酸二酯鍵物理連接至插入轉(zhuǎn)基因DNA (SEQ ID NO 5)的3’末端因而位于其側(cè)翼的水稻基因組DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
事件17314還包括兩個(gè)多核苷酸序列，一個(gè)跨越5’位置，一個(gè)跨越3’位置，其中轉(zhuǎn)基因DNA被插入到基因組DNA，在本文被稱為連接序列?！斑B接序列”或“連接區(qū)域”指跨越插入轉(zhuǎn)基因DNA和相鄰的側(cè)翼基因組DNA的DNA序列和/或相應(yīng)的DNA分子。連接序列任意地由兩個(gè)20核苷酸序列代表，提供為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，分別代表連接至插入DNA的10個(gè)核苷酸的緊鄰側(cè)翼基因組DNA的10個(gè)核苷酸。這些核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接。在水稻中，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2不會(huì)在基因組中天然地出現(xiàn)，且對(duì)于轉(zhuǎn)基因事件17314是特異的和獨(dú)特的，在源自水稻的任何核苷酸序列中鑒定到這些序列或者這些序列中每一個(gè)的至少約11、至少約13、或至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸可以確定該DNA是從水稻事件17314中獲得的，并且判斷樣品中存在來(lái)自水稻事件17314的DNA。SEQ ID N0:1是跨越水稻基因組DNA和插入DNA的5，末端之間的連接區(qū)的20個(gè)核苷酸的序列。SEQ ID NO 2是跨越水稻基因組DNA和插入DNA的3’末端之間的連接區(qū)的20個(gè)核苷酸的序列。因此， 本發(fā)明提供至少包含由SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的任一個(gè)或兩者所示的核苷酸序列的 DNA分子。足以包括SEQ ID NO=I的至少約11、至少約13或至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸的源自轉(zhuǎn)基因水稻事件17314的DNA的任何片段在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。足以包括SEQ ID NO 2 的至少約11、至少約13或至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸的源自轉(zhuǎn)基因水稻事件17314的DNA的任何片段在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。此外，包含與本段所述的任何序列互補(bǔ)的序列的任何多核苷酸在本發(fā)明的范圍內(nèi)。圖1說(shuō)明SEQ ID N0:l-5相對(duì)于SEQ ID NO :6從5，至3，排列的物理排列。本發(fā)明還提供包括SEQ ID NO :6的至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99%的核酸分子。本發(fā)明提供可以作為引物或探針用于判斷樣品中源自事件17314的DNA的存在的示例DNA分子。這樣的引物或探針對(duì)于靶核酸序列是特異性的，因而可用于通過(guò)本文所述的本發(fā)明的方法鑒定水稻事件17314。“引物”通常是高度純化的、分離的多核苷酸，其被設(shè)計(jì)用于包括熱擴(kuò)增的特定的退火或雜交方法。一對(duì)引物可以與模板DNA(如水稻基因組DNA的樣品)用于熱擴(kuò)增，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以產(chǎn)生擴(kuò)增子，其中，由這種反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增子具有對(duì)應(yīng)于位于兩個(gè)位點(diǎn)之間的模板DNA序列的DNA序列，在這兩個(gè)位點(diǎn)處引物與模板雜交。本文使用的“擴(kuò)增子”是已經(jīng)使用擴(kuò)增技術(shù)合成的DNA的一段或片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，判斷 17314事件的擴(kuò)增子包括不在水稻基因組中自然地存在的序列。本發(fā)明的擴(kuò)增子包括至少約11個(gè)連續(xù)的核苷酸、至少約13個(gè)連續(xù)的核苷酸、或SEQ ID NO =USEQ ID NO :2的至少約 11、至少約13或至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸和/或其互補(bǔ)物。引物通常被設(shè)計(jì)為與互補(bǔ)靶DNA 鏈雜交以形成引物和靶DNA鏈之間的雜種，引物的存在是聚合酶的識(shí)別點(diǎn)，以使用靶DNA鏈作為模板開始引物延伸(即，另外的核苷酸聚合成為加長(zhǎng)多核苷酸分子)。用于本發(fā)明中的引物對(duì)意指使用兩個(gè)結(jié)合雙鏈核苷酸片段的相反鏈的引物，其目的是通常在熱擴(kuò)增反應(yīng)或其他常規(guī)核酸擴(kuò)增方法中，線性擴(kuò)增位于將被引物對(duì)的各個(gè)成員所結(jié)合的位點(diǎn)之間的多核苷酸片段。用作引物的示例的DNA分子提供為SEQ ID NO :7_8和10-11。SEQ ID NO :7和 SEQ ID NO 8所示的引物對(duì)作為第一 DNA分子和不同于第一 DNA分子的第二 DNA分子，且這兩種分子的每一個(gè)具有SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的足夠長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列，以作為DNA引物發(fā)揮功能，當(dāng)在熱擴(kuò)增反應(yīng)中與源自水稻事件17314 的模板DNA —起使用時(shí)，產(chǎn)生包括SEQ ID NO 1的至少約11個(gè)連續(xù)的核苷酸、至少約13個(gè)連續(xù)的核苷酸、或至少約11、至少約13或至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸的擴(kuò)增子。提供示例的 DNA分子對(duì)，即SEQ ID N0:10和SEQ ID NO :11，作為第一 DNA分子和不同于第一 DNA分子的第二 DNA分子，這兩種分子的每一個(gè)具有SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6的足夠長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列，以作為DNA引物發(fā)揮功能，當(dāng)在熱擴(kuò)增反應(yīng)中與源自水稻事件17314的模板DNA —起使用時(shí)，產(chǎn)生包括SEQ ID NO :2的至少約11個(gè)連續(xù)的核苷酸、至少約13個(gè)連續(xù)的核苷酸、或至少約11、至少約13或至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸的擴(kuò)增子?！疤结槨笔桥c靶核酸的鏈互補(bǔ)的分離的核酸。本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特異性地結(jié)合靶DNA序列的聚酰胺和其他探針材料，并且這種結(jié)合的檢測(cè)可用于判斷、區(qū)別、確定或確認(rèn)特定樣品中靶DNA序列的存在。探針可以附著至常規(guī)可檢測(cè)的標(biāo)記或報(bào)告分子，如放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用于判斷事件17314的探針包括不在水稻基因組中自然存在的序列。用作探針的示例的DNA分子提供為SEQ ID NO :9。本發(fā)明的探針和引物可以具有與靶序列的完全序列一致性，雖然可以通過(guò)常規(guī)方法設(shè)計(jì)不同于靶序列而保留優(yōu)先與靶序列雜交的能力的引物和探針。為了使核酸分子用作引物或探針，只需要它們?cè)谛蛄猩铣浞只パa(bǔ)以能夠在所采用的特定的溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法可以用于鑒定樣品中來(lái)自水稻事件 17314的轉(zhuǎn)基因DNA的存在。探針和引物的長(zhǎng)度一般為至少約11個(gè)核苷酸，至少約18個(gè)核苷酸，至少約M個(gè)核苷酸，或至少約30個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。這種探針和引物在嚴(yán)格雜交條件下特異性地與目標(biāo)DNA序列雜交。Sambrook等人，1989和Haymes等人，In =Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC(1985) ffii^T胃夫 1 白勺嚴(yán)格性條件。如本文所用，如果兩個(gè)核酸分子能夠形成反平行雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，那么這兩個(gè)分子被認(rèn)為能夠特異性地彼此雜交。如果兩個(gè)核酸分子表現(xiàn)出完全的互補(bǔ)性，則一核酸分子被認(rèn)為是另一核酸分子的“互補(bǔ)物”。如本文所用，當(dāng)一個(gè)分子的每個(gè)核苷酸都與另一分子的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，這兩個(gè)分子被認(rèn)為顯示出“完全的互補(bǔ)性”。如果兩個(gè)分子能夠以足夠的穩(wěn)定性互相雜交從而允許它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的“低嚴(yán)格”條件下保持彼此退火，那么這兩個(gè)分子被認(rèn)為是“最低限度互補(bǔ)的”。類似地，如果分子能夠以足夠的穩(wěn)定性互相雜交從而允許它們?cè)诔Ｒ?guī)的“高嚴(yán)格”條件下保持彼此退火，那么這兩個(gè)分子被認(rèn)為是“互補(bǔ)的”。因而偏離完全互補(bǔ)性是允許的，只要這種偏離沒(méi)有完全消除該分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”指至少部分分離一種分子與在天然或自然狀態(tài)下通常與其關(guān)聯(lián)的其他分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“分離的”指與在天然或自然狀態(tài)下通常位于DNA分子側(cè)翼的核酸至少部分分離的DNA分子。因此，例如通過(guò)重組技術(shù)融合至與它們通常不相關(guān)的調(diào)控或編碼序列的DNA分子在本文被認(rèn)為是分離的。甚至在被整合到宿主細(xì)胞的染色體中或存在于具有其他DNA分子的核酸溶液中時(shí)，這種分子被認(rèn)為是分離的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的任何方法可以用來(lái)分離和操作本發(fā)明公開的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)可用于擴(kuò)增特定的起始DNA分子和/或產(chǎn)生原始分子的變體。DNA分子或其片段也可以通過(guò)其他技術(shù)來(lái)獲得，如通過(guò)化學(xué)方法直接合成片段，通常通過(guò)使用自動(dòng)化的寡核苷酸合成儀來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，本文提供的DNA分子和相應(yīng)的核苷酸序列尤其可用于鑒定水稻事件17314，選擇包含水稻事件17314的植物品種或雜種，檢測(cè)樣品中源自水稻事件17314的DNA的存在，和監(jiān)測(cè)樣品中水稻事件17314的存在和/或缺乏或包含水稻事件17314的植物和植物部分。 本發(fā)明提供水稻、后代、種子、植物細(xì)胞、植物部分(如花粉、胚珠、莢果、花、根或莖組織、纖維和葉)和商品。這些植物、后代、種子、植物細(xì)胞、植物部分和商品含有可檢測(cè)量的本發(fā)明的多核苷酸，即，如具有至少一種如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列的多核苷酸。本發(fā)明的植物、后代、種子、植物細(xì)胞和植物部分也可以包含一種或多種另外的轉(zhuǎn)基因。這種轉(zhuǎn)基因可以是任何編碼賦予理想性狀的蛋白質(zhì)或RNA分子的核苷酸序列，該理想性狀包括但不限于增強(qiáng)的抗蟲性、提高的水利用效率、增加的產(chǎn)量表現(xiàn)、增強(qiáng)的抗旱性、提高的種子質(zhì)量、改善的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和/或增強(qiáng)的除草劑耐受性，其中相對(duì)于缺乏這種額外的轉(zhuǎn)基因的水稻，測(cè)量該理想性狀。本發(fā)明提供水稻、后代、種子、植物細(xì)胞和源自包含事件17314的轉(zhuǎn)基因水稻的植物部分，如花粉、胚珠、莢果、花、根或莖組織和葉。為了使本發(fā)明能夠?qū)嵤录?7314 的種子的代表性的樣品已根據(jù)“布達(dá)佩斯條約”保藏。選擇的接受保藏物的保藏機(jī)構(gòu)是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，地址為美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯University Boulevard 10801，郵編20110。ATCC保藏機(jī)構(gòu)為事件17314種子分配的保藏號(hào)為PTA-9844。本發(fā)明提供一種包含具有存在于基因組中的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的DNA 分子的微生物。這樣的微生物的一個(gè)例子是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。微生物如本發(fā)明的植物細(xì)胞用于許多工業(yè)應(yīng)用，包括但不限于(i)用作科學(xué)探究或工業(yè)研究的研究工具；(ii)在培養(yǎng)中用于生產(chǎn)內(nèi)源性或重組碳水化合物、脂類、核酸或蛋白質(zhì)產(chǎn)品或小分子，可用于后續(xù)的科研或作為工業(yè)產(chǎn)品；和(iii)利用現(xiàn)代植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物或植物組織培養(yǎng)物，然后可以用于農(nóng)業(yè)研究或生產(chǎn)。微生物如轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的生產(chǎn)和使用利用現(xiàn)代微生物技術(shù)和人工干預(yù)，以產(chǎn)生人造的獨(dú)特的微生物。在這種方法中，重組DNA被插入植物細(xì)胞的基因組，以產(chǎn)生與天然存在的植物細(xì)胞不同且獨(dú)特的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。然后可以利用現(xiàn)代微生物技術(shù)培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞(非常類似于細(xì)菌和酵母細(xì)胞)，其可以以未分化的單細(xì)胞的狀態(tài)存在。新的植物細(xì)胞的遺傳組成和表型是通過(guò)將異源DNA整合到細(xì)胞的基因組中創(chuàng)建的技術(shù)效果。本發(fā)明的另一個(gè)方面是使用本發(fā)明的微生物的方法。使用本發(fā)明的微生物(如轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞)的方法包括(i)通過(guò)將重組DNA整合到細(xì)胞的基因組中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，然后使用這種細(xì)胞衍生具有相同異源DNA的其他細(xì)胞的方法；(ii)利用現(xiàn)代微生物技術(shù)培養(yǎng)含有重組DNA的細(xì)胞的方法；(iii)由培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生和純化內(nèi)源性或重組的碳水化合物、脂類、核酸或蛋白質(zhì)產(chǎn)品的方法；和(iv)利用現(xiàn)代植物組織培養(yǎng)技術(shù)用轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物組織培養(yǎng)物的方法。本發(fā)明的植物可以向后代傳遞事件DNA (包括轉(zhuǎn)基因)。本文使用的“后代，，包括任何包含源自祖先植物的事件DNA和/或具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的至少一種序列的多核苷酸的植物、種子、植物細(xì)胞和/或可再生的植物部分。植物、后代和種子對(duì)于轉(zhuǎn)基因而言可以是純合的或雜合的。后代可以從由包含事件17314的水稻產(chǎn)生的種子長(zhǎng)成和/或從用來(lái)自包含事件17314的水稻的花粉授粉的植物產(chǎn)生的種子長(zhǎng)成。后代植物可以自花授粉(又稱“自交”)，以產(chǎn)生植物的純育種系，即對(duì)于轉(zhuǎn)基因而言純合的植物。合適的后代的自交可以產(chǎn)生對(duì)于添加的外源基因而言純合的植物。
另外，后代植物可以遠(yuǎn)交，例如，與另一種無(wú)關(guān)的植物繁殖，以產(chǎn)生變種或雜交種子或植物。其他無(wú)關(guān)的植物可以是轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的。本發(fā)明的變種或雜交種子或植物因此可以通過(guò)雜交缺乏水稻事件17314的特異和獨(dú)特DNA的第一親本與包含水稻事件 17314的第二親本而產(chǎn)生，產(chǎn)生包含水稻事件17314的特異和獨(dú)特的DNA的雜種。只要雜交或繁殖產(chǎn)生本發(fā)明的植物或種子，即具有至少一個(gè)含有包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO: 2的水稻事件17314的特異和獨(dú)特DNA的等位基因的種子，每個(gè)親本可以為雜種或自交系/ 變種。因此，兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物可以雜交以產(chǎn)生包含兩個(gè)獨(dú)立分隔、添加的外源基因的雜種后代。例如，包含事件17314的耐受草甘膦的水稻可以與其他轉(zhuǎn)基因水稻雜交以產(chǎn)生具有兩個(gè)轉(zhuǎn)基因親本的特征的植物。這樣的一個(gè)例子是包含事件17314的耐受草甘膦的水稻與具有額外的一種或多種性狀的水稻的雜交，導(dǎo)致產(chǎn)生耐受草甘膦并且具有額外的一種或多種性狀的后代植物或種子。例如，顯示膦絲菌素或草丁膦除草劑耐受性的水稻可以與包含事件17314的水稻雜交以產(chǎn)生耐受草甘膦和膦絲菌素或草丁膦除草劑的后代植物或種子。用于本文公開的方法的植物和種子因此還可以包含一個(gè)或多個(gè)額外的轉(zhuǎn)基因。這樣的轉(zhuǎn)基因可以是任何編碼賦予理想性狀的蛋白質(zhì)或RNA分子的核苷酸序列，該理想性狀包括但不限于增強(qiáng)的抗蟲性、提高的水利用效率、增加的產(chǎn)量表現(xiàn)、增強(qiáng)的抗旱性、提高的種子質(zhì)量、改善的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、改善的應(yīng)激耐受性和/或增強(qiáng)的除草劑耐受性，其中相對(duì)于缺乏這種額外的轉(zhuǎn)基因的水稻，測(cè)量該理想性狀。已經(jīng)證明轉(zhuǎn)基因植物對(duì)其耐受并且本發(fā)明的方法可以應(yīng)用的除草劑包括但不限于草甘膦、草丁膦、磺酰脲類、咪唑啉酮類、溴苯腈、茅草枯(delapon)、環(huán)己烯二酮、原卟啉原(protoporphyrionogen)氧化酶抑制劑和異噁氟草(isoxasflutole)除草劑。編碼與除草劑耐受性有關(guān)的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子是本領(lǐng)域已知的，且包括但不僅限于編碼以下的多核苷酸分子草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS ；參見， 例如，美國(guó)專利 5，627，061 ；5，633，435 ；6，040，497 ；5，094，945 ；5，804，425 ；6，248，876 ； 7，183, 110 ；RE39, 247)；草甘膦氧化還原酶(G0X ；參見，例如，美國(guó)專利5，776，760)；草甘膦-N-乙?；D(zhuǎn)移酶(GAT)；耐受磺酰脲類、咪唑啉酮類、三唑嘧啶類、嘧啶氧苯甲酸酯類和/或雜芳基醚類的耐受除草劑的乙酰乳酸合酶(ALS，也稱為乙酰羥酸合酶)；耐受芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)(如吡氟氯禾靈(haloxyfop)、喹禾靈(quizalofop)、dichlorofop 和禾草靈(diclofop))的耐受除草劑的乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)或R_2，4_ 二氯苯氧丙酸酯雙加氧酶(rdpA)；耐受合成生長(zhǎng)素除草劑的解毒蛋白，如2，4-D雙加氧酶(tfdA)、 R-2，4-二氯苯氧丙酸酯雙加氧酶(rdpA)、芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶(AAD)和/或S-2， 4-滴丙酸雙加氧酶(sdpA)；耐受溴苯腈的溴苯腈腈水解酶(Bxn)(參見，例如，美國(guó)專利號(hào) 4，810，648)；耐受氟草敏(norflurazon)的八氫番茄紅素去飽和酶(crtl)；耐受草丁膦和雙丙胺磷(bialaphos)的雙丙胺磷抗性(bar)或膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyltransferase)蛋白質(zhì)(參見，例如，美國(guó)專利5，646，0 和5，276，268)；和三酮類 (硝磺草酮(mezotrione)、tembotrione、topromezone、異噁唑))除草劑耐受的蛋白質(zhì)，如耐受性的4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)、解毒細(xì)胞色素P450或HPPD途徑旁路如球形節(jié)桿菌(Artbrobacter globiformis)HPP 氧化酶(HPPO)和食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovorans)4-HPA 1_ 羥化酶(HPAH)和 NADH 氧化還原酶(HPAC)。編碼用于轉(zhuǎn)基因植物的其他蛋白質(zhì)的多核苷酸分子是本領(lǐng)域已知的，包括
13但不限于編碼以下的多核苷酸分子大腸桿菌cspA (PCT公開W02005/033318)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)cspB(PCT公開W02005/033318)、玉米鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(美國(guó)公開 20040034888,20070011783,20070294782)、玉米 nfb2 (又名 hap3)(美國(guó)公開 20050022266 和 20080104730、PCT 公開 W02008/002480)、棉花 csp-樣(美國(guó)系列號(hào) 11/980，758、美國(guó)公開 20050097640、PCT 公開 W02005/033318)、小麥 csp 樣(美國(guó)專利 7，214，786 ；美國(guó)公開 20050097640)、G1988 (美國(guó)系列號(hào) 09/474，435、PCT 公開 W004/031349)、G1073 (美國(guó)專利 6，717，034 和美國(guó)公開 20050097631)、G1274(美國(guó)公開 20090265813)和 CGPG 2117 (美國(guó)公開20080090998)。編碼用于轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)的其他多核苷酸分子是本領(lǐng)域已知的， 該蛋白質(zhì)包括那些用于病蟲害控制的蛋白質(zhì)，如殺線蟲劑、殺真菌劑和殺蟲劑。殺蟲劑包括但不限于Bt毒素和/或來(lái)自致病桿菌屬(Xenhorabdus)、光桿狀菌屬(Photorhabdus)、芽孢桿菌屬(如側(cè)孢芽孢桿菌屬(Bacillus Iaterosporous))、沙雷菌屬(Serratia)、克雷白桿菌屬(Klebsiella)、歐文氏菌屬(Erwinia)等的毒素。Bt毒素包括但不限于VIP毒素類、 Cryl' s、Cry2’ s、Cry3’ s、Cry4’ s、Cry5’ s、Cry7’ s、Cry8’ s、Cry9’ s 和二元?dú)⑾x毒素，如那些衍生自Bt的毒素等。也考慮與親本植物回交以及與非轉(zhuǎn)基因植物遠(yuǎn)交，以及無(wú)性繁殖。常用于不同性狀和作物的其他育種方法的描述可以在許多參考文獻(xiàn)之一中找到，例如Fehr，in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed.，American Society of Agronomy, Madison WI(1987)。本發(fā)明提供源自包含事件17314的水稻的植物部分。本文所用的“植物部分”指植物的任何部分，其包括源自包含事件17314的水稻的材料。植物部分包括但不限于花粉、 胚珠、莢果、花、根或莖組織、纖維和葉。植物部分可以是能存活的、不能存活的、可再生的和 /或不可再生的。本發(fā)明提供源自包含事件17314的水稻的商品。本文使用的“商品”指任何包括源自包含事件17314的水稻、種子、植物細(xì)胞或植物部分的材料的組合物或產(chǎn)品。商品可以出售給消費(fèi)者，且可以是能存活的或不能存活的。不能存活的商品包括但不限于不能存活的種子和谷粒；加工的種子、種子部分和植物部分；脫水的植物組織、冷凍的植物組織和加工的植物組織；加工的用于陸生和/或水生動(dòng)物消耗的動(dòng)物飼料的種子和植物部分、油、粗粉、面粉、薄片、麩皮、纖維、乳液、奶酪、紙、奶油、酒和任何供人類食用的其他食物；以及生物質(zhì)和燃料產(chǎn)品。能存活的商品包括但不限種子和植物細(xì)胞。包含事件17314的水稻因此可以用于制造任何通常由水稻獲得的商品。源自包含事件17314的植物的任何此類商品可以包含至少可檢測(cè)量的對(duì)應(yīng)于水稻事件17314的特異性和獨(dú)特的DNA，特別可以包含可檢測(cè)量的含有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。可以使用任何核苷酸分子的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，包括本文所公開的檢測(cè)方法。如果商品中存在任何可檢測(cè)量的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2，則該商品在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的植物、后代、種子、植物細(xì)胞、植物部分(如花粉、胚珠、莢果、花、根或莖組織和葉)和商品尤其可用于以產(chǎn)生用于農(nóng)業(yè)的包含事件17314的種子和/或植物部分 為目的種植植物，生產(chǎn)包含事件17314的后代用于植物育種和研究目的，使用微生物技術(shù)用于工業(yè)和研究應(yīng)用，和出售給消費(fèi)者。本發(fā)明提供控制雜草的方法和使用草甘膦除草劑產(chǎn)生植物和包含事件17314的植物的方法。本發(fā)明提供在田地中控制雜草的一種方法，且該方法包括在田地中種植包含事件17314的變種或雜種植物，和以控制田地中的雜草而不損害包含事件17314的植物為目的向田地應(yīng)用除草有效劑量的草甘膦。草甘膦除草劑的這種應(yīng)用可以在出苗前(即種植包含事件17314的種子之后和包含事件17314的植物出苗之前的任何時(shí)間)或出苗后(即包含事件17314的植物出苗后的任何時(shí)間)。本發(fā)明還提供在田地中控制雜草的另一種方法，且該方法包括應(yīng)用有效劑量的草甘膦除草劑以控制田地中的雜草，然后在田地中種植包含事件17314的水稻。草甘膦除草劑的這種應(yīng)用在種植前(即種植包含事件17314的種子之前)，且可以在種植前的任何時(shí)間(包括但不限于種植前約14天至種植前約1天)進(jìn)行。用于田地中的除草有效劑量的草甘膦應(yīng)包括一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)每英畝約0.5磅草甘膦至多達(dá)每英畝約4.5磅草甘膦。一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可以多次應(yīng)用草甘膦，例如，兩次應(yīng)用(如種植前的應(yīng)用和出苗后的應(yīng)用，或出苗前的應(yīng)用和出苗后的應(yīng)用)或三次應(yīng)用(如種植前的應(yīng)用、 出苗前的應(yīng)用和出苗后的應(yīng)用)。本發(fā)明提供生產(chǎn)包含對(duì)于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因事件17314特異性和獨(dú)特的DNA序列的抗除草劑耐受性水稻的方法。用于這些方法的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于轉(zhuǎn)基因可以為純合的或雜合的。通過(guò)這些方法所產(chǎn)生的后代植物可以是變種或雜種植物；可以從由植物產(chǎn)生的種子長(zhǎng)成和/或從通過(guò)用來(lái)自包含事件17314的水稻的花粉授粉的植物產(chǎn)生的包含事件17314的種子長(zhǎng)成；且對(duì)于轉(zhuǎn)基因可以是純合的或雜合的。后代植物可以隨后自花授粉以產(chǎn)生植物純育種系(即，對(duì)于轉(zhuǎn)基因?yàn)榧兒系闹参?，或者可以遠(yuǎn)交，例如，與另一無(wú)關(guān)的植物雜交， 以產(chǎn)生變種或雜交種子或植物。通過(guò)包含具有序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的多核苷酸分子、包含事件17314 的植物與另一種水稻有性雜交從而產(chǎn)生種子，可以產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑的應(yīng)用的水稻， 其然后生長(zhǎng)為后代植物。這些后代植物然后可以用草甘膦除草劑處理來(lái)選擇耐受草甘膦除草劑的后代植物?；蛘?，這些后代植物可以經(jīng)使用判斷方法分析以選擇包含事件17314DNA 的后代植物。用于雜交的其他植物可能耐受或可能不耐受草甘膦除草劑，可能是或可能不是轉(zhuǎn)基因的。產(chǎn)生的后代植物和/或種子可以是變種或雜種種子。在實(shí)行這種方法中，一種植物與另一種植物有性雜交(即異花授粉)的步驟可以通過(guò)人工干預(yù)完成或協(xié)助，例如手工收集一種植物的花粉，將此花粉與第二植物的花柱或柱頭接觸；手工和/或用動(dòng)作除去、破壞或覆蓋植物的雄蕊或花藥(例如，通過(guò)去雄或應(yīng)用化學(xué)殺配子劑)使得自然的自花授粉被阻止，且為了授粉，必需進(jìn)行異花授粉；在“定向授粉”的位置人工放置傳粉昆蟲(例如，在果園或田地放置蜂箱或?qū)鞣劾ハx放于植物周圍)；人工打開或除去花的部分，以使得外源性花粉放置于或接觸花柱或柱頭(例如，在天然具有妨礙或阻止異花授粉的花的水稻中，使其自然地發(fā)生自花授粉，無(wú)需人工干預(yù))；選擇性放置植物(例如，有意授粉靠近地種植植物)；和/或應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)以促成開花或促進(jìn) (柱頭對(duì)于花粉的)可接受性。通過(guò)包含具有序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的多核苷酸分子、包含事件17314 的植物自交從而產(chǎn)生種子，可以產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑的應(yīng)用的水稻，其然后生長(zhǎng)為后代植物。這些后代植物然后可以用草甘膦除草劑處理來(lái)選擇耐受草甘膦除草劑的后代植物。 或者，這些后代植物可以經(jīng)使用判斷方法分析以選擇包含事件17314DNA的后代植物。在實(shí)行這種方法中，一種植物與自身有性雜交(即自花授粉或自交)的步驟可以通過(guò)人工干預(yù)完成或協(xié)助，例如手工收集植物的花粉，將此花粉與同一植物的花柱或柱頭接觸，然后任選地防止該植物的進(jìn)一步的授粉；手工和/或通過(guò)動(dòng)作除去、破壞或覆蓋其他附近植物的雄蕊或花藥(例如，通過(guò)去雄或應(yīng)用化學(xué)殺配子劑)使得自然的異花授粉被阻止，且為了授粉，必需進(jìn)行自花授粉；在“定向授粉”的位置人工放置傳粉昆蟲(例如，將傳粉昆蟲放于單獨(dú)的植物周圍)；人工處理花或其部分，以允許自花授粉；選擇性放置植物(例如，有意種植植物遠(yuǎn)離授粉距離)；和/或應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)以促成開花或促進(jìn)(柱頭對(duì)于花粉的)可接受性。 這些方法所包含的以及使用這些方法產(chǎn)生的后代水稻和種子有別于其他水稻，例如，因?yàn)楹蟠竞头N子是重組的，因而是通過(guò)人工干預(yù)產(chǎn)生的；耐受草甘膦除草劑；包含至少一個(gè)由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因DNA組成的等位基因；和/或包含可檢出量的選自SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2的多核苷酸序列。只要種子包括SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，該種子可以選自單個(gè)后代植物，這在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在實(shí)行本發(fā)明中，兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物可以雜交以產(chǎn)生包含兩個(gè)獨(dú)立分離的異源基因的雜種后代。適當(dāng)后代的自交能夠產(chǎn)生對(duì)于這兩個(gè)基因均為純合的植物。也考慮與親本植物回交和與非轉(zhuǎn)基因植物遠(yuǎn)交，以及無(wú)性繁殖。常用于不同性狀和作物的其他育種方法的描述可以在許多參考文獻(xiàn)之一中找到，例如Fehr，in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed.，American Society of Agronomy, Madison WI (1987)。用于本文公開的方法的植物和種子也可以包含一種或多種另外的轉(zhuǎn)基因。這種轉(zhuǎn)基因可以是任何編碼賦予理想性狀的蛋白質(zhì)或RNA分子的核苷酸序列，該理想性狀包括但不限于增強(qiáng)的抗蟲性、提高的水利用效率、增加的產(chǎn)量表現(xiàn)、增強(qiáng)的抗旱性、提高的種子質(zhì)量、改善的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和/或增強(qiáng)的除草劑耐受性，其中相對(duì)于缺乏這種額外的轉(zhuǎn)基因的水稻，測(cè)量所述理想性狀。因此，本發(fā)明的方法尤其可以用于控制田地中的雜草同時(shí)生長(zhǎng)植物以產(chǎn)生包含事件17314的種子和/或植物部分用于農(nóng)業(yè)或研究目的，選擇包含事件17314的后代用于植物育種或研究目的，和產(chǎn)生包含事件17314的后代植物和種子?？梢詫?duì)本發(fā)明的植物、后代、種子、植物細(xì)胞、植物部分(如花粉、胚珠、莢果、花、 根或莖組織和葉)和商品評(píng)估DNA組成、基因的表達(dá)和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種評(píng)估可以通過(guò)以下方法來(lái)進(jìn)行使用標(biāo)準(zhǔn)方法，如PCR、northern印跡、southern印跡、免疫印跡、免疫沉淀和ELISA ；或使用本文提供的檢測(cè)方法和/或檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中水稻事件17314特異性材料的存在的方法。一種方法包括檢測(cè)特異于和源自包含水稻事件17314的水稻細(xì)胞、組織或植物的DNA的存在。該方法提供待與引物對(duì)接觸的模板DNA樣品，所述引物對(duì)在經(jīng)受適于熱擴(kuò)增的條件時(shí)能夠從事件 17314DNA產(chǎn)生擴(kuò)增子，尤其是包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列的擴(kuò)增子。只要模板DNA分子包含如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的特異性和獨(dú)特的核苷酸序列，擴(kuò)增子由源自水稻事件17314的模板DNA分子產(chǎn)生。根據(jù)用于產(chǎn)生擴(kuò)增子所選定的聚合酶，擴(kuò)增子可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。該方法提供檢測(cè)在任何這樣的熱擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的擴(kuò)增子分子，并確定對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2或其互補(bǔ)序列的核苷酸在擴(kuò)增子序列中的存在。在擴(kuò)增子中檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1或SEQID NO :2或其互補(bǔ)序列的核苷酸能夠確定和/或判斷樣品中存在事件17314特異性DNA，因而存在包含事件17314的生物材料。本發(fā)明提供另一種方法，用于檢測(cè)由源自水稻或水稻組織的材料組成的樣品中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的DNA分子的存在。該方法包括(i)從水稻或一組不同的水稻中提取DNA樣品；(ii)將該DNA樣品與顯示SEQ ID NO :1或SEQ ID N0:2所示的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA探針?lè)肿咏佑|；(iii)允許探針和DNA樣品在嚴(yán)格的雜交條件下雜交；然后(iv)檢測(cè)探針和靶DNA樣品之間的雜交事件。檢測(cè)到雜合組成可判斷DNA樣品中存在SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4，視具體情況而定。沒(méi)有雜交可判斷樣品中沒(méi)有轉(zhuǎn)基因事件?；蛘撸_定特定的水稻中包含一個(gè)或兩個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2 的序列或其互補(bǔ)序列可以確定該水稻包含至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于事件17314的等位基因。因此，可以通過(guò)任何公知的核酸檢測(cè)方法(如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或使用核酸探針的DNA雜交)檢測(cè)本發(fā)明的核酸分子的存在。例如，Taverniers等人(J. Agric. Food Chem. ,53 =3041-3052,2005)討論了事件特異性的PCR分析方法，其中證明了用于轉(zhuǎn)基因玉米株系Btll、Btl76和GA21及用于油菜(canola)事件RT73的事件特異性追蹤系統(tǒng)。 在這項(xiàng)研究中，事件特異性的引物和探針基于各事件的基因組/轉(zhuǎn)基因連接區(qū)的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。轉(zhuǎn)基因植物事件特異性的DNA檢測(cè)方法也已在美國(guó)專利6，893，826,6, 825，400、 6，740，488,6, 733，974,6, 689，880,6, 900，014 和 6，818，807 中描述。本發(fā)明提供DNA檢測(cè)試劑盒。其中一類試劑盒包含至少一種具有足夠長(zhǎng)度的與 SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6相似或互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸的DNA分子，其作為特異性DNA引物或探針用于檢測(cè)樣品中源自轉(zhuǎn)基因水稻事件17314的DNA的存在。用該試劑盒檢測(cè)的DNA分子包含SEQ ID NO 1所示的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列?；蛘?， 該試劑盒可以包含至少一種具有足夠長(zhǎng)度的與SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6相似或互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸的DNA分子，其作為特異性DNA引物或探針用于檢測(cè)生物樣品中源自轉(zhuǎn)基因水稻事件17314的DNA的存在。用該試劑盒檢測(cè)的DNA分子包含SEQ ID NO 2 所示的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。可選擇的試劑盒采用以下方法其中用上文所述的引物對(duì)接觸靶DNA樣品，然后進(jìn)行足以產(chǎn)生包含SEQ ID NO :2所示的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列的擴(kuò)增子的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。檢測(cè)到擴(kuò)增子以及確定擴(kuò)增子序列內(nèi)存在SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的不少于15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列可以確定，或者說(shuō)，能夠判斷靶DNA樣品中存在17314 事件特異性的DNA。本發(fā)明提供足以用作DNA探針的DNA分子，所述DNA探針用于確定、檢測(cè)或判斷樣品中存在或甚至不存在事件17314DNA特異性和獨(dú)特的DNA。DNA分子含有SEQ ID N0:1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列，或SEQ ID NO 2的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的各種核酸擴(kuò)增方法中的任何一種(包括熱擴(kuò)增方法)實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增?？梢酝ㄟ^(guò)使用源自本發(fā)明提供的序列的引物擴(kuò)增來(lái)自所述事件的這種序列， 接著對(duì)擴(kuò)增子或克隆的DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序，來(lái)驗(yàn)證(如果必要，校正)來(lái)自水稻事件 17314 (包含事件17314的代表性的種子樣品已經(jīng)作為ATCC PTA-9844保藏)的異源DNA插入序列、連接序列或側(cè)翼序列。
可以通過(guò)多種技術(shù)檢測(cè)由這些方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子。一種這樣的方法是遺傳位分析 (Genetic Bit Analysis) (Nikiforov等人，Nucleic Acid Res. 22 :4167_4175，1994)，其中設(shè)計(jì)了與相鄰的側(cè)翼基因組DNA序列和插入的DNA序列重疊的DNA寡核苷酸。將該寡核苷酸固定在微孔板的孔中。繼目標(biāo)區(qū)域的熱擴(kuò)增(對(duì)插入序列使用一個(gè)引物，對(duì)相鄰的側(cè)翼基因組序列使用另一個(gè)引物)之后，可以將單鏈的擴(kuò)增子(熱擴(kuò)增產(chǎn)物)與固定的寡核苷酸雜交，并用作單堿基延伸反應(yīng)的模板，該反應(yīng)使用DNA聚合酶和對(duì)于預(yù)期的下一堿基特異性的標(biāo)記ddNTP。讀數(shù)可以是熒光或基于ELISA的。檢測(cè)到熒光或其他信號(hào)表明由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸而存在插入/側(cè)翼序列。

另一種方法是Winge(Innov. Pharma. Tech. 00 18-24, 2000)所描述的焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing technique)。在該方法中，寡核苷酸設(shè)計(jì)為與相鄰的基因組DNA 和插入DNA連接區(qū)重疊。將寡核苷酸與來(lái)自目標(biāo)區(qū)域的單鏈熱擴(kuò)增產(chǎn)物(單鏈擴(kuò)增子) (插入序列使用一個(gè)引物，側(cè)翼基因組序列使用另一個(gè)引物)雜交，并在DNA聚合酶、ATP、 硫酸化酶(sulfurylase)、螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)、腺苷5，磷酰硫酸 (adenosine 5' phosphosulfate)和螢光素的存在下孵育。單個(gè)地加入ddNTP，摻入產(chǎn)生光信號(hào)，對(duì)產(chǎn)生的光信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。光信號(hào)表明由于成功的擴(kuò)增、雜交和單-或多-堿基延伸而存在轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列。如Chen等人(Genome Res. 9 =492-498,1999)所述的熒光偏振是一種可用于檢測(cè)擴(kuò)增子的方法。使用此方法，設(shè)計(jì)與基因組側(cè)翼DNA和插入DNA連接區(qū)重疊的寡核苷酸。 將該寡核苷酸與目標(biāo)區(qū)域的單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物(插入DNA使用一個(gè)引物，側(cè)翼基因組序列使用另一個(gè)引物)雜交，并在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP的存在下孵育。單堿基延伸導(dǎo)致 ddNTP的摻入?？梢允褂脽晒庥?jì)作為偏振的變化而測(cè)定摻入。偏振的改變表明由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸而存在轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列。也可以根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書，利用TAQMAN (PE Applied Biosystems， Foster City, CA)檢測(cè)和定量DNA序列的存在。簡(jiǎn)單地說(shuō)，設(shè)計(jì)與基因組側(cè)翼和插入DNA連接區(qū)重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針和擴(kuò)增引物(插入DNA序列使用一個(gè)引物，側(cè)翼基因組序列使用另一個(gè)引物)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP的存在下循環(huán)。FRET探針的雜交導(dǎo)致熒光部分從FRET探針上的猝滅部分裂解和釋放。熒光信號(hào)表明由于成功的擴(kuò)增和雜交而存在側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列。如Tyangi 等人(Nature Biotech. 14 =303-308,1996)所述，已描述分子信標(biāo)用于序列檢測(cè)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，設(shè)計(jì)與側(cè)翼基因組和插入DNA連接區(qū)重疊的FRET寡核苷酸探針。 FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它含有保持熒光部分和猝滅部分緊密接近的二級(jí)結(jié)構(gòu)。FRET探針和擴(kuò)增引物(插入DNA序列使用一個(gè)引物，側(cè)翼基因組序列使用另一個(gè)引物)在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP的存在下循環(huán)。繼成功進(jìn)行擴(kuò)增之后，F(xiàn)RET探針與靶序列的雜交導(dǎo)致探針二級(jí)結(jié)構(gòu)喪失及熒光和猝滅部分的空間分離，導(dǎo)致熒光信號(hào)的產(chǎn)生。熒光信號(hào)表明由于成功的擴(kuò)增和雜交而存在側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列。本領(lǐng)域已知的其他方法可以用于實(shí)行本發(fā)明的方法如微流體技術(shù)(參見，例如，美國(guó)專利公開2006068398和美國(guó)專利6，544，734)， 其提供分離和擴(kuò)增DNA樣品的方法和設(shè)備；檢測(cè)和測(cè)量特定的DNA分子的光染料(參見， 例如，W0/05017181)；包含用于檢測(cè)DNA分子的電子傳感器的納米管裝置(參見，例如， TO/06024023)；和/或結(jié)合特定的DNA分子然后可以檢測(cè)該DNA分子的納米珠。
可以使用本文公開的組合物和DNA檢測(cè)領(lǐng)域已知的方法開發(fā)DNA檢測(cè)試劑盒。該試劑盒用于鑒定樣品中的事件17314，且可以應(yīng)用于培育含有適當(dāng)?shù)氖录﨑NA的水稻植物的方法。試劑盒可以包含與SEQ ID NO :1-6或其片段類似或互補(bǔ)的DNA引物或探針。因此， 本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法尤其可用于鑒定水稻17314事件，選擇包含事件17314的植物變種或雜種，檢測(cè)樣品中源自水稻事件17314的DNA的存在，和對(duì)樣品監(jiān)測(cè)水稻事件17314 的存在和/或不存在或包含水稻事件17314的植物、植物部分或商品。本文包括下面的實(shí)施例來(lái)證明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)施例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在實(shí)施本發(fā)明中運(yùn)用良好的技術(shù)，因此可以被認(rèn)為是構(gòu)成實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式的實(shí)施例。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)公開的具體實(shí)施方案進(jìn)行許多改變，而且仍然獲得相同或類似的結(jié)果。
實(shí)施例實(shí)施例1 水稻的轉(zhuǎn)化和事件選擇本實(shí)施例說(shuō)明如何產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因水稻的事件和如何選擇事件17314。通過(guò)用如圖1 所示的轉(zhuǎn)基因DNA片段(其序列如SEQ ID NO 5所示)對(duì)水稻細(xì)胞進(jìn)行粒子槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的耐受草甘膦的事件17314。轉(zhuǎn)基因DNA片段包括包含源自花椰菜花葉病毒的啟動(dòng)子(P-CaMV. e35S)分子、包含復(fù)制的增強(qiáng)子的表達(dá)盒，該表達(dá)盒可操作地連接至源自水稻肌動(dòng)蛋白1基因的內(nèi)含子分子(I-Os. Actl)，可操作地連接至編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽 (CTP2，擬南芥EPSPQ的DNA分子，可操作地連接至編碼草甘膦抗性EPSPS (AGRtu. EPSPS CP4)的DNA分子，可操作地連接至源自根癌土壤桿菌胭脂堿合成酶基因的3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū) DNA 分子(T-AGRtu. nos)。首先，使用粒子槍方法，用4個(gè)表達(dá)盒中的一個(gè)轉(zhuǎn)化來(lái)自水稻品種M-202的外植體。然后在含有草甘膦的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并將存活細(xì)胞再生為植物。轉(zhuǎn)化過(guò)程產(chǎn)生擬8株RO植物，每株RO植物為單獨(dú)的、個(gè)別的事件。在RO階段通過(guò)PCR和Southern 分析篩選這9 個(gè)事件，以消除多拷貝和/或分子復(fù)雜事件。對(duì)于PCR分析，最初對(duì)提取的 DNA進(jìn)行端點(diǎn)TAQMAN 檢測(cè)?；赑CR篩選，選出565個(gè)RO事件。然后通過(guò)Southern分析篩選這565個(gè)RO事件。對(duì)于Southern分析，從水稻組織提取DNA，用NcoI和EcoRI或 SSPI消化，并利用Southern印跡雜交分析技術(shù)與互補(bǔ)于CaMV 35S啟動(dòng)子和EPSPS編碼序列的放射性DNA探針進(jìn)行雜交。這些數(shù)據(jù)被用于確定插入水稻基因組中的轉(zhuǎn)基因盒拷貝數(shù)，并選擇240個(gè)具有單一插入的RO事件。這240個(gè)選定的事件然后被轉(zhuǎn)到生長(zhǎng)室用于表型和能育性分析，以確定非型植物。從生長(zhǎng)室的表型和能育性篩選中選出170個(gè)事件進(jìn)行下一步。然后在生長(zhǎng)室中，對(duì)這 170個(gè)Rl事件篩選草甘膦耐受性。也通過(guò)次級(jí)Southern分析，對(duì)這些植物分析完整的轉(zhuǎn)基因插入。使用從這些分析收集的數(shù)據(jù)，選出19個(gè)事件進(jìn)行下一步。隨后，選出其中13個(gè)事件的R2植物用于田間試驗(yàn)。對(duì)于這13個(gè)事件中的每一個(gè)在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)，對(duì)于這些事件中的5個(gè)在兩個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)，收集植物的多個(gè)特征的田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)。在第一年的田間試驗(yàn)中， 在多重復(fù)田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最少3個(gè)地點(diǎn)，測(cè)試這13個(gè)事件的草甘膦耐受性和農(nóng)藝學(xué)等效性。結(jié)果列于表1中。
表1 第一季田間試驗(yàn)程序的田間試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.DNA分子，包括(a)具有選自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的序列的多核苷酸分子；(b)具有SEQID NO 3核苷酸位置觀3_302的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的多核苷酸分子；(c)具有SEQID NO 4核苷酸位置666-685的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的多核苷酸分子；或(d)與(a)、(b)或(c)互補(bǔ)的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，包含與SEQID NO 6具有至少90%—致性的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子，其中，所述DNA分子源自事件17314，包含事件17314 的種子的代表性的樣品已經(jīng)以ATCC保藏號(hào)PTA-9844保藏。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子，其中，所述DNA分子包含在水稻、植物細(xì)胞、種子、后代植物、植物部分或商品中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA分子，其中，所述DNA分子是由事件17314的模板分子產(chǎn)生的擴(kuò)增子。
6.用于判斷事件17314的存在的多核苷酸探針，其中，所述探針具有足夠的長(zhǎng)度以結(jié)合選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的序列的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的序列或其互補(bǔ)序列。
7.由第一DNA分子和不同于第一 DNA分子的第二 DNA分子組成的DNA分子對(duì)，其中，所述這些DNA分子具有SEQ ID NO 6的足夠長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列， 從而在與來(lái)自水稻事件17314的模板一起在擴(kuò)增反應(yīng)中使用時(shí)，作為DNA引物發(fā)揮功能，以產(chǎn)生用于判斷樣品中的水稻事件17314的擴(kuò)增子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的DNA分子對(duì)，其中，所述擴(kuò)增子包含選自SEQID NO=I和SEQ ID NO 2及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
9.一種檢測(cè)來(lái)自水稻事件17314的DNA分子的存在的檢測(cè)方法，包括(a)使DNA樣品接觸權(quán)利要求7所述的DNA分子對(duì)；(b)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，該擴(kuò)增反應(yīng)足以產(chǎn)生一種擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子包含具有選自SEQID NO :1和SEQ ID NO 2的序列的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸分子或其互補(bǔ)序列；和(c)檢測(cè)所述DNA擴(kuò)增子，其中，檢測(cè)到所述DNA擴(kuò)增子則判斷在所述DNA樣品中存在所述來(lái)自水稻事件17314 的DNA分子。
10.一種在樣品中檢測(cè)包含選自SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4的核苷酸序列的DNA分子的存在的方法，包括(a)使樣品接觸包含選自SEQID NO :3或SEQ ID NO :4及其互補(bǔ)序列的多核苷酸序列的DNA探針，其中，所述DNA探針在嚴(yán)格雜交條件下與包含選自SEQ ID NO :3或SEQ ID NO: 4的核苷酸序列的DNA分子雜交，且在該嚴(yán)格雜交條件下不與不包含選自SEQ ID NO 3或 SEQ ID NO 4的核苷酸序列的DNA分子雜交；(b)使所述樣品和所述DNA探針經(jīng)受嚴(yán)格的雜交條件；和(c)檢測(cè)所述DNA探針與包含選自SEQID NO :3或SEQ ID NO :4的核苷酸序列的所述DNA分子的雜交。
11.DNA檢測(cè)試劑盒，包含至少一個(gè)DNA分子，該DNA分子含有SEQ ID NO :6的足夠長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，作為對(duì)于檢測(cè)來(lái)自水稻事件17314的DNA 的存在特異性的DNA引物或探針，其中，檢測(cè)到所述DNA則判斷樣品中存在所述水稻事件 17314。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的DNA檢測(cè)試劑盒，其中，所述DNA分子包含SEQID NO 1或SEQ ID NO 2的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的DNA檢測(cè)試劑盒，其中，所述試劑盒采用的方法包括(a)使樣品接觸權(quán)利要求7所述的DNA分子對(duì)；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，該核酸擴(kuò)增反應(yīng)足以產(chǎn)生包含SEQID NO :1或SEQ ID NO 2 的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列的擴(kuò)增子；和(c)檢測(cè)所述擴(kuò)增子，
14.包含具有選自SEQID NO=USEQ ID NO :2及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的水稻、種子、細(xì)胞或其植物部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的水稻、種子、細(xì)胞或其植物部分，其中，所述植物、種子、細(xì)胞或植物部分耐受草甘膦除草劑處理。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的水稻、種子、細(xì)胞或其植物部分，其基因組在DNA擴(kuò)增方法中檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生用于判斷事件17314的擴(kuò)增子。
17.包含事件17314的水稻、種子、細(xì)胞或其植物部分，其中，包含事件17314的種子的代表性的樣品已經(jīng)以ATCC保藏號(hào)PTA-9844保藏。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的水稻、種子、細(xì)胞或其植物部分，其中，所述植物或其部分耐受草甘膦除草劑處理。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的水稻、種子、細(xì)胞或其植物部分，其中，所述水稻或種子是具有至少一個(gè)源自或包含事件17314的親本的雜種，包含事件17314的種子的代表性的樣品已經(jīng)以ATCC保藏號(hào)PTA-9844保藏。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的水稻、種子、細(xì)胞或其植物部分，定義為細(xì)胞、花粉、胚珠、 莢果、花、根組織、莖組織或葉組織。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的水稻、種子、細(xì)胞或其植物部分，進(jìn)一步定義為包含所述事件17314的任何一代水稻的后代植物。
22.包含選自SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的DNA分子的水稻商品。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的水稻商品，進(jìn)一步定義為選自完整的或加工的水稻種子、 動(dòng)物飼料、油、粗粉、面粉、薄片、麩皮、膨化稻米、乳液、奶酪、紙、奶油、酒、醇、生物質(zhì)和燃料產(chǎn)品的商品。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的水稻商品，其中該商品包含事件17314，包含所述事件 17314的代表性的種子已經(jīng)以ATCC保藏號(hào)PTA-9844保藏。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的水稻商品，進(jìn)一步定義為包含一種核酸，該核酸在DNA擴(kuò)增方法中檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生用于判斷事件17314的擴(kuò)增子。
26.在DNA擴(kuò)增方法中檢測(cè)時(shí)能夠產(chǎn)生用于判斷事件17314的擴(kuò)增子的水稻或其部分， 包含所述事件17314的代表性的種子已經(jīng)以ATCC保藏號(hào)PTA-9844保藏。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的水稻，其中，所述擴(kuò)增子包含SEQID NO :1或SEQ ID NO 2。
28.在DNA擴(kuò)增方法中檢測(cè)時(shí)能夠產(chǎn)生用于判斷事件17314的擴(kuò)增子的水稻種子，包含所述事件17314的代表性的種子已經(jīng)以ATCC保藏號(hào)PTA-9844保藏。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的水稻種子，其中，所述擴(kuò)增子包含SEQID NO :1或SEQ ID NO :2。
30.一種產(chǎn)生耐受草甘膦除草劑的水稻的方法，包括向所述植物的基因組引入事件 17314，包含所述事件17314的代表性的種子已經(jīng)以ATCC保藏號(hào)PTA-9844保藏。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，定義為包括以下步驟(a)雜交包含事件17314的第一水稻與缺乏事件17314的第二水稻以產(chǎn)生后代植物；和(b)選擇包含所述事件17314且耐受草甘膦的至少第一后代植物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，還包括自交所述第一后代植物以產(chǎn)生第二代后代植物，并選擇所述事件17314為純合的至少第一植物。
33.一種產(chǎn)生水稻商品的方法，包括(a)獲得權(quán)利要求17所述的水稻或其部分；和(b)由所述水稻或其部分產(chǎn)生水稻商品。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述商品選自完整的或加工的水稻種子、動(dòng)物飼料、油、粗粉、面粉、薄片、麩皮、膨化稻米、乳液、奶酪、紙、奶油、酒、醇、生物質(zhì)和燃料產(chǎn)品。
35.一種用于控制包括包含事件17314的水稻的田地中雜草生長(zhǎng)的方法，所述方法包括用有效控制雜草生長(zhǎng)的量的草甘膦處理田地，其中所述水稻顯示草甘膦耐受性。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中，所述草甘膦的有效量為每英畝約0.5磅至約4. 5磅。
37.包含選自SEQID NO =USEQ ID NO :2及其互補(bǔ)序列的DNA分子的無(wú)生命的植物材料。
38.包含具有選自SEQID NO=USEQ ID NO :2及其互補(bǔ)序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的微生物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的微生物，其中，所述微生物是植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因水稻事件17314及源自事件17314的植物、植物細(xì)胞、種子、植物部分和商品。本發(fā)明還提供對(duì)于事件17314特異性的多核苷酸及包含對(duì)于事件17314特異性的多核苷酸的植物、植物細(xì)胞、種子、植物部分和商品。本發(fā)明還提供與事件17314相關(guān)的方法。
文檔編號(hào)C07H21/04GK102448288SQ201080009417
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月30日
發(fā)明者C·S·哈梅爾, C·杜昂, 祁幼林, 許少偉, 陳云佳 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)公司