專利名稱：：轉基因水稻科豐6號的旁側序列及定性pcr檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及轉基因水稻科豐6號的旁側序列，以及轉基因水稻科豐6號的定性PCR檢測方法。
背景技術：
：水稻(Oryzasativa)是一種主要的糧食作物，也是較早成功應用轉基因技術進行遺傳改良的作物。目前已經培育出了包含不同性狀的轉基因水稻品種。我國目前尚未批準轉基因水稻的商品化生產，但有一些品種(品系)已獲準環(huán)境釋放和生產性實驗。對轉基因作物的有效監(jiān)管是安全利用轉基因作物的前提和保障。而轉基因植物外源插入片段的旁側序列是轉基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，依據外源插入片段的旁側序列是建立轉基因植物品系特異性檢測方法的重要技術資料。自2000年Zimmermarm等利用反向PCR技術破譯了轉基因玉米Btll的側翼序列、建立了Btll的品系特異性檢測技術體系以來，目前已有多個作物轉基因轉化體都建立了相應的檢測方法。在對現有專利和文獻的分析基礎上，發(fā)現已有一個關于轉基因水稻科豐6號的外源插入片段的旁側序列的專利(專利號200710063780.4)，由于在科豐6號中外源基因是多拷貝插入，而該專利涉及的僅是其中1個拷貝的旁側序列。
發(fā)明內容針對科豐6號為多拷貝插入，本發(fā)明提供了另外兩個拷貝的外源插入序列的旁側序列，并在此基礎上提供該品系外源兩個拷貝的轉化事件特異性檢測方法。本發(fā)明采用的技術方案是一種轉基因水稻科豐6號的旁側序列，所述旁側序列為載體RB側序列，所述旁側序列為SEQIDNo.1所示的序列。一種轉基因水稻科豐6號的旁側序列，所述旁側序列為載體LB側序列，所述旁側序列為SEQIDNo.2所示的序列。所述RB側旁側序列可通過HiTaiI-PCR擴增得到。HiTaiI-PCR所用特異性嵌套引物依據nos終止子(NCBI數據庫中登錄號DQ005463)的序列設計。其中位于NOS序列的11-36，序列為TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTT；N12位于29-54，序列為AGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGC；N1-3位于204-223，序列為AGCGCGCAAACTAGGATAAA所述LB側旁側序列可通過HiTaiI-PCR擴增得到。HiTai1-PCR所用特異性嵌套引物依據hyg抗性基因(NCBI數據庫中登錄號AB303069.1)的序列設計。其中Hptw位于427-404，序列為CGTACACAAATCGCCCGCAGAAGC；Hpt1-2位于398-375，序列為CCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAG；Hpt1-3位于358-338，序列為GGAAACCGACGCCCCAGCACT。本發(fā)明還涉及轉基因水稻科豐6號轉化事件特異性定性PCR檢測方法，所述方法是根據SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的序列設計特異性引物，對待測樣品DNA進行擴增，若擴增獲得目的片段(目的片段大小由引物決定)，則待測樣品為轉基因水稻科豐6號；若擴增未獲得目的片段，則待測樣品不是轉基因水稻科豐6號。通常待測樣品為單一水稻品種，按照上述方法可直接得出結論；若待測樣品為混合物，則可按照上述方法判斷混合物中是否含有轉基因水稻科豐6號。具體的，所述特異性引物如下KF6-1-F5'-CGACAAAAGATCAGGATTTGGG-3，KF6-1-R5'-GTTTGGAGTTTAAGAGCGA-3，上述引物對中一條引物為依據SEQIDNO.1中169189位設計為正向引物，另一條引物依據450468位設計為反向引物。利用該引物進行擴增，其目的片段為303bp?；蛘撸鎏禺愋砸锶缦翶F6-2-F5，-GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG-3，，KF6-2-R5，-TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG-3，上述引物對中一條引物為依據SEQIDNO.2中134157位設計為正向引物，另一條引物依據684707位設計為反向引物。利用該引物進行擴增，其目的片段為450bp。依賴于外源插入片段的旁側序列的轉基因水稻科豐6號的事件特異性定性PCR檢測方法，可依據RB側旁側序列檢測其中1個插入在6號水稻染色體位置，也可依據LB側旁側序列檢測另外一個插入拷貝。上述兩對引物可單獨用于轉基因水稻科豐6號的定性PCR檢測，也可組合同時用于轉基因水稻科豐6號的定性PCR檢測使結果更加準確。進一步，所述方法同時以特異性引物KF6-1-F和KF6-1-R或KF6-2-F和KF6-2-R分別對待測樣品DNA進行PCR擴增，如果擴增獲得303bp和450bp的目的片段，則待測樣品為轉基因水稻科豐6號；若擴增未獲得目的片段，則待測樣品不是轉基因水稻科豐6號。轉基因水稻科豐6號所用載體的T-DNA區(qū)域結構見圖1，由hpt抗性基因表達盒、CrylAc基因表達盒和CpTI基因表達盒組成。本發(fā)明采用常規(guī)方法提取植物基因組DNA，利用HiTAIL-PCR方法，分離得到RB側旁側序列507bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示通過分析發(fā)現SEQIDNO.1中1-167與雙元載體pUB_HygDNANCBI登錄號AB303069.1的3926-4092完全相同。FillerDNA為轉基因過程中修復序列與SEQIDN0.1中168189完全相同。水稻基因組DNA，位于水稻6號染色體NCBI(登錄號AP004749.1)的9568495962，與SEQIDNO.1的190507完全匹配。分離得到的LB側旁側序列607bp，其核苷酸序列如SEQN0.2所示。通過分析發(fā)現其1283與水稻第9染色體(登錄號AP009051.1)的89848701匹配。284288為FillerDNA。289-607與雙元載體pUB-HygDNANCBI登錄號AB303069.1的41358完全相同。本發(fā)明的有益效果主要體現在本發(fā)明提供了科豐6號其他兩個拷貝的旁側序列以及建立在這兩個拷貝旁側序列基礎上的轉化事件特異性檢測方法，為轉基因那水稻科豐6號的分子特征提供了重要的資料。圖1為轉基因水稻科豐6號所用載體的T-DNA區(qū)域結構圖；圖2為引物KF6-1-F和KF6-1-R擴增電泳圖；其中，Y6，Y7，Y8，Y9，YlO依次表示轉基因水稻品系科豐6號、II優(yōu)科豐6號、華恢1號、Bt63、克螟稻；YS6、YS7、YS8、YS9、YS10分別表示非轉基因對照品種明恢86、II優(yōu)明86、秈優(yōu)63、明恢63、秈優(yōu)10號；BLK提取物空白對照；water:PCR擴增試劑對照；M=IOObpDNAladder；圖3為引物KF6-2-F和KF6-2-R擴增電泳圖；其中，110分別表示轉基因大豆GTS40-3-2、轉基因玉米M0N863、BTlUBT176、M0N810、轉基因油菜GT73、轉基因棉花M0N531、轉基因水稻華恢1號、Bt63、克螟稻；1120分別為非轉基因水稻對照品種明恢86(11、12)、II優(yōu)明86(13、14)、秈優(yōu)63(15、16)、明恢63(17、18)、秈優(yōu)10號(19,20)各自重復2次；21提取物空白對照；22:PCR擴增試劑對照；23轉基因水稻科豐6號；M:100bpDNAladder。圖4引物KF6-1-F和KF6-1-R對科豐6號不同含量的混合樣品的擴增電泳圖；其中，Y6科豐6號；YS6明恢86；BLK提取物空白對照；water:PCR空白水對照；10%0.05%示含不同含量的科豐6號混合樣品；M:100bpDNAladder。圖5引物KF6-2-F和KF6-2-R對科豐6號不同含量的混合樣品的擴增電泳圖；其中，100%0.01%示含不同含量的科豐6號混合樣品；Ck-為非轉基因對照明恢86；BLK提取物空白對照；Y7為科豐6號衍生品種II優(yōu)科豐6號，YS7為II優(yōu)明86。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1轉基因水稻品系科豐6號外源插入載體的旁側序列克隆一.實驗材料1、植物材料轉基因水稻科豐6號及其受體對照品種明恢86，由福建農科院提供；2、試劑TaqDNA聚合酶、10XPCRBuffer(IOOmMTris-HClpH8.3,500mMKCl,15mMMgCl2)、dNTP購自寶生物工程大連有限公司；IOObpladderDNAMarker購自北京全式金生物技術有限公司。PCR產物純化試劑盒(Cat.NO.SKl141)和PCR產物克隆試劑盒(Cat.NO.SK2213)購自上海生工生物工程有限公司。引物合成和克隆測序由Invitrogen公司完成。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。3、實驗儀器PCR擴增儀PTC_200(Bio-Rad生產)生物型分光光度計6131(Eppendorf生產)核酸電泳儀=DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)凝膠成像儀GelDocXR(Bio-Rad生產)其他儀器包括離心機、電子天平、培養(yǎng)箱、超凈工作臺、金屬恒溫浴等。二.實驗方法和過程1、水稻基因組DNA的提取與檢測1.1.1、抽提液配制(IOOmL)在60mL水中加入6.93g葡萄糖，2g聚乙烯吡咯烷酮，IOOmgDIECA，充分溶解，然后加入lmol/LTris-HCl(ρΗ7·5)10mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)lmL，加水定容至lOOmL，高壓滅菌。使用前加入0.2%(V/V)(200μL)的β-巰基乙醇。1.1.2、裂解液配制(100ml)在60mL水中加入8.17g氯化鈉，2g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，2g聚乙烯吡咯烷酮(K30)(PVP)，IOOmgDIECA，充分溶解，然后加入lmol/LTris-HCl(pH7.5)10mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.4mL，加水定容至lOOmL，高壓滅菌后4°C。使用時加入0.2%(V/V)的β-巰基乙醇。1.1.3、提取方法取水稻葉片或稻粉約200mg在液氮中磨成粉末。加入ImL預冷至4°C的水稻DNA抽提液，顛倒混勻后，在冰上靜置5min，4°C條件下IOOOOg離心15min，棄上清液。加入600μL預熱到65°C的裂解液，充分重懸沉淀。在65°C恒溫保持60min。加入2μLRNaseA37°C保溫30min后，用等體積的苯酚氯仿異戊醇混合溶液(25241)和氯仿異戊醇(241)溶液分別抽提兩次。室溫條件下，IOOOOg離心lOmin。上清加入2/3體積異丙醇，1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液(pH5.6)。在4°C條件下，IOOOOg離心15min,用70%乙醇洗滌沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀。加入50μLTE(ρΗ8.0)溶解沉淀。1.1.4、DNA的檢測取2.0μLDNA用0.8%的瓊脂糖膠電泳檢測其完整性，并用生物型分光光度計測定DNA濃度，并將其用TE稀釋到濃度為IOOng/μL。2、旁側序列的獲得2.1旁側序列的擴增利用HiTail-PCR參照Liu等方法進行，第一、二輪反應體積25uL，第三輪反應體積50uL。反應體系為IXPCRbuffer,2.0mmol/LMgCl2,200umol/LdNTP，第一輪擴增25μL反應體系中簡并引物用LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1_4或LAD1-5等1.0μmol/L,嵌套特異引物Nh或Hptw0.3μmol/L,0.5UTaq酶，模板DNA1.0μL；第2輪擴增25μL反應體系中引物AC10.3ymol/L，Np2或HpV20.3μmol/L,0.625UTaq酶，第一輪擴增產物稀釋50倍后取LOyL作為模板；第3輪擴增50μL反應體系中引物AC1O.3μmol/L,N1^3或Ηρ、_30.3μmol/L,1.OUTaq酶，第2輪擴增產物稀釋10倍后取1.0μL作為模板。擴增產物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳并觀察成像。所用引物序列見表1，擴增程序見表2。表1:HiTAIL_PCR所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2=HiTAIL-PCR擴增程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2旁側序列的克隆和測序利用上海生工生物工程有限公司的PCR產物純化試劑盒(Cat.NO.SK1141)和PCR產物克隆試劑盒(Cat.NO.SK2213)進行PCR產物純化和克隆。至pUCm-Τ載體后由上海生工生物工程有限測序。序列比較分析運用NCBI網站的blast軟件進行。3、結果3.1依據nos終止子序列設計3個嵌套的特異引物，只有用簡并引物LAD1-4時在第2和3輪中均僅在轉基因水稻科豐6號中擴增出一條帶，對其第3輪擴增產物進行回收、克隆和測序。測序結果見SEQIDN0.1。序列分析發(fā)現T-DNA插入位置為水稻基因組中第6號染色體，T-DNA斷裂位置在RB序列(tgacaggatatattggcgggtaaa)內側第4個堿基處，在T-DNA序列與水稻基因組序列之間多出22bp的序列。3.2依據hpt基因設計3個嵌套特異引物，只有用簡并引物LAD1-4時在第2和3輪中均擴增出一條帶，對其第3輪擴增產物進行回收、克隆和測序。測序結果SEQIDN0.2。序列分析發(fā)現T-DNA插入位置為水稻基因組中第9號染色體，T-DNA斷裂位置在LB序列(tggcaggatatattgtggtgtaaaca)內側第14個堿基處，在T-DNA序列與水稻基因組序列之間多出5bp的序列。實施例2基于轉基因水稻品系科豐6號兩個外源插入旁側序列的品系特異性定性PCR檢測一、實驗材料轉基因水稻品系科豐6號，及其衍生品種II優(yōu)科豐6號，由福建農科院提供；其他轉基因水稻華恢1號和Bt63由華中農業(yè)大學提供、克螟稻由浙江大學提供；非轉基因水稻對照明恢86和II優(yōu)明86由福建農科院提供，秈優(yōu)63由華中農業(yè)大學提供，秈優(yōu)10號由浙江大學提供。實驗所用酶和試劑等同實施例1。二、實驗過程和方法1、DNA的提取和檢測同實施例1。2、基于兩個不同插入位點的特異性檢測根據實施例1中測定的兩個序列，分別在水稻基因組部分和載體部分設計兩對PCR引物，引物序列見表4。表4科豐6號兩個不同插入位點的特異性檢測用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR反應體系為IXPCRbuffer、200umol/LdNTP、0.2umol/L特異引物、0.025U/uLTaq酶。反應程序為95°C，5min；94°C30s、59°C45s、72°C45s35個循環(huán)；72°C延伸3min。利用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行產物分析。3、結果引物KF6-1-F和KF6-1-R僅在科豐6號及其衍生品種II優(yōu)科豐6號中得到303bp擴增產物，而在其他轉基因水稻品系和對照品種中均未得到擴增，見圖2。引物KF6-2-F和KF6-2-R在轉基因水稻科豐6號中得到450bp的擴增帶，而在其對照非轉基因水稻品種和其他轉基因植物(包括大豆、玉米)中均未得到擴增(圖3)。實施例3品系特異性檢測的靈敏性檢測一、實驗材料轉基因水稻品系科豐6號和對照受體品種明恢86。實驗所用酶和試劑等同實施例1。二、實驗過程和方法1、DNA的提取和檢測，將科豐6號及其非轉基因對照受體明恢86的種子磨成粉后，制備系列混合樣品，各樣品所含科豐6號依次為10%、5.0%,2.5%U.25%,0.5%,0.1%,0.05%和0.01%(ff/ff)，混勻后提取DNA方法同實施例1。2、基于兩個不同插入位點的靈敏性檢測所用引物見表4，PCR反應體系為IXPCRbuffer、200umol/LdNTP、0.2umol/L特異引物、0.025U/uLTaq酶。反應程序為95°C，5min；940C30s,590C45s,72°C45s35個循環(huán)；72°C延伸3min。利用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行產物分析。3、結果引物KF6-1-F、KF6-1-R和KF6_2_F、KF6-2-R能夠在轉基因水稻科豐6號含量為0.10.05%的混合樣品中擴增到預期大小的目標產物(見圖4、5)。權利要求一種轉基因水稻科豐6號的旁側序列，所述旁側序列為載體RB側序列，其特征在于所述旁側序列為SEQIDNo.1所示的序列。2.—種轉基因水稻科豐6號的旁側序列，所述旁側序列為載體LB側序列，其特征在于所述旁側序列為SEQIDNo.2所示的序列。3.轉基因水稻科豐6號的旁側序列的定性PCR檢測方法，所述方法是根據SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的序列設計特異性引物，對待測樣品DNA進行擴增，若擴增獲得目的片段，則待測樣品為轉基因水稻科豐6號；若擴增未獲得目的片段，則待測樣品不是轉基因水稻科豐6號。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述特異性引物如下KF6-1-F:5’-CGACAAAAGATCAGGATTTGGG-3’KF6-1-R:5’-GTTTGGAGTTTAAGAGCGA-3’目的片段為303bp。5.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述特異性引物如下KF6-2-F:5’-GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG-3’，KF6-2-R:5’-TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG-3‘目的片段為450bp。6.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同時以特異性引物KF6-1-F和KF6-1-R、或KF6-2-F和KF6-2-R對待測樣品DNA進行PCR擴增，如果擴增獲得303bp和450bp的目的片段，則待測樣品為轉基因水稻科豐6號；若擴增未獲得目的片段，則待測樣品不是轉基因水稻科豐6號。全文摘要本發(fā)明提供了轉基因水稻科豐6號的旁側序列，所述旁側序列包括載體RB側旁側序列和載體LB側序列，所述RB側旁側序列為SEQIDNo.1所示的序列，所述LB側旁側序列為SEQIDNo.2所示的序列。本發(fā)明提供了科豐6號其他兩個拷貝的旁側序列以及建立在這兩個拷貝旁側序列基礎上的轉化事件特異性檢測方法，為轉基因水稻科豐6號的分子特征提供了重要的資料。文檔編號C12N15/11GK101824411SQ201010158858公開日2010年9月8日申請日期2010年4月29日優(yōu)先權日2010年4月29日發(fā)明者王渭霞申請人:中國水稻研究所