專利名稱：：一種抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻多重pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種可同時檢測3~4種抗蟲外源基因的轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測試劑盒及檢測方法。(二)
背景技術：
：水稻是最重要的糧食作物之一。自第一批水稻轉(zhuǎn)基因植抹在1988年問世以來，中國、日本、泰國、德國、菲律賓、瑞士、英國、美國、加拿大等國家在水稻轉(zhuǎn)基因研究領域取得了一系列成果,許多轉(zhuǎn)基因水稻品種已進入田間實驗，并不斷向?qū)嵱没较虬l(fā)展。我國轉(zhuǎn)基因技術發(fā)展很快，其中，水稻轉(zhuǎn)基因技術是我國少數(shù)幾個具有國際竟爭力的轉(zhuǎn)基因技術之一，且倍受關注，已有多份轉(zhuǎn)基因水稻材料獲準環(huán)境釋放，其中4份抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻和l份抗病轉(zhuǎn)基因水稻已開始申請安全證書。然而，近年來我國相繼涌現(xiàn)的"湖北轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻非法種植"、"亨氏嬰兒營養(yǎng)米粉混入轉(zhuǎn)基因成分"等事件，給我國轉(zhuǎn)基因水稻的安全監(jiān)管提出了十分迫切的要求。為此，開展我國自主開發(fā)的主要轉(zhuǎn)基因水稻的檢測方法將對我國轉(zhuǎn)基因水稻安全監(jiān)管具有重要意義。聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)是利用一對與目標序列互補的引物，在DNA聚合酶的作用下達到擴增目標耙序列的技術，可用于基因檢測。國內(nèi)外已有多篇關于利用PCR方法對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行定性檢測的文獻報道，但大都是針對一個外源基因進行擴增，即采用單一的一對寡核苷酸引物擴增一個目標耙序列，這一方法通常只針對某種轉(zhuǎn)基因或其產(chǎn)物，只能滿足一種或少數(shù)幾個轉(zhuǎn)基因品種的檢測需要，檢測方法繁瑣，工作程序重復且耗費大量時間，不適合大批量樣品的檢測，已不能滿足當前工作中快速通關的要求。多重PCR(MultiplexPolymeraseChainReaction,MPCR)也稱復合PCR,是一種特殊的PCR技術，比單一PCR反應更快捷、更經(jīng)濟，只需1次PCR反應，就能同時檢測多個靶標基因。這種方法具有更大的可靠性和適應性，并且能降低檢測成本。目前這項技術在動物病毒性傳染病和人類疾病^r測中應用較多。邵碧英(2002)等應用多重PCR研究了轉(zhuǎn)基因花卉中幾種轉(zhuǎn)基因成分(外源花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子、胭脂堿合成酶Nos終止子，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NptII)的檢測；王媛(2004)、徐景升(2005)、張平平(2007)等采用復合PCR對轉(zhuǎn)基因大豆中轉(zhuǎn)基因成分(CaMV35S啟動子、Nos終止子，抗草甘膦的EPSPS基因)進行了研究；吳影等(2006)也對轉(zhuǎn)基因大豆(CaMV35S啟動子、Nos終止子，凝集素lectin基因)進行了檢測。應用多重PCR檢測轉(zhuǎn)基因的也有報道,但是都有缺點。吳影等(2006)研究了轉(zhuǎn)基因水稻中CaMV35S、NPTII和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Hpt的三重PCR分析方法。該報道中只檢測了外源啟動子和篩選標記基因，忽略了對目標基因的檢測。隨著轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展，目前已獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因水稻都已剔除了篩選標記基因。因此，該技術從轉(zhuǎn)基因水稻4企測的實用角度來看等同于單引物CaMV35s的擴增。李偉豐(2007)等應用多重PCR技術建立了才全測水稻種子中CaMV35S啟動子、NoS終止子、Hpt、Bt毒蛋白基因CrylAb和GUS等外源基因成分的方法。該方法中不同引物所用濃度不同，跨度從0.21.5uM，PCR結(jié)果利用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染技術來分析結(jié)果，實際操作繁瑣且只能檢測Bt毒蛋白基因中CrylAb這一種外源抗蟲基因。針對目前轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)的進展，多種Bt基因以及其他抗蟲基因已經(jīng)應用到了水稻轉(zhuǎn)基因研究中，結(jié)合我國轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)和市場化發(fā)展的趨勢，開發(fā)一種能同時檢測轉(zhuǎn)基因水稻中普遍存在的CaMV35S啟動子、Nos終止子、Hpt、Bt毒蛋白基因(CrylAb，Cry1Ac或兩者的融合基因)以及缸豆胰蛋白酶抑制劑基因Cpti等外源基因成分的方法就顯得非常有必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種準確、快速、簡便、省時省力的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻4全測方法。本發(fā)明采用的技術方案是一種轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測試劑盒，主要包括下列引物序列CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT。進一步，所述試劑盒為四重PCR試劑盒，引物序列如下CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV誦R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;Hpt-F:TAGGAGGGCGTGGATATGTC;Hpt-R:TACACAGCCATCGGTCCAGA?；蛘?，引物序列為CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV畫R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;Cpti-F:AAAATGAAGAGCACCATCTTC;Cpti-R:TCTAGAGTTCATCTTTCTCATCATC。本發(fā)明通過選用Bt毒蛋白基因的通用引物和Cpti基因引物擴大了檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻中外源目的基因的范圍，一次PCR反應即可檢測Cry1Ab、Cry1Ac及其融合基因和Cpti基因等4種目的基因和轉(zhuǎn)基因水稻常用的CaMV35s啟動子和Nos終止子。同時本發(fā)明選用引物是在各引物濃度為0.2uM的等摩爾條件下進行擴增，擴增產(chǎn)物通過一次普通的瓊脂糖凝膠電泳即可有效的分開，方法簡單易行。本發(fā)明所建立的方法只通過一次PGR反應就能同時檢測目前抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻中普遍存在的CaMV35S啟動子、Nos終止子，Hpt基因、Bt毒蛋白基因(CrylAb,CrylAc或兩者的融合基因)或Cpti基因等外源基因成分，基本包括了國內(nèi)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻所有的外源轉(zhuǎn)基因成分，且靈敏度達到0.1%的水平，優(yōu)越性非常明顯。本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測方法，包括(1)選取引物序列主要包括CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt畫F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt畫R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;(2)提取待4企測水稻DNA,以待測水稻DNA為模板，在包括步驟(1)所述引物序列的PCR反應體系中進行PCR反應；所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度為1.5x或2xdNTPs0.2mM引物序列各0.2pM模板DNAl.OuLTaqDNA聚合酶0.02U/uL溶劑為ddH20;PCR反應條件為94°C5min;94°C30s，退火溫度58°C30s,72°C30s，35個循環(huán)；72°C3min;(3)取PCR反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果是否出現(xiàn)特異性條帶，判斷待測水稻是否含有相應外源基因。PCRBuffer終濃度為1x，是指反應體系中PCRBuffer各組分含量與1xPCRBuffer中各組分濃度相同，PCRBuffer終濃度為2x,則是指反應體系中PCRBuffer各組分濃度為1xPCRBuffer中各組分濃度的2倍，以此類推；實際應用時，可取一定體積的10xPCRBuffer,4要照各組分在反應體系中的濃度進行稀釋，比如要求PCRBuffer終濃度為2x,則取反應體系總體積的1/5體積的10xPCRBuffer即可。10xPCRBuffer成分為lOOmMTris-HClpH8.3,500mMKC1,15mMMgCl2。所述PCR為四重PCR時，所述方法如下(1)選取引物序列如下CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;Hpt-F:TAGGAGGGCGTGGATATGTC;Hpt-R:TACACAGCCATCGGTCCAGA;(2)提取待檢測水稻DNA,以待測水稻DNA為模板，在包括步驟(1)所述引物序列的PCR反應體系中進行PCR反應；所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度為1.5xdNTPs0.2mM引物序列各0.2pM模板DNAl.OuLTaqDNA聚合酶0.02U/uL溶劑為ddH20;PCR反應條件為94°C5min;94°C30s，退火溫度60°C30s,72°C30s,35個循環(huán)；72°C3min;(3)取PCR反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果是否出現(xiàn)特異性條帶，判斷待測水稻是否含有相應外源基因?；蛘撸龇椒ㄈ缦耡)選取引物序列如下CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos畫R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt畫F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;Cpti-F:AAAATGAAGAGCACCATCTTC;Cpti-R:TCTAGAGTTCATCTTTCTCATCATC;b)提取待檢測水稻DNA，以待測水稻DNA為模板，在包括步驟(l)所述引物序列的PCR反應體系中進行PCR反應；所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度為2xdNTPs0.2mM引物序列各0.2pM模板DNA8.0ng/uLTaqDNA聚合酶0.02U/uL溶劑為去離子1120;PCR反應條件為94°C5min;94°C30s，退火溫度60°C30s,72°C30s，35個循環(huán)；72°C3min;c)取PCR反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果是否出現(xiàn)特異性條帶，判斷待測水稻是否含有相應外源基因。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻定性PCR檢測中常規(guī)PCR選用的PCR反應體系通常為1xPCR緩沖液、0.2mMdNTPs、0.5uM單引物、0.luLTaqDNA聚合酶(5U/uL)，PCR反應條件94°C5min;94°C30s，退火溫度55。C30s,72°C30s，35個循環(huán)；72°C3min。本發(fā)明在此基礎上通過選用不同引物的組合、不同PCR緩沖液的濃度和引物濃度來建立和優(yōu)化檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的多重PCR技術體系。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中所用引物擴增的目標片段都是小于500bp的短片段，因為從加工后的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品提取的DNA大部分是已經(jīng)降解的片段。在多重PCR反應中，短片段擴增產(chǎn)物的引物在高鹽濃度下擴增結(jié)果更好，高鹽濃度會使長片段擴增產(chǎn)物難于變性解鏈，難以得到有效的擴增。本發(fā)明三重PCR檢測CaMV35s、Nos和Bt和四重PCIU全觀'JCaMV35s、Nos、Bt和Cpti時使用PCR緩沖液濃度為2.0x,引物濃度0.2Um,退火溫度60°C即可以保證各引物的有效擴增，又減少了引物二聚體的干擾和非特異帶的產(chǎn)生。四重PCR檢測CaMV35s、Nos、Bt和hpt時選擇緩沖液濃度為1.5x,引物濃度0.2uM,退火溫度60。C即可以保證hpt和其他引物的有效擴增，又減少了引物二聚體的產(chǎn)生。本發(fā)明所檢測的水稻幾種外源基因是我國當前進入安全性生產(chǎn)階段的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻常用的成分，因此本發(fā)明具有實用性；其次，本發(fā)明的方法可以縮短檢測時間，單個樣品從樣品制備到結(jié)果檢出只需1天時間；本發(fā)明檢測所用方法為常規(guī)定性PCR和普通瓊脂糖凝膠電泳檢測，只需目前常規(guī)的分子生物學試劑，成本低；另外本發(fā)明檢測靈敏度高，能達到國家標準制定的0.1%水平，同時相比于單引物PCR檢測，本發(fā)明準確率高，假陽性比率低。通過不同的PCR儀對比檢測以及不同的檢測人員操作比對均能得到穩(wěn)定的檢測結(jié)果。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在僅一次PCR可快速、準確檢測當前國內(nèi)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻，靈敏度可達0.1%,且成本低、準確率高，假陽性率低。(四)圖1為不同PCR緩沖液濃度和引物濃度下一次三重PCR擴增結(jié)果對比；圖2為不同PCR緩沖液濃度下一次四重PCR擴增結(jié)果對比；圖3為一次四重PCR反應檢測轉(zhuǎn)基因水稻的4個外源基因(CaMV35s,Nos,Bt，Cpti);圖4為不同模板濃度的多重PCR檢測結(jié)果；圖5為不同轉(zhuǎn)基因成分含量的多重PCR檢測結(jié)果；圖6為不同的抗蟲基因的多重PCR檢測結(jié)果。(五)具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1:1、PCR引物的合成根據(jù)農(nóng)業(yè)部953號公告-6-2007提供的CaMV35s、Bt引物序列、國標GB/T19495.4-2004提供的Nos引物序列，何龍飛等(2007)提供的Cpti51物序列和NCBI數(shù)據(jù)庫上登錄的潮霉素抗性Hpt基因122966位區(qū)域的序列設計引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息見表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、樣品DNA的小量提取水稻種子DNA的提取依據(jù)國家農(nóng)業(yè)部953號公告-6-2007，具體為抽才是液6.93%葡萄糖，2.0%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)，0.1%DIECA(diethyldithiocarbamicacid)0.1mol/LTris-HCl(pH7.5)5mmol/LEDTA(pH8.0),使用時加入0.2%(V/V)的|3-巰基乙醇。裂解液1.4M氯化鈉，2.0%十六烷基三曱基溴化銨(CTAB),2.0%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30),0.1%gDIECA,0.1mol/LTris-HCl(pH7.5),lmmol/LEDTA(pH8.0)使用時加入0.2%(V/V)的P-巰基乙醇。將福建農(nóng)科院研發(fā)的轉(zhuǎn)基因水稻II優(yōu)科豐6號及其受體II優(yōu)明86的稻谷分別磨成粉末，在1.5mL離心管中分別稱取200mg(其中轉(zhuǎn)基因水稻稱取2份作為平行樣，陰性對照稱取l份)加入1mL預冷至4。C的抽提液，劇烈搖動混勻后，在冰上靜置5min，4。C條件下10000g離心15min,棄上清液。加入600iaL預熱到65。C的裂解液，充分重懸沉淀，在65。C恒溫保持40min,期間顛倒混勻5次。室溫條件下，10000g離心10min,取上清液轉(zhuǎn)至另一新離心管中。分別用等體積苯酚氯仿異戊醇溶液和氯仿異戊醇溶液各抽提一次。室溫條件下，10000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)至另一新離心管中。加入2/3體積異丙醇，1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液(pH5.6),在4。C條件下，10000g離心15min,棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀。加入50pLTE(pH8.0)溶解沉淀，加入2.0juLRNaseA,37°C恒溫保持30min。所得溶液即為才羊品DNA;容液。將DNA溶液適當稀釋后測定并記錄其在260nm和280nm的紫外光吸收率，根據(jù)OD260值計算DNA濃度。3、多重PCR擴增3.1三重PCR:將所提DNA稀釋為濃度200ng/uL,PCR反應體系組成為PCR緩沖液終濃度為0.4x、0.8x、1x、1.5x、2.0x或2.5x,0.2mMdNTPs,引物Camv35s、nos、bt各0.2uM或0.4uM,模板DNA1.0uL,O.luLTaqDNA聚合酶(5U/uL)，補充ddH20至體積調(diào)整為25ul。PCR反應條件94。C5min;94。C30s,退火溫度58°C30s，72°C30s,35個循環(huán)；72°C3min。結(jié)果見附圖1。圖1為不同PCR緩沖液濃度和引物濃度下一次三重PCR擴增結(jié)果對比；可檢測轉(zhuǎn)基因水稻的3個外源基因(Camv35s，nos,bt),泳道1為陰性對照，2、3為在PTC-100型PCR儀上2次重復所提轉(zhuǎn)基因水稻樣品DNA;4和5為在PTC-200型PCR儀上2次重復所4是轉(zhuǎn)基因水稻樣品DNA;其中a和b中引物濃度為0.2uM;c中引物濃度為0.4uM。3.2四重PCR:3.2.1將所提DNA稀釋為濃度200ng/uL，PCR反應體系為PCR緩沖液終濃度為1.0x、1.5x或2.0x,0.2mMdNTPs,引物Camv35s、Nos、Bt、Hpt引物各0.2uM,模板DNA1.0uL,O.luLTaqDNA聚合酶(5U/uL),補充ddH20至體積調(diào)整為25ul。PCR反應條件94°C5min;94°C30s,退火溫度55。C或60°C30s,72°C30s，35個循環(huán)；72°C3min。結(jié)果見附圖2。圖2為不同PCR緩沖液濃度下一次四重PCR擴增結(jié)果對比；可檢測轉(zhuǎn)基因水稻的4個外源基因(Camv35s,nos,bt，hpt),其中圖a中泳道1，2為水稻II優(yōu)科豐6號2次DNA在PCR儀型號為PTC-100上的擴增結(jié)果，泳道3，4為水稻II優(yōu)科豐6號2次DNA在PCR儀型號為PTC-200上的擴增結(jié)果；泳道5為陰性對照II優(yōu)明86;M為lOObp的DNAladder;圖b中泳道1為陰性對照II優(yōu)明86，泳道2，3為水稻II優(yōu)科豐6號2次DNA在PCR儀型號為PTC-100上的擴增結(jié)果，泳道4,5為水稻II優(yōu)科豐6號2次DNA在PCR儀型號為PTC-200上的擴增結(jié)果；泳道；M為lOObp的DNAladder;圖c中泳道1,2為水稻II優(yōu)科豐6號2次DNA在PCR儀型號為PTC-100上的擴增結(jié)果，泳道3,4為水稻II優(yōu)科豐6號2次DNA在PCR儀型號為PTC-200上的擴增結(jié)果；泳道5為陰性對照II優(yōu)明86;M為lOObp的DNAladder。3.2.2將所提DNA稀釋為濃度200ng/uL，PCR反應體系為PCR緩沖液終濃度為2x,0.2mMdNTPs,其中Camv35s,nos,bt，cpti引物各0.2uM引物，模板DNAl.OuL,O.luLTaqDNA聚合酶(5U/uL),補充ddH20至體積調(diào)整為25ul。PCR反應條件94°C5min;94°C30s,退火溫度55。C或60。C30s,72°C30s，35個循環(huán)；72°C3min。退火溫度為60。C時，結(jié)果見附圖3，其中泳道l、2為在PTC-100上2次重復所-提轉(zhuǎn)基因水稻樣品DNA;3、4為在PTC-200上2次重復所提轉(zhuǎn)基因水稻樣品DNA;泳道5為另一試驗者檢測陽性轉(zhuǎn)基因水稻的結(jié)果。以上實驗在不同型號PCR儀上由不同的操作人員重復進行2次。4、；險測結(jié)果判定PCR產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠，染色劑溴化已錠濃度為0.5ug/mL,取PCR擴增產(chǎn)物7.0uL,在4V/cm條件下電泳lh,用GelDoc凝膠成像系統(tǒng)進行結(jié)果分析。檢測結(jié)果見附圖。由附圖可見，本發(fā)明中擴增845bp的Hpt基因引物在2.0xPCRbuffer濃度下，未能檢測到擴增帶。短片段118bp的n、os引物擴增產(chǎn)物在1.52.0xPCRbuffer濃度下擴增效率穩(wěn)定。在2.0xbuffer濃度下camv35s引物在500bp的一條非特異條帶消失。在0.4xBuffer濃度時3引物沒有任何擴增，在0.8倍的濃度下Bt引物沒有得到擴增。三種引物濃度在0.2和0.5uM時，未見明顯的擴增效率的差異，只是在0.5uM時引物二聚體明顯，干擾了短片段擴增產(chǎn)物的分析。實施例2:利用多重PCR技術檢測不同模板濃度的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻1、按照實施例1方法所述合成引物和提取轉(zhuǎn)基因水稻II優(yōu)科豐6號及其受體II優(yōu)明86的DNA,測定DNA濃度為400ng/uL;2、用TE緩沖液將所提樣品DNA按比例稀釋為200、100、50、25ng/uL;3、按實施例1步驟3.1進行3重PCR反應，PCR緩沖液濃度為2.0x,引物濃度0.2uM;4、按步驟4進行電泳和分析，電泳結(jié)果見圖4。注泳道15分別為模板DNA濃度400,200,100,50,25ng/uL;泳道6為陰性對照。結(jié)論由圖片4得出三重PCR可以檢測到的最低模板濃度為lng/uL。實施例3:利用多重PCR技術檢測不同轉(zhuǎn)基因成分含量1、按照實施例1方法所述合成引物和分別提取轉(zhuǎn)基因含量為1.0%和0.1%的轉(zhuǎn)基因水稻II優(yōu)科豐6號及其受體II優(yōu)明86的DNA，測定DNA濃度并用TE緩沖液將所提樣品DNA稀釋為200ng/uL。2、按實施例1步驟3.1進行3重PCR反應，PCR緩沖液濃度為2.0x,引物濃度0.2uM,模板DNA分別加入2.0uL和5.0uL;3、按步驟4進行電泳和分析，結(jié)果見圖5。注泳道12為轉(zhuǎn)基因水稻含量1.0%的樣品，模板加入量2.0uL;泳道13為轉(zhuǎn)基因水稻含量為0.1%的樣品，模板加入量2.0uL;泳道14為轉(zhuǎn)基因水稻含量1.0%的樣品，模板加入量5.0uL;泳道15為轉(zhuǎn)基因水稻含量為0.1%的樣品，模板加入量5.0uL。結(jié)論由圖5得出三重PCR能夠檢測到轉(zhuǎn)基因水稻含量為0.1%的混合樣口口o實施例4:利用多重PCR技術檢測不同的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻1、按照實施例1方法所述合成引物和分別提取轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號及其受體明恢63,轉(zhuǎn)基因水稻東龍及其受體秈優(yōu)IO號，測定DNA濃度并用TE緩沖液將所提樣品DNA稀釋為200ng/uL。2、按實施例1步驟3.1進行3重PCR反應，PCR緩沖液濃度為2.0x,引物濃度0.2uM;3、按步驟4進行電泳和分析，結(jié)果見圖6。圖6,泳道l為轉(zhuǎn)基因水稻華恢l號；泳道2為明恢63;泳道3為轉(zhuǎn)基因水稻東龍；泳道4為秈優(yōu)IO號；泳道5為提取空白對照；M為100bpDNALaddero結(jié)論由圖6得出三重PCR能夠檢測不同的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(含終止子Nos和目的基因CrylAc和CrylAb融合基因)和東龍(含啟動子Camv35s,終止子Nos，目的基因CrylAb)。序列表—ST25SEQUENCELISTING<110〉中國水稻研究所<120>—種抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測試劑盒及檢測方法<130〉〈160〉10<170>Patentlnversion3.4<210>1〈211〉19<212>腿<213>Unk麗n〈220〉<223〉人工序列<■>1gctcctacaaatgccatca19<210><211>〈212〉<213〉220DNAUnknown<220><223>人工序列<400>2gatagtgggattgtgcgtca20〈210>3<211>23<212>腿<213〉Unknown<220><223〉人工序列<400>3catgacgttatttatgagatggg23<210>4<211>24〈212>腿〈213>Unknown<220><223>人工序列<400〉4gacaccgcgcgcgataatttatcc24<210〉5<211〉21<212〉腿<213>Unknown<220〉<223〉人工序列簡〉5gaaggtttgagcaatctctac21〈210〉6<211>21<212>DNA<213〉Unknown<220><223>人工序列<400>6cgatcagcctagtaaggtcgt21<210>7<211>21<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>7aaaatgaagagcaccatcttc21>8>25>DNA〉Unknown<220><223>人工序列<400〉8tctagagttcatctttctcatcatc25<210〉9<211>20<212〉腿<213〉Unk麗n<220〉<223>人工序列<400>9taggagggcgtggatatgtc20<210〉10<211>20<212>DNA<213〉Unknown〈220><223〉人工序列<400>10tacacagccatcggtccaga20o1232222<<<<權利要求1.一種抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測試劑盒，主要包括下列引物序列CaMV-FGCTCCTACAAATGCCATCA；CaMV-RGATAGTGGGATTGTGCGTCA；Nos-FCATGACGTTATTTATGAGATGGG；Nos-RGACACCGCGCGCGATAATTTATCC；Bt-FGAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；Bt-RCGATCAGCCTAGTAAGGTCGT。2.如權利要求1所述的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒中引物序列如下CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;Hpt-F:TAGGAGGGCGTGGATATGTC;Hpt-R:TACACAGCCATCGGTCCAGA。3.如權利要求1所述的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒中引物序列如下CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;200810063226.0權利要求書第2/5頁Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;Cpti-F:AAAATGAAGAGCACCATCTTC;Cpti-R:TCTAGAGTTCATCTTTCTCATCATC。4.一種抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測方法，包括(1)選取引物序列主要包括CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;(2)提取待檢測水稻DNA,以待測水稻DNA為模板，在包括步驟(1)所述引物序列的PCR反應體系中進行PCR反應；所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度為1.5x或2xdNTPs引物序列模板DNATaqDNA聚合酶溶劑為ddH20;0.2mM各0.2fiM2.0~10.0ng/uL0.02U/uLPCR反應條件為94°C5min;94°C30s，退火溫度58°C30s,72°C30s,35個循環(huán)；72°C3min;(3)取PCR反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)電泳結(jié)果是否出現(xiàn)特異性條帶，判斷待測水稻是否含有相應外源基因。5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)選取引物序列如下CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;Hpt-F:TAGGAGGGCGTGGATATGTC;Hpt誦R:TACACAGCCATCGGTCCAGA;(2)提取待檢測水稻DNA,以待測水稻DNA為模板，在包括步驟(1)所述引物序列的PCR反應體系中進行PCR反應；所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度為1.5xdNTPs0.2mM引物序列各0.2mM模板DNA2.010.0ng/uLTaqDNA聚合酶0.02U/uL溶劑為ddH20;PCR反應條件為94°C5min;94°C30s,退火溫度60°C30s,72°C30s,35個循環(huán)；72°C3min;(3)取PCR反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)電泳結(jié)果是否出現(xiàn)特異性條帶，判斷待測水稻是否含有相應外源基因。6.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)選取引物序列如下CaMV-F:GCTCCTACAAATGCCATCA;CaMV-R:GATAGTGGGATTGTGCGTCA;Nos-F:CATGACGTTATTTATGAGATGGG;Nos-R:GACACCGCGCGCGATAATTTATCC;Bt-F:GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC;Bt-R:CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT;Cpti-F:AAAATGAAGAGCACCATCTTC;Cpti-R:TCTAGAGTTCATCTTTCTCATCATC;(2)提取待檢測水稻DNA,以待測水稻DNA為模板，在包括步驟(1)所述引物序列的PCR反應體系中進行PCR反應；所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度為2xdNTPs0.2mM引物序列各0.2uM模板DNA2.010.0ng/uLTaqDNA聚合酶0.02U/uL溶劑為ddH20;PCR反應條件為94℃5min;94℃30s,退火溫度60℃30s,72℃30s，35個循環(huán)；72℃3min;(3)取PCR反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果是否出現(xiàn)特異性條帶，判斷待測水稻是否含有相應外源基因。全文摘要本發(fā)明提供了一種抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測試劑盒及檢測方法。所述轉(zhuǎn)基因水稻多重PCR檢測試劑盒主要包括下列引物序列CaMV-FGCTCCTACAAATGCCATCA；CaMV-RGATAGTGGGATTGTGCGTCA；Nos-FCATGACGTTATTTATGAGATGGG；Nos-RGACACCGCGCGCGATAATTTATCC；Bt-FGAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；Bt-RCGATCAGCCTAGTAAGGTCGT。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在僅一次PCR可快速、準確檢測當前國內(nèi)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻，靈敏度可達0.1％，且成本低、準確率高，假陽性率低。文檔編號C12Q1/68GK101343666SQ20081006322公開日2009年1月14日申請日期2008年7月23日優(yōu)先權日2008年7月23日發(fā)明者強傅,王渭霞,賴鳳香申請人:中國水稻研究所