鋅指蛋白33b基因作為牛超數(shù)排卵性狀分子標(biāo)記的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了鋅指蛋白33B基因作為牛超數(shù)排卵性狀分子標(biāo)記的應(yīng)用，具體涉及 牛鋅指蛋白33B基因片段的克隆及其在牛超數(shù)排卵性狀標(biāo)記輔助選擇中用途，屬于動物基 因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鋅指蛋白家族是含有通過結(jié)合Zn2+穩(wěn)定的、短的、可以自我折疊形成"手指"結(jié) 構(gòu)的一類蛋白質(zhì)。由于其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以選擇性的結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，使鋅指 蛋白在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過程中發(fā)揮重要作用（Klug A等，Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 52: 473 - 482)。Elena Labarta等（Elena Labarta 等，Hormonal and molecular characterization of follicular fluid, cumulus cells and oocytes from pre-ovulatory follicles in stimulated and unstimulated cycles. Hum R印rod. 2012 (6): 1596-1605)報道，鋅指蛋白338(2似^游）作為鋅指蛋白家族成員 之一，在超數(shù)排卵后的人類顆粒細(xì)胞中顯著的下調(diào)表達(dá)，表明其在卵母細(xì)胞成熟過程中具 有潛在作用，而卵母細(xì)胞成熟則直接關(guān)系到超數(shù)排卵的實(shí)際效果。因此，蓮因可以 被選定為影響超數(shù)排卵性狀的候選基因，其單核苷酸遺傳多態(tài)性可作為動物繁殖和生產(chǎn)性 能輔助選擇的分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供了鋅指蛋白33B基因作為牛超數(shù)排卵性狀分子標(biāo)記的應(yīng) 用，為牛標(biāo)記輔助育種提供一種有意義的分子標(biāo)記。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下： 本發(fā)明所述的鋅指蛋白33B基因作為牛超數(shù)排卵性狀分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于： 該分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1 ;在序列表SEQ ID NO: 1第403位存 在G-T的堿基突變，該突變導(dǎo)致/^A4/-RFLP多態(tài)性的產(chǎn)生。
[0005] 擴(kuò)增本發(fā)明所述分子標(biāo)記的引物一對，其DNA序列如下所示： ZNF33B-F: 5' - GGAAGTTAAACAGCCTAGT -3' （正向引物） ZNF33B-R: 5' - GGTTCTGTTCTTGATTTGC -3' （反向引物） 本發(fā)明提供的鋅指蛋白33B基因作為牛超數(shù)排卵性狀分子標(biāo)記的方法，包括以下步 驟： 通過設(shè)計(jì)特異性引物一對，正向引物ZNF33B-F: 5' - GGAAGTTAAACAGCCTAGT -3'和反 向引物ZNF33B-R: 5'- GGirCTGTTCTTGAITTGC -3'，從牛血液中提取基因組DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得因片段的DNA序列，如表SEQ ID NO: 1 ;利用限制性內(nèi)切酶/檢測 PCR產(chǎn)物片段的DNA序列第403位的G-T堿基突變，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切產(chǎn)生三種基 因型，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可明顯判別不同帶型，將檢測結(jié)果所示的不同基因型與牛超數(shù) 排卵性狀關(guān)聯(lián)分析，具備特定的基因型的個體將獲得更好超數(shù)排卵效果。
[0006] 本發(fā)明對牛因部分DNA序列的克隆：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電 泳檢測結(jié)果顯示為特異性PCR產(chǎn)物，如圖1所示。將PCR產(chǎn)物回收測序，結(jié)果顯示產(chǎn)物長度 為620bp。測序結(jié)果顯示該片段403bp處存在T、G兩個等位基因，部分測序峰如圖3所示。
[0007] 針對牛因部分DNA片段PCR-RFLP診斷方法的建立：用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特 異性引物擴(kuò)增?；蚪MDNA得到的620bp特異擴(kuò)增片段。測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該403bp片段 存在的突變會導(dǎo)致酶切位點(diǎn)（GACNN'NNGTC)，其中第399bp-400bp處為酶切位點(diǎn)。擴(kuò) 增產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切可產(chǎn)生三種基因型，即TT型、TG型和GG型，具體如圖 2所示。
[0008] 對標(biāo)記性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析：本發(fā)明中牛因的擴(kuò)增序列作加/多態(tài)位點(diǎn)與 牛超數(shù)排卵性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，此酶切位點(diǎn)不同基因型所對應(yīng)的個體的部分超數(shù)排 卵性狀存在顯著或極顯著的差異。
[0009] 本發(fā)明的積極效果在于：公開了鋅指蛋白33B基因作為牛超數(shù)排卵性狀分子標(biāo)記 的應(yīng)用，該分子標(biāo)記的核苷酸序列第403位存在G-T的堿基突變，該突變導(dǎo)致/^A4/-RFLP 多態(tài)性的產(chǎn)生，鑒定其特定的突變位點(diǎn)以作為牛超數(shù)排卵性能相關(guān)基因的多態(tài)性檢測方 法，為牛標(biāo)記輔助育種提供一種有意義的分子標(biāo)記。
【附圖說明】
[0010] 圖1是蓮因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn) 分子量Marker，1-15泳道為被檢測的15個PCR產(chǎn)物。
[0011] 圖2是2%瓊脂糖凝膠電泳檢測因擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果。其中M 泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker。泳道5為GG型個體；泳道1、2、4、7、8、10、11、12、13為了6型個 體；泳道3、6、9、14、15為IT型個體。
[0012] 圖3是本發(fā)明擴(kuò)增的因部分DNA序列中突變位置的克隆測序峰圖。
[0013] 圖4是實(shí)施例2中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1. 5%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo) 準(zhǔn)分子量Marker，泳道1-16為被檢測的PCR產(chǎn)物。
[0014]圖5是實(shí)施例2中酶切反應(yīng)產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn) 分子量Marker，泳道1-16為被檢測的酶切產(chǎn)物。其中1、6、7、14泳道為TT型個體；2、3、5、 9、10、11泳道為GG型個體；4、8、12、13、15、16泳道為TG型個體。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了更清楚地理解本發(fā)明，用【具體實(shí)施方式】詳細(xì)描述具體內(nèi)容。
[0016] 實(shí)施例1 一、牛因部分DNA片段的克隆 利用01ig〇6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物1對，為保證良好的引物質(zhì)量，在本發(fā)明中，引物由 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為620bp，引物序列如下所示： ZNF33B-V:5? - GGAAGTTAAACAGCCTAGT -3? (正向引物） ZNF33B-R:5? - GGTTCTGTTCTTGATTTGC -3? (反向引物） PCR反應(yīng)過程中所需要的Taq酶、Buffer、鎂離子、dNTP等可自行選擇。為較快地獲得 良好的結(jié)果，本發(fā)明選擇Biomiga公司的2XBench Top? Taq Master mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 具體反應(yīng)體系為：2XMaster Mix (產(chǎn)品包裝盒內(nèi)提供，其中含Taq DNA Polymerase 0.05 units/iil，4mM MgCl2,0. 4mM dNTPs) 10.0 ul,正向引物與反向引物(濃度為均為 lOpmol/ yl)各 0.5yl,基因組 DNA 0.5yl (含 10-50ngDNA)，二餾水 8.5yl。PCR 反應(yīng)條件為： 94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35個循環(huán)，72°C最 后延伸5分鐘。
[0017]二、PCR-RFLP 方法的建立 1、PCR產(chǎn)物的檢測 本發(fā)明隨機(jī)抽取441頭母牛進(jìn)行基因組DNA提取，用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物ZNF33B-F和 ZNF33B-R進(jìn)行擴(kuò)增，得到620bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示為 特異性PCR產(chǎn)物，見圖1，其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker，1-15泳道為被檢測的15個PCR 產(chǎn)物。
[0018] 2、針對?；虿糠諨NA片段PCR-RFLP診斷方法的建立 用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物ZNF33B-F和ZNF33B-