一種鏈霉菌中聚酮生物合成基因簇及其擴增引物與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種鏈霉菌中聚酮生物合成基因簇及 其擴增引物與試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 鏈霉菌是一類來源于土壤的革蘭氏陽性細菌，它可以產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物， 可廣泛應(yīng)用于人、畜及農(nóng)業(yè)抗生素、抗真菌劑等方面，對人類具有重要的應(yīng)用價值。作為一 類重要的工業(yè)微生物，關(guān)于它的研究越來越受到重視。隨著鏈霉菌基因工程技術(shù)的發(fā)展，克 隆次級代謝產(chǎn)物生物合成基因、鑒定合成基因的功能，并有目的地定向改造基因、在基因水 平改變菌種的生產(chǎn)能力日益成為研究的熱點。由于鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物生物合成基因的重 要作用，所以從不同的鏈霉菌菌株中進行生物合成基因的克隆具有重要的實際意義。鏈霉 菌次級代謝產(chǎn)物生物合成基因通常是成簇排列的，包含很多相關(guān)功能基因，這些基因?qū)?生素產(chǎn)量具有很大影響。
[0003] 鏈霉菌次級代謝過程中，部分存在聚酮類化合物生物合成基因簇，是以羧酸縮合 反應(yīng)形式進行的。如紅霉素 （Streptomyces erytheara)和制霉菌素 （Streptomyces noursei)產(chǎn)生菌中均含有聚酮類化合物生物合成基因簇。武夷菌素是由不吸水鏈霉菌武夷 變種（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)產(chǎn)生的一種生物農(nóng)藥，具有高效、廣 譜、低毒的特點，在生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。武夷菌素的生產(chǎn)是利用 培養(yǎng)不吸水鏈霉菌武夷變種，通過生物深層發(fā)酵產(chǎn)生的微生物的次生代謝產(chǎn)物。研究武夷 菌素的合成基因，對于基因工程育種提供了重要的理論基礎(chǔ)，對于提高新菌株的開發(fā)與創(chuàng) 制水平具有重要的作用。但是，由于鏈霉菌本身GC含量很高，容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，多基因的 克隆難度較大。因此，篩選高效、特異、靈敏的特異性引物對于基因簇的克隆是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種用于擴增聚酮生物合成基因簇的成套引物。
[0005] 本發(fā)明提供的成套引物，由引物對1 -引物對44組成；
[0006] 所述引物對1由序列1所示的引物和序列2所示的引物組成；
[0007] 所述引物對2由序列3所示的引物和序列4所示的引物組成；
[0008] 所述引物對3由序列5所示的引物和序列6所示的引物組成；
[0009] 所述引物對4由序列7所示的引物和序列8所示的引物組成；
[0010] 所述引物對5由序列9所示的引物和序列10所示的引物組成；
[0011]所述引物對6由序列11所示的引物和序列12所示的引物組成；
[0012] 所述引物對7由序列13所示的引物和序列14所示的引物組成；
[0013] 所述引物對8由序列15所示的引物和序列16所示的引物組成；
[0014] 所述引物對9由序列17所示的引物和序列18所示的引物組成；
[0015] 所述引物對10由序列19所示的引物和序列20所示的引物組成；
[0016]所述引物對11由序列21所示的引物和序列22所示的引物組成；
[0017]所述引物對12由序列23所示的引物和序列24所示的引物組成；
[0018]所述引物對13由序列25所示的引物和序列26所示的引物組成；
[0019]所述引物對14由序列27所示的引物和序列28所示的引物組成；
[0020] 所述引物對15由序列29所示的引物和序列30所示的引物組成；
[0021] 所述引物對16由序列31所示的引物和序列32所示的引物組成；
[0022]所述引物對17由序列33所示的引物和序列34所示的引物組成；
[0023] 所述引物對18由序列35所示的引物和序列36所示的引物組成；
[0024] 所述引物對19由序列37所示的引物和序列38所示的引物組成；
[0025] 所述引物對20由序列39所示的引物和序列40所示的引物組成；
[0026]所述引物對21由序列41所示的引物和序列42所示的引物組成；
[0027]所述引物對22由序列44所示的引物和序列44所示的引物組成；
[0028] 所述引物對23由序列45所示的引物和序列46所示的引物組成；
[0029] 所述引物對24由序列47所示的引物和序列48所示的引物組成；
[0030] 所述引物對25由序列49所示的引物和序列50所示的引物組成；
[0031] 所述引物對26由序列51所示的引物和序列52所示的引物組成；
[0032] 所述引物對27由序列53所示的引物和序列54所示的引物組成；
[0033] 所述引物對28由序列55所示的引物和序列56所示的引物組成；
[0034] 所述引物對29由序列57所示的引物和序列58所示的引物組成；
[0035] 所述引物對30由序列59所示的引物和序列60所示的引物組成；
[0036] 所述引物對31由序列61所示的引物和序列62所示的引物組成；
[0037]所述引物對32由序列63所示的引物和序列64所示的引物組成；
[0038] 所述引物對33由序列65所示的引物和序列66所示的引物組成；
[0039] 所述引物對34由序列67所示的引物和序列68所示的引物組成；
[0040] 所述引物對35由序列69所示的引物和序列70所示的引物組成；
[0041]所述引物對36由序列71所示的引物和序列72所示的引物組成；
[0042]所述引物對37由序列73所示的引物和序列74示的引物組成；
[0043]所述引物對38由序列75所示的引物和序列76所示的引物組成；
[0044]所述引物對39由序列77所示的引物和序列78所示的引物組成；
[0045] 所述引物對40由序列79所示的引物和序列80所示的引物組成；
[0046]所述引物對41由序列81所示的引物和序列82所示的引物組成；
[0047]所述引物對42由序列83所示的引物和序列84所示的引物組成；
[0048] 所述引物對43由序列85所示的引物和序列86所示的引物組成；
[0049] 所述引物對44由序列87所示的引物和序列88所示的引物組成。
[0050]本發(fā)明另一個目的是提供用于擴增聚酮生物合成基因簇的PCR試劑。
[0051 ]本發(fā)明提供的PCR試劑，包括上述的引物對、PCR擴增緩沖液(KOD plus Buffer)、 DMSO、dNTP、MgS〇4和DNA聚合酶(KOD plus酶）。
[0052] 上述PCR試劑中，所述引物對中每條引物中的摩爾比為1:1。
[0053] 含有上述的引物對或上述的引物對的試劑盒也是本發(fā)明保護的范圍。
[0054] 上述的引物對或上述的引物對的試劑盒在擴增聚酮生物合成基因簇中的應(yīng)用也 是本發(fā)明保護的范圍。
[0055] 上述的引物對或上述的引物對的試劑盒在檢測待測鏈霉菌中是否含有聚酮生物 合成基因簇中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0056] 上述應(yīng)用中，檢測待測鏈霉菌中是否含有聚酮生物合成基因簇的方法包括如下步 驟:提取待測鏈霉菌的基因組DNA，分別用表2所示的44個引物對進行PCR擴增，得到44個片 段;再用DNAMAN軟件將這44個片段拼接，若拼接得到序列89所示的聚酮生物合成基因簇，則 待測鏈霉菌中含有序列89所示的聚酮生物合成基因簇;若無法拼接得到序列89所示的聚酮 生物合成基因簇，則待測鏈霉菌中不含有序列89所示的聚酮生物合成基因簇。
[0057] 上述中，所述聚酮生物合成基因簇由如下1)-5)共5類成套基因組成：
[0058] 1)負責(zé)聚酮長鏈骨架合成的成套基因:wysI、wysJ、wysK、wysA、wys!^PwysC ;
[0059] 2)編碼調(diào)控子的成套基因 wysR、wysRII、wysRIII、wysPI、wysPII和wysPIII;
[0060] 3)編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的成套基因:wysG和wysH;
[0061] 4)編碼糖基的合成與附著的成套基因:wysDI、wysDII和wysDIII;
[0062] 5)編碼其他后修飾蛋白與未知功能蛋白的成套基因：wysL、wysM、wysN、wysE和 wysF〇
[0063] 上述聚酮生物合成基因簇為如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0064] 1)序列表中序列89所不的DNA分子；
[0065] 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；
[0066] 3)與1)限定的DNA分子具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
[0067] 上述嚴格條件可為在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0068]本發(fā)明另一個目的是提供一種基因簇。
[0069]本發(fā)明提供的基因簇，由如下1)-5)共5類成套基因組成：
[0070] 1)負責(zé)聚酮長鏈骨架合成的成套基因:wysI、wysJ、wysK、wysA、wys!^PIwysC ;
[0071 ] 2)編碼調(diào)控子的成套基因 wysR、wysRII、wysRIII、wysPI、wysPII和wysP