一種同時檢測海水魚類三種致病菌的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原菌檢測領域，具體涉及一種螄魚諾卡氏菌、哈維弧 菌和海豚鏈球菌的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 獅魚諾卡氏菌(Nocardia seriolae)、哈維弧菌(Vibrio harveyi)和海膝鏈球菌 (Streptococcus iniae)是三種常見的海水養(yǎng)殖魚類病原菌，其中螄魚諾卡氏菌和海豚鏈 球菌屬于革蘭氏陽性菌，而哈維弧菌屬于革蘭氏性陰菌。這三種菌在海洋環(huán)境及水產(chǎn)養(yǎng)殖 環(huán)境中廣泛分布，可通過餌料、水環(huán)境等進行傳播，它們在生物學特性和致病性上有一定區(qū) 另IJ，但都可導致多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物大量死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。
[0003] 螄魚諾卡氏菌在在25~40°C均能生長，最適溫度為25~28°C，生長的鹽度范圍為0 ~4.5%，廣泛分布于空氣、土壤、海水、淡水、腐爛的植被及動物的排泄物中，以腐生為主。 當養(yǎng)殖魚類體質(zhì)虛弱、免疫力低下時，通過消化道、鰓或創(chuàng)傷而感染。該病最危險的特點是 潛伏期長，自然發(fā)病率15%~60%，諾卡氏菌生長緩慢，但受感染的魚在發(fā)病初期通常未出 現(xiàn)外部癥狀或癥狀不明顯，故給該病的早期檢測、診斷及治療帶來了極大困難。
[0004] 哈維弧菌主要存在于自由水體、浮游動植物體表、海底沉積物中，是石斑魚、東方 飩、輓魚、鱸魚、大黃魚和卵形鯧鰺等多種魚類的重要病原菌。此外，哈維弧菌還能感染人 類，引起繼發(fā)性敗血癥。被感染的魚類因種類、體質(zhì)、部位等不同而表現(xiàn)出復雜多樣的癥狀， 且引起較高的死亡率，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中亟需快速準確、 操作簡便的針對哈維弧菌的檢測技術。
[0005] 海豚鏈球菌是危害世界養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一，可感染包括淡水河海水在內(nèi)的 多種野生或養(yǎng)殖魚類，近年來，陸續(xù)有關于海豚鏈球菌引起哺乳動物甚至人類的疾病報道。 鏈球菌感染魚的主要臨床癥狀為眼球突出，角膜混濁，游動異常，并伴有腦膜炎、組織出血 及肝膽癥狀等解剖病變，但一些魚類感染海豚鏈球菌卻不表現(xiàn)出癥狀。在疾病爆發(fā)后的幸 存魚體內(nèi)也可分離到該病原，這些幸存魚很可能成為未來疾病爆發(fā)的攜帶者。因此，病原的 早期檢測與及時采取有效的防控措施尤為重要。
[0006] 基于現(xiàn)有的技術檢測水產(chǎn)動物致病菌大多采用病樣細菌分離、培養(yǎng)及鑒定等方 法，其操作過程復雜、耗時，且檢測的靈敏度較低，結果不確定常延誤病情的診斷。在應對突 發(fā)的疾病發(fā)生事件時則不能滿足診斷及時、靈敏度和特異性高、檢測結果準確以及樣品數(shù) 量較大的要求。針對螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的快速檢測方面，國內(nèi)外學者已 構建針對單一致病菌的細菌培養(yǎng)鑒定和PCR等檢測方法，然而在海水水生動物養(yǎng)殖過程中， 進行相關疾病的預防和控制時，其樣本量大，時間緊，需要對多種致病菌進行同時快速檢 測，而采用單一的致病菌PCR檢測方法或一般的細菌分離方法則不能滿足上述要求。三重 PCR是在普通PCR的基礎上，在同一反應體系中加入三對引物，同時特異性擴增出三種目的 基因片段。在本發(fā)明中，在同一反應管內(nèi)螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的基因片 段，將大大節(jié)省時間和試劑，節(jié)約經(jīng)費，為檢測提供更多更準確的信息。
[0007] 多重PCR以其快速、高效、靈敏和特性的特點，在病原微生物檢測中具有重要作用， 也符合衛(wèi)生、質(zhì)檢等快速檢測的需要，是一種準確、科學、可靠的檢測方法。有鑒于此，開發(fā) 一種同時檢測螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的多重PCR勢在必行，對于加強水產(chǎn)養(yǎng) 殖過程中病原的監(jiān)測和預警、水產(chǎn)品中致病菌的快速檢驗檢疫等具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種能同時檢測螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和 海豚鏈球菌的檢測引物組，試劑盒及其方法，該試劑盒精確度高、檢測方便。
[0009] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供的前一技術方案是這樣的：
[0010] -種螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的檢測引物組，其特征在于，包括引物 對Ns-mce、引物對Vh-tox和引物對Si-its;其中，所述引物對Ns-mce包括核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的Ns-mceF和核苷酸序列如SEQ ID勵.2所示的他-1^61?;所述引物對￥114(?包 括核苷酸序列如SEQIDN0.3所示的Vh-toxF和核苷酸序列如SEQIDN0.4所示的Vh-toxR ; 所述引物對Si-its包括核苷酸序列如SEQIDN0.5所示的Si-itsF和核苷酸序列如SEQID
[0011] 本發(fā)明提供的另一個技術方案，是提供含有上述的螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海 豚鏈球菌的檢測引物組的試劑盒。
[0012] 進一步的，上述的螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的檢測試劑盒，還包括蛋 白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-異戊醇混合溶液、異丙醇、體積濃度為70%的乙醇、TE緩沖液、 CTAB的NaCl溶液、陽性對照品和PCR DsMix。
[0013] 進一步的，上述的螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的檢測試劑盒，所述酚-氯仿-異戊醇混合溶液中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1。
[0014] 進一步的，上述的螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的檢測試劑盒，所述CTAB 的NaCl溶液為將CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的質(zhì)量體積比為1: 20 〇
[0015] 進一步的，上述的螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的檢測試劑盒，所述陽性 對照品包括螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的DNA模板。
[0016] 進一步的，上述螄魚諾卡氏菌、哈維弧菌和海豚鏈球菌的檢測試劑盒，所述檢測引 物組中的引物濃度均為1 〇μΜ。
[0017] 本發(fā)明的最后一個技術方案是提供所述檢測試劑盒進行檢測的方法，包括如下步 驟：
[0018] 1)取待檢測樣品50~100mg并加入500-550yL的ΤΕ緩沖液，用玻璃勻漿器充分勻漿 后，于12000r/min 離心 lOmin;
[0019] 2)步驟1)離心后去除沉淀，取上清備用；
[0020] 3)向步驟2)上清溶液中加入30yL質(zhì)量濃度為10%SDS和15yL 20mg/mL的蛋白酶K， 并于37°C溫育lh;
[0021] 4)向步驟3)溫育后的溶液中加入100yL 5mo 1/L的NaCl溶液，充分混勻后再加入80 μΙΧΤΑΒ 的 NaCl 溶液，65°C 溫育 20min;
[0022] 5)向步驟4)溫育后的溶液中加入與溫育后的溶液等體積的酚-氯仿-異戊醇混合 溶液混勾，12000g/min離心4_5min;
[0023] 6)將步驟5)離心后的上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍體積的異丙醇， 12000g/min 離心 4_5min;
[0024] 7)步驟6)離心后去上清，沉淀用lmL的體積濃度為70%的乙醇洗滌后，12000g/min 離心 4_5min;
[0025] 8)步驟7)離心后去上清，沉淀常溫干燥5-10min，重溶于30-50yL TE緩沖液，即為 樣品DNA模板；
[0026] 9)樣品組三重PCR反應體系包括：12.5yL 2XPCR DsMix、1.0yL引物Ns-mceF、1.0y L引物Ns-mceR、0 · 7yL引物Vh-toxF、0 · 7yL引物Vh-toxR、1 · 8yL引物Si-itsF、1 · 8yL引物Si-itsR、3. OyL步驟8)得到的樣品DNA模板和2.5yL無菌水；
[0027] 10)陽性對照組三重PCR反應體系包括：12.5yL 2XPCR DsMix、1.0yL引物化-mceF、1 · OyL 引物 Ns-mceR、0 · 7yL 引物Vh-toxF、0 · 7yL 引物Vh-toxR、1 · 8yL 引物Si-i tsF、1 · 8μ L引物Si-itsR、3. OyL陽性對照品和2.5yL無菌水；
[0028] 11)將步驟9)制得的樣品組和步驟10)制得的陽性對照組分別混勻后12000g/min 離心l〇s，置于PCR儀中，分別于94°C預變性4min，94°C變性3〇8、58°(：退火3〇8、72°(：延伸 lmin，35個循環(huán)，72 °C延伸1 Omin，進行PCR反應；
[0029] 12)對步驟11)PCR反應結果進行電泳檢測，分別設置樣品孔、陽性對照孔和參比 孔;所述樣品孔取步驟11)樣品組PCR反應產(chǎn)物5yL與6 X Loading Buff er lyL混合，加入到 1 %瓊脂糖凝膠點樣孔中；所述陽性對照孔取步驟11)陽性對照組PCR反應產(chǎn)物5yL與6 X Loading Buffer lyL混合，加入到1%瓊脂糖凝膠點樣孔中；所述參比孔取5yL DL2000DNA Marker加入到1%瓊脂糖凝膠點樣孔中；以120V電壓分別對所述樣品孔、所述陽性對照孔和 所述參比孔進行電泳25min后，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果;若樣品孔電泳條帶出現(xiàn)與陽性 對照孔相同大小的條帶，則說明待測樣品中含有相對應的細菌。
[0030] 相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0031] 1、本發(fā)明引物組具有高特異性，可以根據(jù)是否擴增就能判斷目標基因的存在與 否，從而能夠確定樣品是否含有螄魚諾卡氏菌、哈維