專利名稱：：豬繁殖性狀相關(guān)基因ncoa1及其在豬標記輔助選擇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于豬的分子標記制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標記的存在，具體地說，是涉及一種與豬繁殖性相關(guān)的如SEQIDN0:1所示的NC0A1基因，更進一步地說，是涉及檢測該基因的多核苷酸序列中的單核苷酸多態(tài)性位點的存在。
背景技術(shù)：
：豬繁殖性狀具有重要的經(jīng)濟性狀，其遺傳基礎(chǔ)十分復(fù)雜，繁殖性狀被認為是由多基因控制的一類性狀。該性狀遺傳力極低，并且是限性性狀，所以對該性狀的改良十分有限，20世紀80年代以來，隨著分子輔助選擇和標記輔助滲入等分子育種技術(shù)，這些技術(shù)與常規(guī)育種方法相結(jié)合，大大提高了豬的育種效率。目前的研究結(jié)果表明，在豬的基因組中存在產(chǎn)仔數(shù)的數(shù)量性狀基因座(QTL)和主效基因，它們對決定產(chǎn)仔數(shù)的多少起重要作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的候選基因，如雌激素受體、催乳素受體、促黃體素、視黃酸受體、視黃酸結(jié)合蛋白、骨橋蛋白等基因。核受體輔激活蛋白1基因(Nuclearreceptorco-activator1gene,NC0A1)，又稱為類固醇受體輔激活蛋白1基因(SRC1)，是影響豬繁殖性狀的一個候選基因。核受體輔激活蛋白通過與結(jié)合到DNA上的核受體相互作用增強轉(zhuǎn)錄活性。受到NC0A1影響的核受體，如ESR，雄激素受體(AR)，在動物的生長發(fā)育，體內(nèi)平衡，和繁殖等生理過程中起到重要作用。帶負電的DNA和帶正電的組蛋白N端有很強的相互作用，并且核小體的緊密結(jié)構(gòu)通過限制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到基因進而抑制DNA的轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙酞基轉(zhuǎn)移酶的活性使輔激活蛋白可以增強核受體的轉(zhuǎn)錄活性，并可以通過為其他輔因子提供結(jié)合位點而形成穩(wěn)定的起始前復(fù)合物。由此可見，NC0A1蛋白可調(diào)節(jié)與豬繁殖性狀的有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響這些基因的表達。NC0A1與結(jié)合在DNA上的雌激素受體復(fù)雜的相互作用并加強其轉(zhuǎn)錄活性。NC0A1蛋白在暴露其他難接近的染色質(zhì)的過程中使組蛋白乙?；⑴c其他乙酰基轉(zhuǎn)移酶(P300/CBP)相互作用。因此，NC0A1蛋白增強了雌激素受體的活性，反過來也刺激特定的雌激素反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)隨后的生理反應(yīng)。國內(nèi)雖有一些關(guān)于人和小鼠NC0A1基因的報道，但還沒有豬NC0A1基因與產(chǎn)仔數(shù)性狀的相關(guān)報道，然而有研究表明NC0A1可能是影響母豬多產(chǎn)性狀的候選基因，該基因定位于豬3號染色體上。人的NC0A1基因總共有183.4kb，含有22個外顯子，其cDNA長度為4721bp。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬繁殖性狀相關(guān)NC0A1基因及其在豬標記輔助選擇中的應(yīng)用，為豬標記輔助選擇提供有用的分子標記。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種豬繁殖性狀相關(guān)基因NC0A1，其DNA序列如序列表SEQIDN0:1所述。所述序列表SEQIDNO1的第314bp處有一個T314—C314的堿基突變，導致PCR-RFLP-RsaI多態(tài)性。上述NC0A1基因的多態(tài)性是利用比較基因組學方法根據(jù)人的NC0A1基因的保守區(qū)設(shè)計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，利用限制性內(nèi)切酶RsaI對PCR產(chǎn)物進行酶切鑒定，檢測在克隆得到的NC0A1基因片段的第314bp處是否存在T—C的突變。上述克隆及檢測NC0A1基因突變所用的引物為正向引物5‘-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3‘，反向引物5‘-CTTACAGGAGGGTAGCCCCT-3‘。上述豬繁殖性狀相關(guān)基因NC0A1在豬分子標記輔助選擇中的應(yīng)用。利用上述制備的與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標記可對外來豬和中國地方豬進行關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用。本發(fā)明利用比較基因組學方法根據(jù)人的NC0A1基因的保守區(qū)設(shè)計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，擴增片段利用SSCP技術(shù)和測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)SNP，并利用PCR-RFLP進行基因分型，再利用SAS軟件GLM(通用線性模型)分析SNP與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)度。SNP發(fā)現(xiàn)與檢測方法建立發(fā)明人設(shè)計了擴增包含該SNP引物，該基因擴增片段有440bp，當?shù)?14bp位置是T時，則該RsaI酶切位點不存在，RsaI酶切后檢測結(jié)果只有1個片段，長度是440bp(定為等位基因A)；當存在T314—C314的轉(zhuǎn)換時，其結(jié)果導致第314bp處一個RsaI酶切位點的產(chǎn)生，得到2個片段，長度分別為314bp和128bp(定為等位基因8)，三種基因型4々^8、88，如圖1所述?；蛐团c繁殖性狀間關(guān)聯(lián)結(jié)果利用SAS軟件中的一般線性模型(GeneralLinearModel,GLM)程序?qū)蛐团c性狀進行關(guān)聯(lián)分析，具體模型如下Yijk=U+Gi+CJ+Pk+BJ+eiJko其中Yijk是性狀觀察值，i!為總體均數(shù)，Gi為基因型效應(yīng)，Cj為品種效應(yīng)，Pk為父本效應(yīng)，B」為批次效應(yīng)，為隨機誤差，假定相互獨立，服從N(0，o2)分布。本發(fā)明將為豬繁殖性狀的分子標記，為標記輔助選擇(MAS)奠定堅實的基礎(chǔ)，進一步闡明繁殖性狀的分子機制，將為改善豬繁殖提供理論依據(jù)，可提高養(yǎng)豬生產(chǎn)經(jīng)濟效益，并指導豬的育種實踐。圖1是本發(fā)明的NC0A1基因片段的序列，314bp處的多態(tài)位點用()標出表示，下劃線部分為引物序列。圖2是本發(fā)明豬NC0A1基因PCR-RFLP-RsaI電泳圖，顯示了PCR-RFLP-Rsal的三種基因型(AA、AB、BB)的電泳結(jié)果。其中M:100bpDNAMaker;1，3為PCR擴增產(chǎn)物；2，4，7，10為BB基因型；5，8，11為AA基因型；6，9，12為々8基因型。圖3為PCR產(chǎn)物測序的彩峰圖，上為AA型，下為BB型，突變位置用箭頭表示。具體實施例方式PCR-RFLP技術(shù)檢測NC0A1基因的RsaI多態(tài)性引物設(shè)計用人NCOAl基因cDNA(GenBank收錄號NM_001130915)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為80%以上的ESTs(片段長度大于IOObp)，將這些ESTs的收錄號在NCBI中用ENTREZ(httpwww.ncbi.nlm.nih.gov/ffeb/Search/index.html)查詢相應(yīng)序列，然后用DNASTAT程序中的ASSEMBLY程序構(gòu)建豬EST-重疊群。根據(jù)EST拼接序列設(shè)計一對引物M-F和M-R，以豬的基因組DNA為模板擴增，序列如下NC0A1正向引物5'-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3‘，(SEQIDNO:2)，反向引物5‘-CTTACAGGAGGGTAGCCCCT-3‘(SEQIDNO3)。PCR擴增條件PCR反應(yīng)總體積20μL，其中豬基因組DNAIOOng,含1XBuffer(Promega)、1.5mmol/LMgCl2、dNTP終濃度為1.50μmol/L、引物終濃度為0.4μmol/L、及2UTaqDNA聚合酶(Promega)。PCR擴增程序是-MV3min。循環(huán)35次94°C30s,59°C30s，然后72°C20s,最后72°C延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR-RFLP檢測條件PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10μL，其中1XBuffer1μL，PCR產(chǎn)物35μL，限制性內(nèi)切酶RsaI為0.3ML(10U)，用H2O補足10μL，將樣品混勻后離心，37°C水浴4h，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照，結(jié)果如圖2所示，表明RsaI過程后存在AA、AB和BB基因型。SNP的篩查運用正向引物和反向引物分離豬基因組片段，通過在不同豬種的基因組中擴增，回收進行產(chǎn)物測序，發(fā)現(xiàn)在該基因片段的第314位堿基處有一個T—C的堿基突變，導致PCR-RFLP-RsaI多態(tài)性，但不引起氨基酸的改變。結(jié)果PCR擴增產(chǎn)物純化后克隆測序，測序結(jié)果顯示擴增片斷全長共440bp，見圖1，序列如SEQIDNO:1所示。結(jié)果表明存在AA、AB和BB基因型，在NCOAl基因片斷的314bp處存在T—C的突變，進一步證實了PCR產(chǎn)物中存在多態(tài)性，見圖3。DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)立占的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。檢索結(jié)果表明所測序列與人NC0A1基因(GenBank收錄號NM_001130915)的部分序列同源性達85%。為了進一步證明該分子遺傳標記為穩(wěn)定的分子標記，而非群體中存在的基因突變，本發(fā)明分析了PCR-RFLP-RsaI分子標記多態(tài)性在各豬品種中的分布情況。由下表1可知，在三個外來豬種中，長白豬、大白豬均有AA、AB、BB三種基因型；而在杜洛克豬中只檢測到AA型純合子，無AB、BB基因型。在這三個品種中，等位基因B的頻率分別為0.2333,0.1719,0,A等位基因的頻率分別為0.7667,0.8281、1，由以上結(jié)果可看出等位基因B在這三個外來豬種中的頻率較低，而A等位基因的頻率都有較高分布，同理，在這三個品種中基因型頻率最高，BB基因型頻率最低。杜洛克豬群的基因型分布有一個特殊的現(xiàn)象，只檢測到AA—種基因型，等位基因B的頻率為0，這與大白豬和長白豬的基因型分布差異極顯著(P<0.01)?？傊?，除杜洛克豬外，RsaI酶切位點存在多態(tài)現(xiàn)象，均存在三種基因型AA、AB、BB。三個豬種之間基因型分布差異極為顯著(P<0.01)，長白與大白之間基因型分布存在顯著差異(P<0.05)，杜洛克與大白、長白之間基因型分布差異極為顯著(P<0.01)。經(jīng)卡方檢驗，杜洛克、長白豬、大白豬的基因型分布均符合哈代-溫伯格平衡定律。并且整個正虹豬群的基因型分布符合哈代-溫伯格平衡定律(x2(a(l5,2)=5.59)。表1不同品種NCOAl基因T312C位點的Hardy-Weinberg平衡檢驗<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明的分子標記在豬繁殖性狀標記性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用本發(fā)明所用樣本全部來自正虹種豬場，涉及3個純種(大白、長白和杜洛克)共454個樣品，其中長白母豬(Landrace，L)224頭；大白母豬(LargeWhiet，W)105頭；杜洛克母豬(DurOC，D)125頭。繁殖性狀記錄包括每頭母豬的各胎次總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)。大白、長白兩品種NCOAl各基因型頭胎與經(jīng)產(chǎn)胎的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)均數(shù)及標準差，統(tǒng)計結(jié)果列于表2。表2NC0A1基因型母豬的平均仔數(shù)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注各列中肩標相同者表示差異不顯著，肩標不同字母的表示差異顯著。由下表3表明，母豬胎次對其產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響，頭胎總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)均低于經(jīng)產(chǎn)胎，如大白豬AA型頭胎平均總產(chǎn)仔數(shù)為10.16，而經(jīng)產(chǎn)胎為12.33，經(jīng)產(chǎn)胎比頭胎高2.17頭(P<0.01)。對頭胎總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的分析表明大白豬AA基因型比BB基因型的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)分別高1.66頭和1.37頭，差異達到顯著水平(P<0.05)；而在長白豬群中，頭胎產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)在各基因型之間的差異不顯著(P>0.05)。對經(jīng)產(chǎn)胎次總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的分析則表明大白豬AA基因型比AB、BB基因型的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)分別高2.66頭和2.71頭，差異達到極顯著水平(P<0.01)；長白豬AA基因型比BB基因型的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)分別高2.42頭和2.07頭，差異達到極顯著水平(P<0.01)?？傊?，胎次對產(chǎn)仔性狀有顯著影響，經(jīng)產(chǎn)胎次產(chǎn)仔數(shù)顯著高于頭胎；并且他們在總產(chǎn)仔數(shù)還是產(chǎn)活仔數(shù)上都有上有按AA、AB、BB遞減的趨勢，AA型的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均高于AB和BB型。表3NC0A1各基因型初產(chǎn)與經(jīng)產(chǎn)母豬的產(chǎn)仔數(shù)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注各列中肩標字母相同者表示差異不顯著，肩標字母不相同者表示差異顯著。權(quán)利要求一種豬繁殖性狀相關(guān)基因NCOA1，其DNA序列如序列表SEQIDNO1所述。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬繁殖性狀相關(guān)基因NC0A1，其特征在于所述序列表SEQIDNO1的第314bp處有一個T314—C314的堿基突變，導致PCR-RFLP-RsaI多態(tài)性。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬繁殖性狀相關(guān)基因NC0A1，其特征在于所述NC0A1基因的多態(tài)性是利用比較基因組學方法根據(jù)人的NC0A1基因的保守區(qū)設(shè)計引物，以豬的基因組DNA為模板擴增，利用限制性內(nèi)切酶RsaI對PCR產(chǎn)物進行酶切鑒定，檢測在克隆得到的NC0A1基因片段的第314bp處是否存在T—C的突變。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬繁殖性狀相關(guān)基因NC0A1，其特征在于所述克隆及檢測NC0A1基因突變所用的引物為正向引物5‘-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3‘，反向引物5‘-CTTACAGGAGGGTAGCCCCT-3‘。5.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的豬繁殖性狀相關(guān)基因NC0A1在豬分子標記輔助選擇中的應(yīng)用。全文摘要一種豬繁殖性狀相關(guān)基因NCOA1及其在豬標記輔助選擇中的應(yīng)用，測定出作為豬標記輔助選擇應(yīng)用與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標記，該分子標記由NCOA1基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNo1所述，該序列全長440bp，在序列的第314bp處有一個T314→C314的堿基突變，導致PCR-RFLP-RsaI多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴增NCOA1基因DNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性的檢測方法。本發(fā)明為豬繁殖性狀標記輔助選擇提供了新的分子標記。文檔編號C12Q1/68GK101824417SQ201010169799公開日2010年9月8日申請日期2010年5月12日優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日發(fā)明者伍小松,李永輝,柳小春,蔣雋,馬海明申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學