HbCS3基因在提高原核表達菌生長速率、研究橡膠樹抗逆境脅迫和產膠能力中的應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物領域，具體涉及HbCS3基因在提高原核表達菌生長速率中的應用、 HbCS3基因作為靶基因在研究橡膠樹抗逆境脅迫和產膠能力中的應用，還涉及一種攜帶 HbCS3基因的重組體及重組大腸桿菌。
【背景技術】
[0002] 梓檬酸合酶(citrate synthase，CS，EC4.1.3.7)幾乎存在于所有的生物體中，是 細胞內多種代謝途徑的關鍵限速酶及代謝變化的標志酶(葛亞東，潘蔚，汪劼，朱國萍.檸檬 酸合酶的分子生物學研究進展.生物學雜志.2010，27(3): 59-62.) XS具有高度的底物特異 性，僅催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合生成檸檬酸和輔酶AXS具有多種同工酶，根據(jù)其存在 于不同的亞細胞結構中，CS分為線粒體CS (mCS)和過氧化物酶體CS (gCS) (Schnarrenberger C, Martin William.Evolution of the enzymes of the citric acid cycle and the glyoxylate cycle of higher plants. A case study of endosymbiotic gene transfer.European Journal of Biochemistry.2002,269(3) :868-883. hmCS是線粒體中 三羧酸循環(huán)(TCA)起始的關鍵酶，參與細胞內主要的能量代謝;pCS是過氧化物體中的關鍵 酶之一，參與細胞內脂肪酸的氧化以及細胞解毒過程。CS的活性變化直接導致細胞內乙酰 輔酶A池的變化，而乙酰輔酶A是脂肪酸合成的主要原料來源，乙酰輔酶A池的變化將直接影 響脂肪酸的合成。近年來，研究發(fā)現(xiàn)CS參與多種生理過程，如線粒體能量代謝、種子萌發(fā)和 抗逆等（Schmidtmann E, K5nigAC,0rwat A,Leister D,Hartl M,Finkemeier I.Redox regulation of Arabidopsis mitochondrial citrate synthase.Mol Plant.2014,7(1): 156-69.Pracharoenwattana I,Cornah JE, Smith SM.Arabidopsis peroxisomal citrate synthase is required for fatty acid respiration and seed germination.Plant Cell.2005,17(7):2037-48.Koyama H,Kawamura A,Kihara T,Hara T,Takita E,Shibata D. Overexpression of mitochondrial citrate synthase in Arabidopsis thaliana improved growth on a phosphorus-limited soil.Plant Cell Physiol.2000,41(9): 1030-7.童晉，詹高淼，王新發(fā)，劉貴華，華瑋，王漢中.油菜檸檬酸合酶基因的克隆及在逆境 下的表達.作物學報.2009，35( 1): 33-40.)。
[0003] 巴西橡膠樹是四大工業(yè)原料之一天然橡膠的主要來源，天然橡膠(橡膠烴)具有合 成橡膠不可比擬的綜合優(yōu)良性狀，具有極高的經(jīng)濟價值及應用前景。乙酰輔酶A是橡膠烴合 成的前體物質，直接參與橡膠樹天然橡膠的生物合成，CS的活性變化直接影響胞內乙酰輔 酶A池的變化，進而影響橡膠樹產膠能力(鄒智，楊禮富，王真輝，袁坤.橡膠樹中橡膠的生物 合成與調控.植物生理學通訊.2009:45(12): 1231-1238.張福城，陳守才.巴西橡膠樹天然 橡膠生物合成中關鍵酶及相關基因研究進展.熱帶農業(yè)科學，2006，26 (1): 42-46.)。另外， 橡膠樹產膠能力與抵抗外界不良環(huán)境因素能力密切相關，如寒害，風害及病害均直接影響 橡膠樹產量。因此，橡膠樹CS在橡膠樹的生長發(fā)育(橡膠烴生物合成）以及抵御生物與非生 物脅迫中具有重要作用，分析CS將有助于進一步了解胞內乙酰輔酶A池的調控機制及在橡 膠樹代謝中的重要作用。目前橡膠樹檸檬酸合酶(CS)基因及酶活特性未見報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，對橡膠樹檸檬酸合酶基因 HbCS3基因 進行了基因表達分析和功能研究，發(fā)現(xiàn)其對該基因轉入原核表達菌株后獲得的轉基因菌株 在正常及重金屬脅迫下培養(yǎng)條件下生長速率均明顯提高，且與橡膠樹膠乳產量相關，可應 用于提高細菌生長速率，可作為靶基因應用在橡膠樹產膠和抗逆境脅迫能力的研究中。
[0005] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種基因重組體，為攜帶HbCS3基因的重組體，所述 HbCS3基因的序列如SEQIDN0:1所示。
[0006] 其中，所述重組體的載體為表達質粒或病毒載體。
[0007] 其中，所述病毒載體選自腺病毒載體、單純皰疹病毒載體、反轉錄病毒載體、腺伴 隨病毒載體、慢病毒載體中的一種，優(yōu)選為腺病毒載體。
[0008] 本發(fā)明的第二個方面是提供一種快速生長的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌含 有本發(fā)明第一個方面所述的任意一種基因重組體。
[0009] 本發(fā)明的第三個方面是提供本發(fā)明第二個方面所述的重組大腸桿菌在基因工程 菌中的應用。
[0010] 本發(fā)明的第四個方面是提供HbCS3基因在提高原核表達菌生長速率中的應用。
[0011] 進一步地，HbCS3基因應用于提高原核表達菌在重金屬脅迫下的生長速率。
[0012] 其中，所述重金屬為銅、和/或鉛、和/或鋅、和/或錫、和/或鎳、和/或鈷、和/或銻、 和/或萊、和/或鎘、和/或祕。
[0013] 進一步地，所述原核表達菌為大腸桿菌。
[0014]本發(fā)明的第五個方面是提供HbCS3基因作為靶基因在研究橡膠樹抗逆境脅迫能力 中的應用。
[0015] 本發(fā)明的第六個方面是提供HbCS3基因作為靶基因在研究橡膠樹的產膠能力中的 應用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] HbCS3基因轉入原核表達菌株后，能夠顯著提高菌株在正常及重金屬脅迫下培養(yǎng) 條件下的生長速率，將攜帶HbCS3基因的原核表達菌株應用于工程菌，工程菌生長速度快， 能顯著提高效率，降低成本等，在微生物的基因工程中具有良好的應用前景。另外，HbCS3基 因在雄花、樹皮及種子中高表達，同時受乙烯利及割膠誘導上調表達，與橡膠樹膠乳產量呈 正相關，該基因還同時受高溫和低溫脅迫誘導上調表達，因此該基因可能與橡膠樹產量性 狀及抗逆境脅迫密切相關，可作為橡膠樹轉基因育種的重要靶基因，有望通過調控該基因 的表達來合理挖掘橡膠樹的產膠及抗逆潛力。此外，該基因可作為重要的基因資源，還可能 在橡膠樹以外的其他植物的基因工程中得到應用。
【附圖說明】
[0018] 圖1為HbCS3的原核表達分析；
[0019] 圖2為HbCS3重組蛋白酶活檢測；
[0020] 圖3為轉基因菌株在正常條件下的生長速率測定；
[0021] 圖4為轉基因菌株在重金屬銅離子脅迫下的生長速率測定；
[0022]圖5為HbCS3基因的組織特異性表達分析；
[0023]圖6為割膠對HbCS3基因表達的影響；
[0024]圖7為乙烯利對HbCS3基因表達的影響；
[0025]圖8為高溫脅迫對HbCS3基因表達的影響；
[0026]圖9為低溫脅迫對HbCS3基因表達的影響。
【具體實施方式】
[0027]下面參照附圖，結合具體的實施例對本發(fā)明作進一步地描述，以更好地理解本發(fā) 明。
[0028] 1.橡膠樹檸檬酸合酶編碼基因(HbCS)的獲得
[0029]分析已在NCBI登陸的擬南芥、水稻、楊樹及蓖麻的檸檬酸合酶(CS)的核苷酸序列， 通過搜索我們建立的橡膠樹膠乳EST序列數(shù)據(jù)庫，篩選并拼接一條1900bp左右的橡膠樹檸 檬酸合酶基因組裝后序列（contig)，設計一對特異引物擴增得到包含完整讀碼框的cDNA全 長序列。
[0030] cDNA克隆具體方法如下：
[0031]特異性引物設計如下：
[0032] F(5,端）：5，-AATCGACTATCGGTTTCGCTT-3,；
[0033] R(3' 端）：5，-GCCACGAATTGCAAAATAGTAGAT-3，。
[0034]以巴西橡膠樹熱研7-33-97(中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所培育，中國熱帶農業(yè) 科學院橡膠研究所長期有種苗出售)葉片cDNA為模板（以隨機引物反轉錄獲得），F(xiàn)和R為引 物，其終濃度為0.4ymol/L，在20μ1反應體系中進行PCR擴增。擴增程序為:94°C預變性4min; 94°C變性45S，68°C退火 3min，共30次循環(huán)；72°c延伸lOmin。
[0035] 將該PCR獲得的片段連接到pMD18-T載體(TaKaRa)進行測序，測序表明上述獲得的 片段即為本發(fā)明的檸檬酸合酶(CS)基因，該片段具有序列表中SEQIDN0:1的核苷酸序列，序 列表中SEQIDN0:1全長為1779個核苷酸，包含一個長度為1536個核苷酸的開放閱讀框(0RF， 自序列2的5'端第45-1580位核苷酸序列）、44個核苷酸的5'-UTR(自序列2的5'端第1-44位 核苷酸序列)和219個核苷酸的3'-UTR(自序列2的5'端第1581-1799位核苷酸序列），編碼一 個長度為511個氨基酸（序列表中SEQIDN0:2)、分子量約為56kDa的蛋白，即為檸檬酸合酶 (CS)，將該檸檬酸合酶基因命名為HbCS3。將上述含有SEQIDN0:1的核苷酸的pMD18-T重組載 體命名為pMD18_HbCS3。除此之外，利用亞細胞定位預測軟件(ProtComp Version 9.0)在線 分析該蛋白的氨基酸序列，將該蛋白定位于過氧化物體中，因此HbCS3屬于橡膠樹過氧化物 體型檸檬酸合酶。
[0036] 2.原核表達與HbCS3基因的功能驗證
[0037] 利用pMAL_c5E表達載體（pMAL_c5E(質粒）表達載體購自New England Biolabs公 司）構建了 HbCS3基因的原核表達載體(應當理解的是，本實施例中表達載體僅為舉例，本發(fā) 明也可以采用其他表達質粒和病毒載體等），同時利用大腸桿菌表達菌株E.coli BL21 (DE3)(菌株購自TransGen Biotech公司）誘導重組蛋白，測定重組蛋白活性及其對BL21生 長速率的影響，具體方法如下：
[0038] 〈1>含HbCS3基因編碼區(qū)重組載體的獲得
[0039] 設計HbCS3基因編碼區(qū)引物（F:5，