過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的工程菌及構(gòu)建的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一株過表達(dá)尿苷二磷酸 葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(110?-8111(3〇86。5^(^11〇8。11〇巧138 6，1]6?38 6)在植 物、動物和細(xì)菌中廣泛分布，是一種與糖代謝密切相關(guān)的酶。它催化生成的尿苷二磷酸葡萄 糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，可作為葡萄糖基的供體，在細(xì)胞內(nèi)作為蔗糖、淀粉、纖 維素、半纖維素、果膠質(zhì)以及糖脂、糖蛋白、糖原、β-葡聚糖等多種碳水化合物的前體。已有 研究表明尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)是多糖生物合成的關(guān)鍵酶基因 (Journal of Bacteriology ,176(9):2611-2618；Biochemical Journal,370(1):995-1001)〇
[0003] 微生物絮凝劑(Microbial flocculant，MBF)是微生物分泌的能夠使懸浮液中的 固體顆粒、菌體、細(xì)胞和膠狀物絮凝沉淀的大分子化合物，主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白 質(zhì)、纖維素和DNA等。微生物絮凝劑具有安全、高效、可生物降解和對環(huán)境無污染等優(yōu)勢，且 能產(chǎn)生絮凝劑的微生物種類多、生長快、易于采用工程手段而實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此微生物絮凝 劑的開發(fā)前景十分看好。目前，多糖生物絮凝劑已經(jīng)應(yīng)用于去除紡織印染廢水中的色素 (Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4): 179-186·)，還可以去除工業(yè)廢 水中的重金屬離子和其它懸浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2) :361-367·)〇 然而多糖絮凝劑產(chǎn)量低、成本較高，制約著它的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。目前，對于培養(yǎng)基、培養(yǎng) 條件、生長因子等外部因素影響多糖絮凝劑合成的報道已經(jīng)很多(Process Biochemistry, 2014,49(4:576_582;Colloids and Surfaces 13:13;[0;[11七6『1^068,2014，116:257-264)。而 從地衣芽孢桿菌的遺傳及生理學(xué)角度對其多糖絮凝劑合成量影響的報道甚是少見。由于多 糖絮凝劑結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且大多數(shù)針對多糖的研究并不關(guān)注絮凝活性，所以有關(guān)多糖絮凝劑代 謝途徑的研究還較少，而通過分子生物學(xué)技術(shù)改造菌株提高多糖絮凝劑產(chǎn)量的報道幾乎沒 有。因此通過基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)優(yōu)良菌株，進(jìn)一步提高多糖絮凝劑活性及產(chǎn)量，具有重 要的經(jīng)濟(jì)價值及社會意義。
[0004] 本申請人在中國專利CN101503709中公開利用地衣芽孢桿菌制備生物絮凝劑的方 法，其中，微生物地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.2876。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中多糖絮凝劑絮凝活性不高、調(diào)控機(jī)理不明等問 題，提供一株過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)的地衣芽孢桿菌基因工程菌 及其構(gòu)建方法。
[0006] 所述過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)是編碼尿苷二磷酸葡萄糖 焦磷酸化酶的基因。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化生成的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是 葡萄糖的主要活化形式，也是合成多糖絮凝劑的必需前體，基于以上理論分析，過表達(dá)gtaB 基因，能夠增大多糖絮凝劑合成途徑的代謝流量，有利于提高多糖絮凝劑的產(chǎn)量，降低成 本。
[0007] 利用PCR擴(kuò)增克隆多糖絮凝劑合成途徑的關(guān)鍵酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基 因 gtaB。
[0008] 所述過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No:l所示。
[0009] 所述過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)的地衣芽孢桿菌基因工程 菌的制備方法如下：
[0010]將過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)片段連接到表達(dá)載體上，然后 利用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)中，通過抗性篩選獲得 目的基因的工程菌，即過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（gtaB)的地衣芽孢桿菌基 因工程菌。
[0011 ] 所述地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.2876(參 見本申請人的在先專利CN101503709)。
[0012] 所述表達(dá)載體為游離載體，優(yōu)選的所述表達(dá)載體為本實驗室構(gòu)建的表達(dá)載體 PHY300PLK-PamyL-TTamyL。所述表達(dá)載體的啟動子為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)a-淀粉酶基因的啟動子PamyL。
[0013] 所述過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu) 建方法，包括以下步驟：
[0014] (1)設(shè)計PCR引物擴(kuò)增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因 gtaB;
[0015] (2)將擴(kuò)增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL組成型啟動子PamyL 下游多克隆位點，得到PHY300-gtaB過表達(dá)質(zhì)粒；
[0016] (3)然后將PHY300_gtaB過表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到E.coli DH5a中，以備擴(kuò)增后電轉(zhuǎn)化；
[0017] (4)將經(jīng)提取、濃縮后的PHY300_gtaB過表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌，37°C復(fù)蘇 5h后，涂布四環(huán)素抗性平板，再在37 °C培養(yǎng)12h，篩選轉(zhuǎn)化子；
[0018] (5)轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒提取后，利用PCR和雙酶切進(jìn)行驗證，從而獲得過表達(dá)尿苷二磷 酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌重組菌HN301-2。
[0019] 所述過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的地衣芽孢桿菌可在制備多糖絮 凝劑中應(yīng)用，所述多糖絮凝劑的制備方法包括以下步驟：
[0020] (1)刮一環(huán)地衣芽孢桿菌重組菌HN301-2接種于液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得種子培 養(yǎng)液；
[0021] (2)按體積百分比以4%的接種量接種于多糖絮凝劑發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得發(fā)酵 液；
[0022] (3)將發(fā)酵液離心收集上清液，再用乙醇提取，所得提取液冷凍真空干燥后即得多 糖絮凝劑。
[0023] 在步驟(1)中，所述培養(yǎng)的條件可為:35~37°C，200r/min培養(yǎng)12~16h。
[0024] 在步驟(2)中，所述培養(yǎng)的條件可為:在30~40°C，150~300r/min條件下培養(yǎng)50~ 60h，優(yōu)選在37°C，200r/min的條件下培養(yǎng)48~56h。
[0025] 在步驟(3)中，所述乙醇與上清液的體積比可為3:1;所述提取的條件可為:離心的 速度為6000~8000rpm，離心的時間為10~15min，離心的溫度為4°C。
[0026] 本發(fā)明的技術(shù)效果在于:本發(fā)明提供了能提高多糖絮凝劑產(chǎn)量的的基因工程菌的 構(gòu)建方法。該方法包括以下過程:克隆多糖絮凝劑合成途徑的關(guān)鍵酶尿苷二磷酸葡萄糖焦 磷酸化酶基因（gtaB)，利用大腸桿菌一芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒構(gòu)建重組表達(dá)載體_。通過電轉(zhuǎn)化 的方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到地衣芽孢桿菌，通過四環(huán)素篩選轉(zhuǎn)化子，然后通過PCR和雙酶切對 對基因工程菌進(jìn)行驗證(如圖1)，從而構(gòu)建了地衣芽孢桿菌重組菌HN301-2,本發(fā)明構(gòu)建的 地衣芽孢桿菌重組菌HN301-2比出發(fā)菌株的多糖絮凝劑產(chǎn)量提高了 15.6%，發(fā)酵液絮凝活 性提高了70% (如圖2)。可望用于多糖絮凝劑的工業(yè)化生產(chǎn)，提高產(chǎn)量，降低成本。
【附圖說明】
[0027]圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒PHY300_gtaB的PCR和雙酶切驗證結(jié)果圖，其中泳道1:重組質(zhì) 粒PHY300-gtaB，泳道2:Kpn I單酶切重組質(zhì)粒PHY300-gtaB，泳道3:Kpn I和Spe I雙酶切重 組質(zhì)粒 PHY300-gtaB，泳道 4: PCR 擴(kuò)增 gtaB。
[0028] 圖2為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)及其重組菌HN301-2多糖絮凝劑 絮凝活性和產(chǎn)量比較圖。
【具體實施方式】
[0029]根據(jù)下述實施例，可以更好理解本發(fā)明。然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例 所描述的內(nèi)容僅限于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā) 明。
[0030] 實施例1:重組表達(dá)載體PHY300-gtaB的構(gòu)建
[0031]設(shè)計PCR引物，用于擴(kuò)增gtaB基因片段。
[0032]上下游引物分別為：
[0033] 上游引物:TTGGTACCATGAAAAAAGTAAGAAAAG(下劃線為Κρη頂每切位點）
[0034] 下游引物:GGACTAGTTTATATTTCTTCTTTATTTAAAAGA(下劃線為 Spe 頂每切位點）
[0035] 以Bacillus licheniformis CGMCC 2876基因組DNA為模板，進(jìn)行如下PCR程序： (1)94°C，5min; (2)94°C，30s; (3)5