一種牙鲆原始生殖細(xì)胞dead end基因及其的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及牙鮮Dead end序列，具體的說(shuō)是一種牙鮮原始生殖細(xì)胞dead end基因 及其的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]牙鲆，俗稱(chēng)牙片，為鲆鰈魚(yú)類(lèi)，錄屬于鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬，是我國(guó)和日韓等國(guó) 的重要海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。牙鲆的快速生長(zhǎng)能夠提高養(yǎng)殖效率，并減少長(zhǎng)時(shí)間養(yǎng)殖過(guò)程中的各 種風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)遺傳育種技術(shù)獲得快速生長(zhǎng)的品系需要較長(zhǎng)的時(shí)間。如何利用小分子物質(zhì)促 進(jìn)其生長(zhǎng)未見(jiàn)報(bào)道。
[0003] Dead end(Dnd)是脊椎動(dòng)物特有的生殖質(zhì)成分，是原始生殖細(xì)胞(PGCs)及性腺生 殖細(xì)胞的標(biāo)記基因，其參與了PGCs的發(fā)生、發(fā)育、迀移、存活等功能，對(duì)PGCs的發(fā)育及其脊椎 動(dòng)物的配子生成至關(guān)重要。它編碼RNA結(jié)合蛋白，該蛋白含有6個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)C端結(jié) 構(gòu)域，一個(gè)RRM(RNA Recognize Motif),四個(gè)N端結(jié)構(gòu)域。至今為止尚未見(jiàn)其對(duì)生長(zhǎng)的影響 的報(bào)道。
[0004] RNA干擾技術(shù)是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種阻抑基因表達(dá)的方法，可以特異性剔除 或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能以及表達(dá)調(diào)控等方面。該技術(shù) 通過(guò)人為地引入與靶基因具有同源序列的dsRNA，宿主細(xì)胞對(duì)這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其 胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(大約21 ~23bp)，即siRNA，最終誘導(dǎo)靶基因的mRNA降解，從而達(dá)到阻抑基因的表達(dá)，進(jìn)而出現(xiàn)基因 的功能缺失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明在于提供一種牙鮮原始生殖細(xì)胞dead end基因及其的應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] 一種牙鮮原始生殖細(xì)胞dead end基因，牙鮮Dead end基因?yàn)镾EQ ID No. 1中所示。
[0008] 一種基于牙鮮原始生殖細(xì)胞dead end基因的siRNA，所述基于牙鮮Dead end基因 的siRNA為20-50bp的siRNA。
[0009] 所述siRNA的Sense(5 '-3 '）序列為：CCACCUGAGGGUUCUGCGUG;Antisense(5 '-3 '）序 列為:CACGCAGAACCCUCAGGUGG;
[0010] 或，以上述siRNA序列為核心序列在5'端和/或3'添加不同堿基或者其它核苷酸類(lèi) 似物等獲得。
[0011] 一種基于牙鮮原始生殖細(xì)胞dead end基因的革E1基因應(yīng)用，所述根據(jù)SEQ ID No. 1 中所示的核苷酸序列的20_50bp siRNA靶基因在促生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0012] 所述根據(jù)SEQ ID No.l中所示的核苷酸序列的20-50bp siRNA祀基因在魚(yú)類(lèi)中促 生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0013] 所述魚(yú)類(lèi)為牙鲆。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 本發(fā)明是首次在牙鲆中發(fā)現(xiàn)Dead end(Dnd)的序列，并證實(shí)以該序列為靶基因合 成的siRNA有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，因而該序列及相關(guān)的siRNA在魚(yú)類(lèi)包括海水魚(yú)類(lèi)促進(jìn)生長(zhǎng)的 應(yīng)用中具有極大的價(jià)值，這為魚(yú)類(lèi)包括海水魚(yú)類(lèi)促生長(zhǎng)相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)技術(shù)保證。
[0016] 同時(shí)，本發(fā)明基因序列為牙鲆特有的序列，可以促進(jìn)牙鲆等海水魚(yú)生長(zhǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的靶基因 s iRNA抑制目的基因表達(dá)圖，其中，Μ，DNA標(biāo)準(zhǔn)； Ρ1-Ρ9，25bp的SiRNA注射組;B，PCR空白對(duì)照;C1-4，對(duì)照SiRNA注射組。
[0018] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的靶基因 siRNA促進(jìn)生長(zhǎng)的分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例詳述本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟。
[0020] 本發(fā)明在牙鲆中獲得Dead end(Dnd)的序列如SEQ ID No.l中所示。以所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列為靶序列合成siRNA促進(jìn)牙鲆生長(zhǎng)的應(yīng)用。本發(fā)明基因序列為牙 鲆特有的序列，可以促進(jìn)牙鲆生長(zhǎng)。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 1.RNA 提取
[0023] 牙鮮性腺的總RNA提取采用Trizol (Invitrogen)提取，具體步驟如下：取大約 0 · lmg牙鮮性腺，加入0 · lmL Trizol，充分混勾，然后加入Trizol 0 · 9mL，室溫放置5min。加 入氯仿〇. 2mL，劇烈振蕩15s，室溫放置3111；[11。12000 Xg，4°C，離心15min，離心后將離心管小 心取出。取上清到新的離心管中，加入等體積異丙醇，混勾，室溫放置l0min，12000 Xg，4°C， 離心10min。去掉異丙醇，加入預(yù)冷的75%乙醇lmL洗滌沉淀，7500 Xg，4°C，離心5min。去掉 乙醇，置于超凈臺(tái)中使乙醇揮發(fā)。加入水(無(wú) RNA酶)30yL，55-60 °C水浴1 Omin使RNA溶解，取 出后置于冰上。加入lyL DNase(無(wú) RNA酶），37°C水浴15min，消化DNA以去除DNA的殘余。取出 后置于冰上，1此電泳檢測(cè)質(zhì)量及完整度，測(cè)吸光度檢測(cè)濃度及質(zhì)量。直接用于余下實(shí)驗(yàn)，或 者液氮速凍，-80 °C保存 [0024] 2.CDNA合成及檢測(cè)
[0025] 取上述獲得性腺總RNA 2ug及l(fā)ul oligo d(T)加入滅過(guò)菌的PCR(無(wú) RNA酶）中，放 入PCR儀70°C，5分鐘，取出立即置于冰上，加入5.0yL 5X反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，5.0yL dNTP Mix (10mM)，1.0yL RNase抑制劑（RNase InhibitoiOHOU/yLhI.OyL m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶，并用水 (無(wú) RNA酶)補(bǔ)至25ul，輕輕混勻，42 °C溫育60min。
[0026] 用牙鲆β-actin基因作內(nèi)參PCR檢測(cè)cDNA，PCR所用引物如下：5'端引物5'_ ACTACCTCATGAAGATCCTG-3 '，3 ' 端引物5 ' -TTGCTGATCCACATCTGCTG-3 '
[0027] PCR混合物體系如下：

[0029] PCR按照如下程序進(jìn)行：94°C 5min;94°C 30s，55°C 30s，72°C 30min，反應(yīng)30個(gè)循 環(huán);72°C lOmin，4°C+〇〇 ;反應(yīng)結(jié)束后取出5yL在1.0 %的瓊脂糖電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物中為 500bp左右的片段。
[0030] 3.Dnd 的獲得。
[0031 ] PCR所用引物如下：（1) 5 ' 端引物5 ' -CACCTGAGGGTTCTG- 3 '，3 ' 端引物5 ' -TACAACAACCAGTGATCCGAGTG-3，
[0032] PCR混合物體系如下： 「nnWI
L〇〇34j PCR按照如卜程序進(jìn)仃：94UC 5min;94uC 30s，55uC 30s，72uC lmin，反應(yīng)45個(gè)循 環(huán);72 °C lOmin，4°C 〇〇 ;反應(yīng)結(jié)束后取出5yL在1.0 %的瓊脂糖電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物中含 700左右的片段，然后將剩下的產(chǎn)物(約45μυ通過(guò)膠回收的方法回收其適當(dāng)?shù)钠巍?br>[0035] PCR產(chǎn)物的回收采用膠回收試劑盒(康為公司）進(jìn)行，具體方法如下：制備大孔的瓊 脂糖凝膠，將回收用PCR反應(yīng)液加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，100V電壓恒壓電泳，使電泳條帶分離效果達(dá) 到最佳為止。在紫外燈下切下目的片段所在瓊脂糖塊放入1.5mL離心管中。按每lOOmg瓊脂 糖加300yL S1液的比例加入S1液，置50°C水浴lOmin，使瓊脂糖塊完全溶化。每2min顛倒混 勻一次。將瓊脂糖溶化后的溶液移入吸附柱，離心30s。倒掉收集管中液體，再將吸附柱放入 收集管。
[0036]在吸附柱中加入500yL W1液，離心15s。倒掉收集管中液體，將吸附柱放入收集管。 在吸附柱中加入500yL W1液，靜置lmin后，離心15s。倒掉收集管中液體，將吸附柱放入收集 管。離心lmin。將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mL的離心管中，在吸附膜中央加入20uL EB液， 37 °C 5min后，離心lmin，取3yL回收溶液電泳檢測(cè)回收